人巨细胞病毒感染对宿主细胞周期进程影响的实验研究

目的观察人巨细胞病毒（HCMV）感染对宿主细胞DNA合成及细胞周期蛋白（Cyclins）表达的影响。方法用HCMV感染同步化于G0／G1期的人胚肺成纤维细胞（HEL），分别于感染后0、3．6、12、24、48、72、96h终止培养。用流式细胞术测定HCMV感染后细胞周期进程及DNA含量。用免疫蛋白印迹法（Western Blot）检测CyclinE、Cyclin A、Cyclin D1蛋白的表达。结果HCMV感染细胞后24h-96h，S期细胞明显增多，G2／M期细胞减少，至感染后96h，未发现有G2／M期细胞。感染后24h细胞保持2N DNA含量，全部感染细胞DNA含量在48h内开始升高，感染后72h多数细胞的DNA含量大于2N DNA含量。在正常对照细胞DNA含量没有增加。HCMV＋PAA组没有检测到DNA含量增加。HCMV感染接触抑制细胞12h时CyclinE蛋白被诱导，感染后24h出现Cyclin E峰值；HCMV不能诱导Cyclin A蛋白表达；CyclinD1在感染后24h开始下降。结论HCMV感染同步化于G0／G1期的细胞后，诱导CyclinE蛋白明显升高，激活CyclinE／Cdk2激酶，使细胞周期越过G1／S限制点，将细胞周期阻止于晚G1期。病毒感染未能激活细胞DNA合成，病毒感染后总DNA的增加由病毒DNA复制造成。     

IL-1β或IL-6对大脑皮质星形胶质细胞细胞周期的影响

为研究白细胞介素1β(Interleukin1β,IL1β)和白细胞介素6(Interleukin6,IL6)对培养新生大鼠的大脑皮质星形胶质细胞增殖的影响,本研究采用体外细胞培养方法获得新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞,然后在培养液中分别加入IL1β和IL6,在作用6、12及24h后,通过流式细胞仪检测IL1β、IL6对星形胶质细胞细胞周期的影响。结果显示IL1β、IL6作用于星形胶质细胞后,可引起细胞周期的显著变化,表现为G1期细胞数减少,S期、G2/M期细胞数增多,以作用12h时变化最明显。提示IL1β、IL6可促进体外培养的星形胶质细胞增殖。     

人巨细胞病毒感染对宿主细胞周期蛋白表达影响的实验研究

目的观察人巨细胞病毒（HCMV）感染对宿主细胞周期蛋白（Cyclins）表达的影响。方法用HCMV感染同步化于G0/G1期的人胚肺成纤维细胞（HEL）,分别于感染后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h终止培养。用免疫蛋白印迹法（Western Blot）检测CyclinE、CyclinA、CyclinD1蛋白的表达。结果HCMV感染接触抑制细胞12 h时CyclinE蛋白被诱导,感染后24 h出现CyclinE峰值;HCMV不能诱导CyclinA蛋白表达;CyclinD1没有被诱导,且在感染后24 h开始下降。结论HCMV感染同步化于G0/G1期的细胞后,诱导CyclinE蛋白明显升高,激活CyclinE/Cdk2激酶,使细胞周期越过G1/S限制点,将细胞周期阻止于晚G1期。     

激活的星形胶质细胞条件培养液对神经元内iNOS、CaMKⅡ及AC表达的影响

为探讨星形胶质细胞(Ast)在癫痫发病机制中的作用,本研究通过体外分离纯化培养分别获取大鼠大脑皮质Ast及神经元,用睫状神经营养因子(CNTF)激活Ast,用其培养液,即星形胶质细胞条件培养液(ACM)孵育神经元4、8、12h后,采用Westernblot法及图像分析技术观察ACM对神经元内表达钙调蛋白依赖性激酶II(CaMKⅡ)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及腺苷酸环化酶(AC)的影响。结果表明,ACM作用神经元4h即可引起CaMKⅡ、iNOS及AC的表达增多并持续至12h(P<0.05),iNOS在8h最为明显,AC的表达在12h最为明显。上述结果提示ACM中含有致痫因子,NOS-NO-cGMP,Ca2+/CaM-CaMKⅡ及AC-CaMP-PKA三条信号通路可能参与其致痫机制中的信号转导。     

起始识别复合物1基因在血管平滑肌细胞DNA复制中的作用

目的探讨起始识别复合物1（ORC1）在血管平滑肌细胞（VSMC）DNA复制中的表达及其意义。方法采用组织块贴片法原代培养的大鼠胸主动脉VSMC,利用双胸苷阻断、秋水仙素阻抑法和血清饥饿法使VSMC达到细胞周期同步化,用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术和Western blot检测不同细胞周期的VSMC ORC1 mRNA和蛋白表达。结果同步化的VSMC DNA含量百分比,血清饥饿法以G0G1期为主（P〈0．01）,双胸苷阻断14h以G0G0期为主（P〈0．01）,双胸苷阻断14h后10％胎牛血清刺激6h以S期为主（P〈0．01）,秋水仙素培养12h以G2／M期为主（P〈0．05）。静止状态VSMC的ORC1 mRNA和蛋白质无表达,处于G1／S期VSMC的ORC1 mRNA表达量显著高于S期和G2／M期。VSMC的ORC1蛋白质表达量与ORC1 mRNA变化规律相似。结论ORC1随细胞的分裂周期而表达,ORC1可能是启动VSMC DNA复制的关键因子。     

体外共培养大鼠骨髓间充质干细胞对肝星状细胞增殖的影响:CyclinD1与P27表达调控

背景:在肝纤维化发生发展过程中,肝星状细胞起着关键作用。研究证实骨髓间充质干细胞移植可作为治疗肝纤维化的方法,但其逆转肝纤维化的机制不明。目的:探讨体外共培养条件下,大鼠骨髓间充质干细胞对肝星状细胞增殖的调控机制。方法:实验组在半透膜上接种大鼠骨髓间充质干细胞,在6孔塑料培养板上接种肝星状细胞,建立上下双层细胞共培养体系;对照组将大鼠骨髓间充质干细胞更换为成纤维细胞;空白组仅行肝星状细胞单独培养。WST-8法检测肝星状细胞生长抑制率,流式细胞仪分析细胞周期,RT-PCR检测肝星状细胞CyclinD1和P27mRNA的表达,Westernblot检测肝星状细胞CyclinD1和P27蛋白的表达。结果与结论:与空白组、对照组比较,实验组共培养24,48,72h肝星状细胞生长抑制率均显著升高(P0.01);共培养72hG0/G1期细胞显著增加(P0.01),S期细胞显著减少(P0.01),可阻滞肝星状细胞由G0/G1期向S期转换。共培养24h,实验组CyclinD1mRNA及蛋白表达开始下调,至72h时表达量显著低于对照组、空白组(P0.01);共培养全过程中各组p27mRNA的表达无明显差异(P0.05),共培养24h时实验组p27蛋白表达较对照组、空白组均显著上调(P0.01)。结果证实大鼠骨髓间充质干细胞能够抑制肝星状细胞的增殖,其机制可能是通过下调CyclinD1表达、上调P27蛋白表达,使细胞周期停滞于G0/G1期实现的。     

青蒿琥酯抑制人食管癌Eca-109细胞系的CDC25A表达

目的观察青蒿琥酯（artesunate，Art）对人食管癌Eca-109细胞系的抑瘤作用，并进一步探讨ATt诱导肿瘤细胞周期阻滞与CDC25A、TGF-β表达的关系。方法体外培养人食管癌Eca-109细胞系及正常人外周血单个核细胞（hPBMC），利用MTT法测定细胞增殖；采用流式细胞术（FCM）测定细胞周期；应用RT．PCR方法检测CDC25AmRNA表达，应用Western blot方法检测蛋白表达。结果Art能显著抑制Eca-109细胞的增殖，ICS0为（68．80±0．76）μmol／L，而对hPBMC的增殖则没有明显抑制作用。低浓度Art可将细胞阻滞于G0／G1期，S期细胞显著减少，当浓度达到100μmol／L时，细胞阻滞于G2／M期。Art可显著抑制Eca-109细胞CDC25AmRNA及蛋白表达，同时显著上调TGF-β的蛋白表达水平。结论Art可抑制肿瘤细胞生长，上调TGF-β表达，抑制CDC25A表达。     

孕激素促子宫内膜癌细胞株凋亡及下调细胞内survivin表达

目的 观察孕酮（P）对人子宫内膜癌内膜高分化腺癌细胞株Ishikawa细胞内survivin蛋白表达的影响,探讨孕激素治疗子宫内膜腺癌的机制。方法 体外培养人子宫内膜高分化腺癌细胞株Ishikawa细胞,MTT法观察细胞的增殖;流式细胞仪（FCM）检测细胞周期和细胞凋亡率;链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（SP）法测定Ishikawa细胞survivin蛋白的表达。结果 P呈剂量依赖性抑制Ishikawa细胞增殖（P<0.01）。P组G0/G1期细胞比例上升,S期细胞比例下降,凋亡率上升,并出现细胞凋亡峰（P<0.01）。survivin在Ishikawa细胞中有强表达, P处理24h后,明显下调survivin的表达,（P<0.01）。结论 孕酮调解调亡抑制蛋白Survivin的表达可能是调节细胞凋亡的机制之一。     

上调胰岛素样生长因子结合蛋白6基因对乳腺癌细胞 MDA-MB-231细胞周期和凋亡的影响*

目的：探究上调胰岛素样生长因子结合蛋白6（IGFBP-6）基因对乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞周期和凋 亡的影响。方法：体外培养人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞,转染IGFBP-6 过表达质粒,实时荧光定量PCR 法验证转染效率;流式细胞术检测转染IGFBP-6 后的细胞周期的改变及凋亡的情况;免疫印迹检测增殖细胞核抗 原（PCNA）、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、凋亡相关蛋白Bcl-2 和Bax 的蛋白表达水平。结果：IGFBP-6 转染 MDA-MB-231细胞后,IGFBP-6 的mRNA水平明显上调;PCNA、细胞周期蛋白D1 的表达水平明显降低;细胞 G1/S 期阻滞;凋亡细胞增多。结论：IGFBP-6 可以显著抑制乳腺癌细胞的增殖,促进细胞凋亡。     

atRA对新生大鼠纹状体神经干细胞增殖和分化的影响

目的：研究全反式视黄酸（atRA）对体外培养的NSCs分裂增殖和分化的作用及其机制。 方法： 分离培养新生SD大鼠纹状体神经干细胞（NSCs），免疫荧光细胞染色加以鉴定；采用不同组合配方的培养液培养细胞，FCM检测atRA对NSCs细胞周期分布和增殖的影响；利用免疫荧光鉴定和分化细胞的分类计数法，判定atRA对NSCs分化的影响。 结果： 细胞周期分析表明，atRA处理组G0/G1期细胞数量显著增加，PI值小于对照组。atRA处理组与对照组的NSCs，经诱导分化后产生的细胞类型有显著差异，atRA处理组产生的神经元是对照组的2.5倍。 结论： atRA能抑制NSCs细胞增殖，并抵消生长因子对NSCs的促有丝分裂作用，atRA还促进NSCs向神经元方向分化。     

缺血再灌注对大鼠神经元与星形胶质细胞的影响

应用免疫组织化学单标记法分别观察大鼠在大脑中动脉阻塞再灌注时胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和Fos蛋白在大脑皮质内表达的时间规律,并用免疫组织化学双重标记法观察GFAP和Fos蛋白表达的相互关系。结果发现在缺血1h再灌注2h时,大脑皮层的星形胶质细胞被激活,细胞体积增大,突起粗大,呈GFAP阳性。星形胶质细胞的反应直至48h依然强烈。被激活的星形胶质细胞和神经元表达Fos蛋白,并呈现时程变化规律。结果提示星形胶质细胞可能和神经元一起参与了大脑皮层缺血再灌注后的变化。     

地塞米松和苯妥英钠对癫痫大鼠脑内的GFAP和Fos表达的抑制作用

目的：探讨糖皮质激素（GC）的抗痫效应和抗痫机制。方法：动物行为学观察和免疫细胞化学染色。结果：戊四氮（PTZ）可诱发癫痫大发作,如诺在注入PTZ前30min先注入地塞米松或苯妥英钠（DPH）能减轻或抑制大鼠癫痫发作症状。免疫细胞化学染色结果表明,PTZ致痫组大鼠大脑皮质、海马回、齿状有大量肥大的胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）阳性的星形胶质细胞。GC或DPH抗痫组GFAP免疫反应明显减弱,阳性细胞数量减少,突起短而少,Fos蛋白在PTZ组大鼠致痫后1－1．5h有大量表达,而在上述两抗痫组显著少于PTZ致痫组。结论：1．通过与苯妥英钠（传统抗痫药）的抗痫效果相比较,进一步证明糖皮质激素具有抗痫效应。2．糖皮质激素的抗痫机制可能与抑制星形胶质细胞的活动有关。3．Fos蛋白表达的变化与癫痫活动有直接关系。     

体内和体外实验中马桑内酯对大鼠大脑皮质神经元白细胞介素-2受体表达的影响

为了探讨免疫调质与癫痫发病机制的关系，本文应用免疫细胞化学PAP法对体内和体外实验中马桑内酯（致痫剂）对大鼠大脑皮质种经元白细胞介素-2受体表达的影响进行了研究．在体内实验中，对照经大鼠大脑皮质仅见少量弱阳性白细胞介素-2受体免疫反应神经元，其免疫反应性定位于种经元膜上．大鼠一侧侧脑室注射马桑内酯诱发癫痫后，大脑皮质白细胞介素-2受体阳性神经元明显增多，免疫反应增强．在体外实验中，用马桑内酯温育培养大双皮质神经元24h，其白细胞介素2受体阳性神经元也比对照组增加了1．5倍，免疫染色加深．本实验结果提示，大脑皮质神经元上的白细胞介素-2受体可能参与癫痫的病理机制．     

抗CD81抗体对星形胶质细胞增殖的抑制作用

目的 研究抗CD81抗体在星形胶质细胞增殖中的作用.方法 将纯化的星形胶质细胞分为6组,加入不同浓度抗CD81抗体,其浓度依次为0、0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L,以四甲基噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性.在此检测结果的基础上,选出3个有意义的浓度组,加入浓度分别为0、0.5mg/L、5mg/L的抗CD81抗体,采用流式细胞术观察抗CD81抗体对星形胶质细胞周期的影响并进行统计学分析.结果 抗CD81抗体对星形胶质细胞的增殖有抑制作用,并呈一定的剂量依赖性.加入抗CD81抗体培养24 h后,实验组的星形胶质细胞处于G0/G1期的细胞指数减少,S期细胞指数增多.结论 抗CD81抗体抑制了星形胶质细胞的增殖,使星形胶质细胞的细胞周期受阻,阻滞于S期.     

CNTF及其受体在不同类型星形胶质细胞中的表达

目的：研究CNTF及其受体在不同类型星形胶质细胞中的表达分布。方法：星形胶质细胞的原代分离培养结合地高辛标记的RNA探针及寡核苷酸探原原位杂交技术。结果：0－2A前体细胞和纤维型星形胶质细胞中CNTFmRNA表达,大多数原浆型星形胶质细胞CNTF表达低,只有约5％的原浆型星形胶质细胞群可见较高,CNTNFmRNA的表达。原浆型与纤维型星形胶质细胞中CNTFRαmRNA表达相同。结论CNTF在不同类型星形胶质细胞中的表达水平不同。但其受体的表达水平无差别。     

Ciliary neurotrophic factor (CNTF) plus soluble CNTF receptor α increases cyclooxygenase-2 expression, PGE2 release and interferon-γ-induced CD40 in murine microglia

Background  

Ciliary neurotrophic factor (CNTF) has been regarded as a potent trophic factor for motor neurons. However, recent studies have shown that CNTF exerts effects on glial cells as well as neurons. For instance, CNTF stimulates astrocytes to secrete FGF-2 and rat microglia to secrete glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), which suggest that CNTF exerts effects on astrocytes and microglia to promote motor neuron survival indirectly. As CNTF is structurally related to IL-6, which can stimulate immune functions of microglia, we hypothesized that CNTF might exert similar effects.     

重组睫状神经营养因子对受损周围神经施万细胞相关基因表达的作用

目的研究重组睫状神经营养因子(CNTF)对受损周围神经施万细胞基因表达的作用。方法用硅管套接切断的大鼠坐骨神经，在受损神经局部给予重组CNTF，术后用免疫组织化学ABC法结合计算机图像分析观测S100蛋白(S100)、生长相关蛋白-43(GAP-43)、磷酸化酪氨酸(PTyr)、信号转导子和转录激活子(STAT)3的免疫反应阳性物质在修复侧远段神经的分布和相对含量。结果CNTF组修复侧远段神经相应区域S100、GAP-43、PTyr、STAT3阳性物质的含量显著或非常显著高于生理盐水组。结论重组CNTF能上调受损神经施万细胞S100、GAP-43、PTyr和STAT3的表达，提示重组CNTF通过强化受损神经施万细胞JAK-STAT途径，E调其S100和GAP-43的基因表达。