骨骺干细胞复合壳聚糖/纳米羟基磷灰石支架体外培养的实验研究

目的 探讨免疫磁珠分选的骨骺干细胞(PSCs)经诱导后向软骨细胞方向分化的性能,及其与壳聚糖/纳米羟基磷灰石(CS/nHA)支架材料复合培养构建组织工程化软骨的可行性.方法 用显微手术器械剪取新生24 h内的清洁级SD大鼠股骨下端骺板两端的La Croix环处组织,应用免疫磁珠分选系统分离纯化PSCs,免疫荧光染色观察PSCs成纤维细胞生长因子受体-3(FGFR-3)的表达情况.体外培养并诱导PSCs向软骨细胞特性方向分化,免疫细胞化学、甲苯胺兰及番红O染色检测诱导后细胞Ⅱ型胶原及软骨基质的表达情况.以诱导后接种于CS/nHA支架培养的PSCs为实验组,以诱导后未接种支架的细胞为对照组.扫描电镜观察细胞的黏附及形态学改变,MTT法检测细胞增殖情况,阿辛蓝法测定细胞合成的糖胺多糖(GAG)情况.对两组间不同培养时间的吸光度值及GAG进行比较.结果 免疫磁珠分选的PSCs体外培养增殖迅速,免疫荧光染色显示FGFR-3阳性表达.诱导后的PSCsⅡ型胶原免疫细胞化学染色、甲苯胺兰染色及番红O染色均旱阳性.细胞接种CS/nHA支架后1、4 d,实验组与对照组吸光度值比较差异无统计学意义(P>0.05),而7 d实验组与对照组吸光度值比较筹异有统计学意义(t=-2.786,P=0.024).培养14 d后培养液GAG含量为(89.66±6.52)μg/106个细胞,高于对照组[(78.62±4.63)μg/106个细胞)],差异有统计学意义(t=-3.084,P<0.05).结论 免疫磁珠分选的PSCs经诱导后可向软骨细胞功能方向分化,诱导后的PSCs与CS/nHA分层支架复合有望构建组织工程化软骨.     

TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导兔脂肪基质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

[目的]分离培养兔脂肪基质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),观察在TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导下其生物学特性及向软骨细胞定向分化的能力.[方法]取4个月龄新西兰大白兔颈背部脂肪组织,分离、培养ADSCs.选取第3代,分为两组,实验组用软骨诱导液(含TGF-β1、bFGF、IGF)对细胞进行培养,对照组用普通高糖培养液培养,倒置显微镜观察两组细胞形态,MTT测定其增殖情况;14 d后行组织学观察(包括甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化),并实时荧光定量PCR检测两组细胞Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9基因的表达情况.[结果]实验组细胞逐渐变为软骨样细胞形态,增殖速度明显加快,14 d后实验组甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化阳性,对照组为阴性,荧光定量PCR结果显示实验组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9的基因转录水平明显高于对照组.[结论]在TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导条件下ADSCs增殖迅速,可高表达Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9,向软骨细胞定向分化.     

医用多孔钽材料对大鼠软骨细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响

[目的]观察国产多孔钽材料对大鼠软骨细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响,为其作为软骨组织工程支架材料临床应用提供实验依据。[方法]选用3周龄SD大鼠双侧股骨头、膝关节分离软骨组织,经Ⅱ型胶原酶消化,饱和湿度培养,传代。倒置显微镜下逐日观察细胞生长状态。待第2代细胞生长至80%左右时,通过甲苯胺蓝染色、番红O-固绿染色以及Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色进行软骨细胞鉴定。以F12-DMEM为浸提介质分别制备100%、50%、25%多孔钽浸提液,软骨细胞加不同浓度多孔钽浸提液作为实验组,未加浸提液的软骨细胞作为对照组;MTT法检测多孔钽浸提液对软骨细胞增殖的影响及细胞毒性检测。将第2代软骨细胞接种到多孔钽支架上进行体外三维培养,而对照组是将软骨细胞接种到无支架的培养板上,倒置相差显微镜观察两组软骨细胞生长状态;胰酶消化复合于材料上的软骨细胞,流式细胞仪检测软骨细胞的细胞周期变化及细胞凋亡。[结果]软骨细胞接种初期大小不等,呈圆形悬浮于培养液中,24 h后贴壁细胞伸展呈三角形、多角形等。第7⁹ d待细胞生长呈现融合时即可传代。甲苯胺蓝染色显示软骨细胞胞浆内可见蓝紫色颗粒,番红O-固绿染色显示胞浆呈绿色、细胞核呈紫红色,Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色显示阳性信号位于胞浆及部分胞膜,以上方法证实了分离培养的细胞为软骨细胞;MTT法检测显示随着培养时间的延长,各浓度浸提液组细胞生长与对照组无明显差异,软骨细胞形态正常,贴壁增殖良好,相同时间点不同浓度的浸提液与对照组间细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05),提示软骨细胞在多孔钽浸提液中生长、增殖状态良好且多孔钽材料无毒性。多孔钽支架材料外观灰色光亮,表面及断面可见分布均匀的蜂窝状孔隙,孔径针尖大,支架材料不透光,将分离培养的第2代软骨细胞接种到多孔钽支架上后,复合培养24 h后,倒置相差显微镜可见材料边缘有少量软骨细胞黏附,细胞呈多角形;随着培养时间增加,材料边缘及培养板底部细胞黏附的数量逐渐增多,边缘软骨细胞生长良好;流式细胞仪检测显示实验组与对照组细胞均为正常二倍体细胞,两组细胞周期分布相似,实验组及对照组的细胞凋亡率及坏死细胞率差异均无统计学意义(P>0.05)。[结论]国产多孔钽材料无毒性,对软骨细胞增殖、细胞周期及凋亡无明显影响,适合作为软骨组织工程支架材料。     

慢病毒介导TGF-β1基因诱导大鼠骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化

[目的]探讨慢病毒介导转化生长因子β1(tansforming growth factor bata 1,TGF-β1)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导成软骨细胞分化的作用。[方法]密度梯度离心法分离培养BMSCs,探索病毒感染最佳条件,取第3代细胞,分为实验组和对照组,通过慢病毒载体将外源性TGF-β1基因转染入细胞,观察绿色荧光表达情况,Real-time PCR法和western blot法检测TGF-β1基因的mRNA和蛋白表达情况,7、14 d时行Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色和Real-time PCR检测Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖的表达。[结果]TGF-β1基因转染BMSCs后能够稳定表达。转染7、14 d时,实验组免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色均为阳性。转染7、14 d时,实验组II型胶原mRNA均显著高于对照组(P<0.01)。转染7 d时,实验组聚集蛋白聚糖mRNA变化不明显,而14 d时显著高于对照组(P<0.01)。[结论]慢病毒介导的TGF-β1基因可成功转染大鼠BMSCs,并诱导其向软骨细胞分化。在此过程中软骨特异性标志Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的mRNA表达具有时间差异性。     

CD105+滑膜间充质干细胞成软骨能力

目的 分选CD105+滑膜间充质干细胞(SMSCs),观察其增殖和向软骨细胞分化的能力.方法 酶消化滑膜组织分离SMSCs,流式细胞仪分选CD105+ SMSCs;第3、7天采用WST-1测定SMSCs的增殖能力;软骨诱导21 d进行免疫组织化学染色,检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原.结果 酶消化获取的SMSCs为星形或梭形,分选后SMSCs形态无明显变化.免疫荧光显示分选组CD105+细胞较未分选组明显增多.WST-1增殖检测提示两组细胞吸光度值3 d(0.376±0.012、0.329±0.012)、7 d(0.581±0.009、0.524±0.007)比较差异有统计学意义(P＜0.05).成软骨诱导培养21 d后,分选组甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原染色均较未分选组多且深,说明CD105+ SMSCs合成更多软骨细胞外基质.结论 CD105+ SMSCs具有较强的增殖和成软骨能力,CD105+ SMSCs可成为软骨组织工程良好的种子细胞.     

细胞共培养法诱导兔脂肪来源干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的利用软骨细胞与脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)共培养,观察ADSCs是否能向软骨细胞定向分化。方法 4月龄健康新西兰大白兔8只,雌雄不限,体重2.2～2.7 kg,分离、培养兔软骨细胞和ADSCs,取第2代细胞用于实验。将实验分为两组,实验组各取将1 mL细胞密度为2×104个/mL的软骨细胞和ADSCs分别接种至Transwell小室6孔板上、下层共同培养,对照组单独培养ADSCs。倒置相差显微镜观察两组ADSCs形态变化;培养14 d后行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,实时荧光定量PCR检测两组ADSCsⅡ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA表达。结果倒置相差显微镜观察示,随培养时间延长,实验组ADSCs逐渐变为软骨样细胞形态,呈圆形;对照组ADSCs仍以梭形为主,呈束状或漩涡状生长。培养14 d,实验组甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均为阳性;对照组均为阴性;实时荧光定量PCR检测示,实验组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA相对表达量分别为1.43±0.07、2.13±0.08、1.08±0.08,显著高于对照组(0.04±0.03、0.13±0.04、0.10±0.02),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论通过与软骨细胞共同培养,ADSCs可定向分化为软骨细胞。     

兔关节软骨块和骨髓间充质干细胞共培养

[目的]探讨与兔关节软骨块共培养对兔骨髓间充质干细胞(RBMSCs)分化的影响。[方法]全骨髓贴壁培养法分离培养RBMSCs,对P3代细胞进行氯甲基苯甲酰氨荧光染料(CM)标记。用4周龄雄性新西兰大白兔股骨头关节面制备软骨块。分为3组,分别为单纯细胞组、细胞+软骨组和单纯软骨组,于第7、14、21 d细胞爬片,行甲苯胺蓝染色法检测和II型胶原免疫组化染色。[结果]经过3周培养,单纯细胞组细胞仍保持骨髓间充质干细胞的特点;细胞+软骨组RBMSCs与兔关节软骨块混合共培养后,RBMSCs细胞形态由长梭形逐渐变为短小的三角形或不规则形,表现出典型的"铺路石"样改变;甲苯胺蓝染色阳性和II型胶原免疫组化阳性,符合软骨细胞特点;单纯软骨组软骨块在培养液中成活,无细胞生长。[结论]兔关节软骨块所营造的微环境能够促进RBMSCs向软骨细胞方向分化,此种RBMSCs能够在兔关节软骨块表面贴附生长。     

脱细胞软骨细胞外基质取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的实验研究北大核心CSCD

目的探讨脱细胞软骨细胞外基质(acellular cartilage extracellular matrix,ACECM)取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的可行性。方法取市售猪关节软骨组织,分离培养关节软骨细胞并传代。取第3代软骨细胞行PKH26荧光标记,MTT检测标记对细胞增殖无影响后,分别取标记及未标记的软骨细胞复合ACECM取向支架并体外培养后,大体观察支架形态,倒置显微镜、荧光显微镜观察软骨细胞在支架中的黏附、生长和分布情况,扫描电镜观察支架中细胞形态,Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察软骨细胞外基质分泌情况。将PKH26标记的软骨细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下腔隙,术后观察裸鼠一般情况,4周后分子荧光活体成像系统无创伤性评估细胞-支架复合物生长情况,取材行大体观察以及番红O、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,评价形成软骨组织的能力。结果细胞-支架复合物体外培养7 d,大体观察呈半透明并具有一定硬度;倒置显微镜和荧光显微镜观察软骨细胞在支架上能良好黏附生长,并沿支架管道方向生长,分泌Ⅱ型胶原。细胞-支架复合物植入裸鼠皮下后,分子荧光活体成像系统观察示细胞均存活;术后4周,大体观察见复合物呈类软骨样组织,组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示细胞周围软骨细胞外基质分泌,可见"陷窝"样结构形成。结论 ACECM取向支架有利于软骨细胞的黏附、增殖及取向性分布类似于正常软骨结构,并在裸鼠皮下成功异位构建组织工程软骨。     

关节软骨源性多孔支架复合自体软骨细胞修复兔关节软骨缺损的长期疗效观察

[目的]对关节软骨源性多孔支架复合自体软骨细胞复合体修复兔膝关节软骨缺损的长期效果进行观察和评价。[方法]实验动物新西兰大白兔共10只,分两组:(1)关节软骨源性支架对照组:缺损内置入关节软骨源性支架;(2)关节软骨源性支架复合细胞组:缺损内置入关节软骨源性支架-自体软骨细胞复合体。手术后15个月取材做大体摄像,甲醛固定、10%EDTA脱钙,石蜡切片,采用四种组织化学染色法(HE、奥新兰(AB)、甲苯胺兰(TO)、藩红花"O"染色)和Ⅱ型胶原免疫组化染色,观察修复后的兔关节软骨组织细胞形态特征。[结果]关节软骨源性支架对照组,大体观察关节表面有凹陷。石蜡切片HE染色见未修复缺损处为梭形细胞,纤维软骨,缺损处AB、甲苯胺兰、藩红花"O"染色为阴性,Ⅱ型胶原染色为阳性;关节软骨源性支架复合细胞组,大体见关节软骨表面修复平整、光滑。常规HE染色镜下见软骨全层修复良好,为透明软骨细胞,可见软骨陷窝潮线排列结构。细胞外基质特染:AB、甲苯胺兰、藩红花"O",Ⅱ型胶原特种染色均为阳性。[结论]组织学观察结果发现,关节软骨源性支架组为纤维软骨组织结构,未能完全修复膝关节软骨缺损;而关节软骨源性支架复合细胞组关节软骨缺损修复良好,未见退变,具有软骨组织的特征。     

动物源性骨软骨支架修复兔膝关节复合缺损

目的探讨软骨细胞-动物源性骨软骨支架复合体修复兔膝关节骨软骨复合缺损的可行性和影响因素。方法将改良贴壁离心法获取的骨髓间充质干细胞（bone marrowm esenchymal stem cells,BMSCs）/诱导分化的软骨细胞共培养后与经深低温冷冻、脱脂、脱钙、真空冷冻干燥和辐照消毒的动物源性骨软骨支架复合,构建共培养细胞＋软骨-骨一体化复合支架。27只新西兰大白兔随机分为实验组（A组）、对照组（B组）和空白组（C组）,每组9只。于兔股骨髁间窝处钻一深6mm的骨软骨复合缺损,A组植入共培养细胞＋骨软骨复合支架,B组植入骨软骨复合支架,C组不植入任何支架材料和细胞,分别于术后4周、8周和12周取材,行大体观察、苏木精—伊红染色和甲苯胺蓝染色,并对各标本的软骨切片进行组织学评分。结果随着时间的延长,A组大体观察见复合缺损区已完全修复,局部无凹陷,新生组织和周围组织融合;B组新生组织仍不能完全填充缺损;C组缺损区仍明显。苏木精—伊红染色和甲苯胺蓝染色见A组软骨缺损区由新生的透明软骨样组织修复,细胞呈柱状排列,极性好,软骨陷窝明显,骨缺损区由骨样组织修复,新生软骨和软骨下骨以及宿主骨界面耦合良好;B组新生软骨细胞无软骨陷窝,排列混乱,各界面藕合欠理想;C组可见陈旧性肉芽组织生长并突出于缺损区表面。甲苯胺蓝染色阳性率和组织学评分结果表明,A组与B、C两组之间的差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论 BMSCs/诱导分化的软骨细胞共培养细胞复合动物源性骨软骨支架对兔膝关节软骨和软骨下骨的复合缺损具有修复作用。