常见致病菌23S rRNA基因片段序列分析及其应用初探

目的通过临床常见致病菌23S rRNA基因序列差异的分析，探索建立可同时检测或鉴定多种细菌的分子生物学方法。方法对常见致病菌23S rRNA基因的一个多变区序列进行聚合酶链反应（PCR）扩增和测序分析，根据序列差异设计相应引物和探针，并采用PCR-凝胶电泳分析和PCR-反向杂交技术检测或鉴定临床常见致病菌。结果1.革兰阳性菌和革兰阴性菌间的23S rRNA基因序列存在较大差异，通过PCR扩增和凝胶电泳分析能快速区分待测菌株为革兰阳性菌抑或革兰阴性菌。2.不同菌种间亦存在一定差异，可通过PCR-反向杂交技术将细菌鉴定到种。结论.临床常见致病菌的23S rRNA基因之间存在可供细菌鉴定的序列差异，据此可望建立各种具有快速，灵敏，准确特点的分子生物学方法，为细菌感染的快速病原诊断提供客观依据。     

建立16S rRNA基因聚合酶链反应方法快速检测脑膜炎奈瑟菌

目的建立以16S rRNA基因为靶基因的聚合酶链反应(PCR)方法,用于快速检测脑膜炎奈瑟菌。方法根据GenBank公布的奈瑟菌属16S rRNA基因序列,使用DNAstar软件设计引物,应用PCR方法特异检测脑膜炎奈瑟菌,对部分菌株结合16S rRNA基因测序和APIRNH生化鉴定系统以验证该方法的准确性,同时与文献报道的检测脑膜炎奈瑟菌crgA-PCR方法进行比较。结果 16S rRNA-PCR与crgA-PCR方法检测脑膜炎奈瑟菌阳性预测值皆为100%,阴性预测值分别为100%和46.94%,假阳性率分别为0%和36.73%,假阴性率皆为0%。约登指数分别为1和0.47。对188名健康儿童咽拭子杂菌DNA应用16S rRNA-PCR和crgA-PCR方法检测脑膜炎奈瑟菌,检测阳性率分别为18.62%(35/188)和15.96%(30/188)。两者同时检测到脑膜炎奈瑟菌的标本为7.98%(15/188)。结论 16SrRNA-PCR方法特异、敏感、快速,可用于脑膜炎奈瑟菌的快速检测与鉴定。     

分支杆菌临床分离株的16S-23S rRNA基因转录间隔区的序列分析

目的　建立鉴定分支杆菌分离株的 16S - 2 3SrDNA转录间隔区 (internaltranscribedspacer ,ITS)序列分析的方法 ,用该方法对临床分离株进行鉴定。方法　对从重庆某医院分离的 2 9株分支杆菌菌株分别进行了PCR扩增 ,得到它们的16S - 2 3SrDNAITS片段 ,并测定所得到片段的DNA序列。用DNA分析软件将所获得的序列与GenBank的分支杆菌序列相比较 ,计算种间相似性 ,并用序列构建分支杆菌菌株的系统发育树 ,对分离株进行鉴定。结果　在ITS序列分析中 ,有 10株的序列分别与结核分支杆菌复合群 (Mycobacteriumtuberculosiscomplex ,MTC)、戈登分支杆菌 ,脓肿分支杆菌的序列完全一致。依据完全一致的序列可以准确鉴定这些临床分离株为相应的种 ;4株 16SrDNA序列分析不能准确鉴定的分离株中其中 3株(M 4、M 5、M 12 )鉴定为戈登分支杆菌 ,1株 (M 2 3)鉴定为脓肿分支杆菌。部分分离株的的ITS序列在GenBank序列检索中无完全一致的匹配序列 ,这些不同的序列之间的相似程度为 2 7.1%～ 99.2 %。用临床分离株的ITS序列与其最相似的已知分支杆菌的ITS序列构建的系统发育树 ,菌株分群与 16SrDNA序列构建的系统发育树的分群基本一致。结论　分支杆菌的16S - 2 3SrDNAITS序列比 16SrDNA序列有更大的多样性 ,该序列分析可作为     

应用16S-23S rRNA基因区间对败血症常见菌的鉴定

目的：建立检测不同菌种细菌的16S－23S rNA基因区间的特异图谱。方法：应用聚合酶链反应（PCR），限制性内切酶片段长度多态性分析（RFLP），分子克隆及测序技术，对临床常见的代表20个属26个种的标准菌株及相应的临床分离菌株共61株进行PCR扩增，同时对临床标本进行培养并与PCR－RFLP比较，探讨其在临床应用中的价值。结果：26株不同的标准菌株行PCR扩增后，分别出现1条带，2条带，3条带及多条带的不同DNA图谱，其敏感性为2．5CFU，与人类基因组DNA，真菌及病毒无交叉反应，其中14种菌经PCR扩增即可区分，另10种经Hinf I或AluI酶切后才能区分，肺炎克雷伯菌与坚韧肠球菌间的差异在第779位碱基上不同，Xma Ⅲ酶能进行区别，临床42例血培养15例阳性，阳性率35．7％；而PCR阳性27例，阳性率达64．3％，其阳性率明显高于血培养（P＜0．01），6例脑脊液标本中1例培养为表皮葡萄球菌，其PCR也阳性，2例培养阴性标本，其PCR也阳性，经图谱分析为葡萄球菌，1例培养为新型隐球菌的脑脊液标本PCR检测为阴性，另2例PCR及培养均阴性。结论：建立了PCR加RFLP技术快速检测细菌16S－23S rRNA基因区间的方法，进一步为临床细菌感染的病原诊断提供了新的科学依据。     

常见分枝杆菌不同株16S-23S rRNA转录间隔区序列分析

目的 分析常见分枝杆菌不同株之间的因型,为临床分离株的鉴定提供参考序列.方法 用16S-23S rRNA转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列分析法对94株由德国微生物和细胞保藏中心(DSMZ)引进的常见分枝杆菌进行种内不同株的基因型分析,并分别与12株国际标准株对比.通过种内不同株间同源性序列比对,绘制16S-23S rRNA ITS序列聚类分析树状谱,使用DNAStar的MegAlign软件计算株间相似性百分比.结果 成功完成上述共106株菌株的16S-23SrRNA ITS测序,发现除胞内分枝杆菌(4株)、鸟分枝杆菌(4株)、海分枝杆菌(6株)和马尔摩分枝杆菌(2株)各有一个基因型且与标准株相同外,其他分枝杆菌均可分为数个不同基因型.结论 16S-23S rRNA ITS序列分析可以根据种内各株的不同基因型将分枝杆菌鉴定到株,是分枝杆菌基因型分析的可靠方法.     

PCR法检测16S rRNA基因在败血症诊断中的价值

目的评价外周血细菌16S rRNA基因检测诊断败血症的敏感性及特异性。方法利用通用引物对6种常见细菌16S rRNA基因进行扩增，通过阳性菌株及阴性对照检测引物的特异性；观察不同退火温度及不同细菌浓度下PCR检测效果；检测败血症患者及正常人血液标本中的16S rRNA基因表达，并与血培养结果进行比较，评价其诊断意义。结果6种阳性菌株均出现特异阳性条带，阴性质控未出现阳性条带；不同退火温度对PCR结果无明显影响，以55、58℃最佳；PCR方法的最低细菌检测浓度为1．5×10^3cfu／ml；观察组血培养阳性率为38．3％（23／60），血液16S rRNA基因阳性表达率为86．6％（52／60），P〈0．01。结论PCR法检测16S rRNA基因用于败血症诊断特异性及敏感性强，但应注意规范操作、避免污染。     

16S-23S rDNA内转录间隔区序列寡核苷酸探针鉴定分支杆菌菌种的研究

目的研究以16S-23S rDNA内转录间隔区(intemal transcribed spacer,ITS)序列为靶基因设计分支杆菌菌种寡核苷酸探针,应用PCR-反向杂交技术快速鉴定分支杆菌菌种.方法应用PCR-反向杂交技术检测26种36株分支杆菌标准株,24株分支杆菌临床分离株.结果分支杆菌标准株和临床分离株经PCR扩增,依菌种不同可见一条约340bp～450bp范围DNA片段.探针特异性试验表明,21种寡核苷酸探针除草分支杆菌探针MPH与微黄分支杆菌亦杂交外,其余探针均为特异的.5株结核分支杆菌临床分离株鉴定为结核分支杆菌复合群,19株非结核分支杆菌临床分离株鉴定至种水平.结论 16S-23S rDNA ITS PCR-反向杂交鉴定分支杆菌菌种简便、快速、准确,具有较高应用价值.     

16S rRNA甲基化酶基因在鲍曼不动杆菌中的分布

目的调查国内6个省市25家医院临床分离鲍曼不动杆菌中介导高水平氨基糖苷类抗生素耐药的16SrRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB的分布情况。方法收集2004年12月-2005年12月国内6省市8家省级医院、浙江省11个地区17家市级医院临床分离的700株鲍曼不动杆菌。琼脂稀释法测定其对妥布霉素、阿米卡星、庆大霉素、异帕米星、奈替米星5种氨基糖苷类抗生素的最低抑菌浓度（MIC）值；PCR筛选三种甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB，克隆测序明确基因型；脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析菌株的同源性；质粒抽提、接合试验及Southern杂交确定armA基因定位。结果对妥布霉素、阿米卡星、庆大霉素、异帕米星、奈替米星的耐药率分别为67．7％、70．9％、75．7％、63．5％和71．5％。对5种氨基糖苷类抗生素全部耐药的菌株有377株，其中334株检出armA基因；未发现rmtA、rmtB阳性菌株。armA基因阳性菌株PFGE分型以A、B、C为主。碱裂解法反复抽提未得到质粒，多次接合试验未成功；Southern杂交显示，armA基因分别位于克隆A、B、c菌株染色体ApaⅠ酶切PFGE约220、300、220kb大小的PFGE片段上。结论16SrRNA甲基化酶基因armA在鲍曼不动杆菌中广泛存在，armA基因位于鲍曼不动杆菌的染色体上。     

16S rRNA基因芯片诊断新生儿败血症

目的建立16SrRNA基因加基因芯片检测新生儿败血症的诊断技术，以提高临床检测细菌的速度及准确性。方法对125例拟诊为败血症的新生儿血标本及部分脑脊液标本进行细菌16SrRNA基因及基因芯片检测．包括DNA提取、设计引物和探针、聚合酶链反应（PCR）扩增、基因芯片的制备、杂交、激光扫描与读片。结果125例中PCR检测血标本阳性64例，占51．2％；血培养阳性32例，占25．6％；非特异性指标41例，占32．8％，差异有统计学意义（P〈0．01）。若以血培养阳性和／或非特异指标至少两项阳性为诊断标准，PCR灵敏度为90．3％（56／62），特异度为87．3％（55／63），正确诊断指数为0．776。3例脑脊液标本中PCR阳性2例，培养阳性仅1例。对64例PCR阳性血标本进一步作基因芯片检测，结果通用探针均阳性。其中G^＋探针阳性60份。G探针阳性4份。30份PCR和血培养均阳性的标本中其探针菌株与血培养细菌阳性结果相符。2例脑脊液标本PCR阳性，基因芯片检测结果与培养结果相符。结论168 rRNA基因PCR加基因芯片杂交可为新生儿败血症提供早期、敏感的病原学诊断依据。     

分支杆菌临床分离株的16S rRNA基因序列分析

目的　建立分支杆菌的 16SrDNA序列分析的方法 ,采用该方法鉴定临床结核分支杆菌分离株。方法　用PCR从重庆某医院的肺部感染病人的痰标本中分得的 2 9株分支杆菌菌株中扩增 16SrRNA基因 (16SrDNA)的 5′端片段 (～5 0 0bp) ,并测定所得到片段的DNA序列。用DNA分析软件将所获得的序列与GenBank的分支杆菌序列相比较 ,计算种间相似性 ,并用序列构建分支杆菌菌株的系统发育树 ,对分离株进行分类与鉴定。结果　有 14株的 16SrDNA序列分别与已知结核分支杆菌复合群 (Mycobacteriatuberculosiscomplex ,MTC)、戈登分支杆菌、新金色分支杆菌、氯酚红分支杆菌、龟分支杆菌或脓肿分支杆菌的序列完全相同。依据完全一致的序列可以准确鉴定这些临床分离株为相应的种 ;部分分离株的 16SrDNA在GenBank序列检索中无完全一致的匹配序列。用临床分离株的 16SrDNA序列与已知的分支杆菌 16SrDNA序列构建的系统发育树 ,结果提示某些菌株可能是与已知分支杆菌密切相关的新种或是它们的亚种。结论　 16SrDNA序列分析鉴定分支杆菌是一种快速、可靠、成本较低的方法 ;重庆地区非结核分支杆菌感染的种类与其它地区的报告有明显不同     

肠球菌为主要菌群的腹泻标本的16S rRNA与PFGE分析

目的了解肠球菌为主要菌群的腹泻标本的微生态及分离肠球菌菌株的克隆特征。方法根据细菌16S rRNA保守区序列设计通用引物,以腹泻病人粪便标本中的总DNA为模板,PCR扩增16S rRNA片段。将获得的片段克隆入T载体进行测序,与数据库中发表的序列进行比对,判断标本中细菌的种类和比例,并对每份标本分离的各50株肠球菌选择20株进行PFGE分析。结果对4份标本的多次16S rRNA序列分析表明,该4份标本均以Enterococcus faecium为主(所占比例>68%),PFGE结果显示每个病人分离屎肠球菌菌株是克隆性的(一份标本除外)。结论从16S rRNA和PFGE的角度对腹泻粪便标本进行了分析,得到腹泻儿童肠球菌分布的基本特征,其致病性和相关机理还待今后实验范围的进一步扩大和研究的深入。     

福建华溪蟹线粒体DNA COI和16S rRNA基因序列的遗传多样性

目的 探讨福建华溪蟹(Sinopotamonfukienense)的遗传多样性.方法 采用PCR结合DNA测序技术,测定S.fukienense的线粒体COI和16S rRNA基因序列的组成.经比对获得639 bp长度的COI基因序列和526 bp的16S rRNA基因序列,以对比分析S.fukienense的遗传多样性.结果 S.fukienense基于COI基因核苷酸多样性(Pi)为0.048 4,高于其基于16S rRNA基因核苷酸多样性(Pi)为0.021 6.同时,S.fukienense基于COI基因单倍型间的平均遗传距离(P)为0.048,大于其基于16S rRNA基因单倍型间的平均遗传距离(P)0.026.结论 COI序列在分析S.fukienense遗传异变时的作用更优于16S rRNA基因序列.     

幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性与23S rRNA基因突变相关性分析

[目的]研究本地区幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,HP）的克拉霉素耐药与23S rRNA基因位点突变的关系,为临床根除HP治疗提供依据.[方法]入选消化性溃疡患者180例,在胃窦小弯侧距幽门2～3cm范围内取1块胃黏膜组织行常规病理检查,在胃窦小弯侧、十二指肠球部、胃体大弯侧各取1块黏膜行HP培养,对HP阳性分离菌株进行药敏实验.选取其中克拉霉素耐药菌株35例及敏感菌株30例,对23S rRNA基因PCR扩增后进行全基因测序对比分析.[结果] 180例中HP阳性率占76.11％,活检组织培养HP阳性率占73.89％.药敏检查结果克拉霉素耐药率为33.08％.HP23S rRNA测序结果显示存在多位点突变,耐药组及非耐药组中T2182C普遍存在,A2143G、A2142G和A2097G在耐药组中多见,A2097C、A2097T仅在敏感组中发现,差异有统计学意义.[结论]本地区HP对克拉霉素耐药率高,克拉霉素耐药菌株A2143G、A2142G和A2097G位点突变高于敏感组,建议根据药敏试验指导根除HP方案.     

2019-2020年宁夏炭疽芽胞杆菌毒力鉴定及基因分型研究

目的 了解宁夏2019-2020年分离的炭疽芽胞杆菌菌株致病力及基因分型特征,为宁夏皮肤炭疽疫情判定与分子溯源提供实验室依据。方法 收集2019-2020年宁夏各地区分离的炭疽芽胞杆菌,对其进行毒力鉴定,并运用MLVA-15和canSNP分型技术进行基因分型研究。结果 2019-2020年宁夏分离到的炭疽芽胞杆菌均为强毒株,MLVA-15分型为同一种群,canSNP分型为A.Br.001/002组。结论 2019-2020年宁夏分离到的炭疽芽胞杆菌致病力较强,且菌株呈现相同的基因分型特征,提示菌株间存在流行病学关联。此研究结果填补了宁夏炭疽芽胞杆菌实验室检测中菌株致病力及基因分型的空白。     

Appropriate maturation and folding of 16S rRNA during 30S subunit biogenesis are critical for translational fidelity

Ribosomal protein S5 is critical for small ribosomal subunit (SSU) assembly and is indispensable for SSU function. Previously, we identified a point mutation in S5, (G28D) that alters both SSU formation and translational fidelity in vivo, which is unprecedented for other characterized S5 mutations. Surprisingly, additional copies of an extraribosomal assembly factor, RimJ, rescued all the phenotypes associated with S5(G28D), including fidelity defects, suggesting that the effect of RimJ on rescuing the miscoding of S5(G28D) is indirect. To understand the underlying mechanism, we focused on the biogenesis cascade and observed defects in processing of precursor 16S (p16S) rRNA in the S5(G28D) strain, which were rescued by RimJ. Analyses of p16S rRNA-containing ribosomes from other strains further supported a correspondence between the extent of 5^′ end maturation of 16S rRNA and translational miscoding. Chemical probing of mutant ribosomes with additional leader sequences at the 5^′ end of 16S rRNA compared to WT ribosomes revealed structural differences in the region of helix 1. Thus, the presence of additional nucleotides at the 5^′ end of 16S rRNA could alter fidelity by changing the architecture of 16S rRNA in translating ribosomes and suggests that fidelity is governed by accuracy and completeness of the SSU biogenesis cascade.     

鼠疫耶尔森氏菌16S-23SrRNA基因间区分析

目的　发展一种快速准确的鉴定鼠疫菌的方法。方法　 Ｐ Ｃ Ｒ 反应加限制性内切酶消化的方法。结果　对来自不同疫源地的 １０３ 株鼠疫菌 １６ Ｓ２３ Ｓｒ Ｒ Ｎ Ａ 基因间区进行扩增,均可扩出两条长为 １ １４６ｂｐ 及 １ ０９０ｂｐ 的片段,扩增产物用限制性内切酶 Ｔａｑ Ｉ, Ｍ ｓｐ Ｉ消化后的酶切图谱相同。而对照菌株小肠结肠炎耶尔森氏菌,鼠伤寒沙门氏菌,大肠杆菌,痢疾杆菌,霍乱弧菌的扩增产物及酶切图谱与鼠疫菌均不相同。结论　鼠疫菌 １６ Ｓ２３ Ｓｒ Ｒ Ｎ Ａ 基因间区高度同源,基本为两种类型,长度分别为 １ １４６ｂｐ 及 １ ０９０ｂｐ,其他菌株与其明显不同;该方法将有助于快速准确的鉴定鼠疫菌。