首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
相似文献
 共查询到20条相似文献,搜索用时 93 毫秒
1.
灌注法制备大鼠全肾脏脱细胞基质的研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的 探讨灌注法制备大鼠全肾脏脱细胞基质(ACM)支架的可行性.方法 取12周龄的Wistar大鼠的肾脏,保留输尿管、肾静脉及肾动脉,沿肾动脉插入留置针建立灌注通道.灌注压强为100 cmH2O,依次灌注肝素化PBS溶液,1%十二烷基磺酸钠(SDS)溶液,去离子水,1%TdtonX-100溶液以及含青链霉素的PBS溶液.经脱细胞处理后,采用HE染色法光镜观察及扫描电镜观察支架微观结构,DAPI染色法荧光显微镜观察残留细胞核成分.结果 所有经SDS及TritonX-100联合处理后的脱细胞基质支架在HE染色光镜观察下未发现细胞残留,扫描电镜观察仪见基膜及胶原蛋白等细胞外基质形成网状结构而无细胞,DAPI染色荧光显微镜观察未见DAPI与细胞核结合后所发出的强荧光.结论 灌注法用于制备大鼠全肾脏脱细胞基质支架,简便可靠,该支架无细胞成分残留,是一种理想的细胞支架.  相似文献   

2.
目的 对小鼠淋巴结脱细胞和卵巢脱细胞支架进行比较,为人工卵巢的制作提供组织工程材料。方法使用表面活性剂(0.5%SDS)振荡清洗方法脱细胞,再用去离子水(ddH2O)清洗其内残留SDS,获得脱细胞支架。HE染色观察脱细胞的形态,DAPI染色观察细胞的残留情况,Masson染色观察胶原纤维,阿尔新蓝染色(Alician Blue)观察糖胺聚糖,透射电镜观察支架超微结构,并测定DNA和羟脯氨酸含量。结果 与新鲜淋巴结及卵巢相比,脱细胞后大体观察组织体积稍缩小,颜色变淡,呈毛玻璃状。HE染色未见明显细胞残留,可见交织成网的纤维结构。Masson染色显示淋巴结和卵巢脱细胞支架胶原纤维形态保留完整。Alcian Blue染色显示卵巢脱细胞支架中蓝色条带较细,淋巴结脱细胞支架中有稍粗不定形基质样结构。DAPI染色未见明显细胞核。扫描电子显微镜见密集分布的大量纤维以及与纤维相连的较小的片状细胞外基质成分,相互连接成3D网架结构。DNA定量分析得出淋巴结及卵巢脱细胞支架仅残留7.45%及11.96%(P<0.05),卵巢脱细胞后羟脯氨酸含量减少(P<0.05)。结论 ...  相似文献   

3.
目的:探究制备羊膜脱细胞基质的方法.方法:取新鲜羊膜标本,分别采用TritonX-100(Triton组)预处理(恒温36 h)和甘油预处理(4℃,24 h×3次),再经胰蛋白酶、EDTA酶消化(分别用时4 h和10 h),制备羊膜脱细胞基质.经HE染色和扫描电镜观察2组羊膜脱细胞基质残留细胞数和组织结构,并观察接种的第3代人脐带间质干细胞在2种羊膜脱细胞基质上的黏附、生长状况.结果:上述2种方法制备的羊膜脱细胞基质均为白色、半透明膜状物,无细胞及其他组织残留.Triton组羊膜脱细胞基质结构均匀平整,操作时间短.甘油组样本表面凹凸不平,看不到细胞形态.脐带间质干细胞在2种羊膜脱细胞基质表面黏附、增殖状况均良好,Triton组细胞增殖状况总体优于甘油组(P<0.05).结论:TritonX-100预处理并酶消化法是制备羊膜脱细胞基质较好的方法.  相似文献   

4.
目的:制备家猪脱髓核细胞基质并评价其生物相容性。方法:分离家猪脊柱髓核组织,并逐步经过胰酶、核酶及TritonX-100处理,得到脱髓核细胞基质,DAPI染色观察脱细胞效果及扫描电镜观察脱髓核细胞基质的物理形态特点,将脱髓核细胞基质溶于醋酸,制备成脱细胞基质膜,将大鼠骨髓间充质干细胞接种于基质膜上培养。在第1~5天采用CCK-8检测骨髓间充质干细胞在脱髓核细胞基质膜上的增殖情况,并计算细胞相对增殖率(RGR)来评价其生物相容性。结果:制备出的家猪脱髓核细胞基质肉眼呈白色糜状,DAPI染色发现无细胞残留。扫描电镜下观察发现,脱髓核细胞基质由无序排列的胶原纤维组成。通过CCK-8检测,5 d内细胞毒性分级在0级与2级之间。结论:家猪正常髓核组织能够进行脱细胞处理,且脱细胞后由无序的胶原纤维组成。脱髓核细胞基质具有很好的生物相容性,符合生物工程支架选材标准。  相似文献   

5.
目的探究人肝组织脱细胞支架的制备。方法本研究利用手术切除的人肝血管瘤左外叶组织,经反复冻融,0.01% SDS、
0.1% SDS和1% Triton X-100循环灌注制备人肝组织脱细胞支架,并通过灌注过氧乙酸消毒。将L-02细胞通过门静脉插管种
植于脱细胞支架内进行培养。结果HE、DAPI染色和扫描电镜结果显示脱细胞支架内无细胞成分残留,残余DNA检测为
25.3±14.6 ng/mg干质量,小于新鲜肝脏DNA含量的1%。免疫组化证实支架内保留了Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、纤连蛋白、弹力蛋白
成分。L-02细胞在支架上生长良好且有增殖,并表达白蛋白及葡萄糖-6-磷酸酶。结论利用手术切除的人肝标本行肝组织脱
细胞支架的制备是可行的,且为构建更适用于临床的组织工程肝脏提供了新思路。
  相似文献   

6.
目的:通过去细胞化灌注技术,探讨成功制备天然子宫去细胞化生物支架的理想灌注策略,并通过系统的评价体系,以鉴定其能否作为子宫组织再生工程研究的良好应用载体。方法:选择健康成年雌性SD大鼠,采用子宫动脉入路途径,通过冻融、酶解及曲亚通(TritonX-100)联合十二烷基硫酸钠(SDS)的洗脱灌注等流程,获取子宫去细胞化支架。并通过大体形态观察、美兰染色、HE染色观察、基因组DNA定量分析、EGF、bFGF、TGF-β含量测定、电镜观察、胶原蛋白总量检测及主要胶原成分鉴定等对去细胞化后的子宫支架进行全面的评价。结果:成功建立动脉灌注入路并获得了肉眼透明的子宫去细胞化支架,HE染色和透射电镜观察均表明去细胞化子宫支架内无细胞残留,DNA含量检测表明支架内DNA残留量为(45.6±7.3)ng/mg,不足正常子宫的5%(P<0.01),美兰染色和扫描电镜显示子宫支架的脉管网络和空间结构保存完整;而胶原蛋白含量由新鲜子宫组织的(0.57±0.12)μg/mg增加到去细胞化子宫支架的(0.88±0.10)μg/mg,差异有统计学意义(P<0.05),结合各型胶原的免疫组织化学定性分析,说明去细胞化后子宫支架的细胞外基质成分保留得较为完整;ELISA结果显示去细胞化子宫支架中细胞因子EGF、bFGF和TGF-β分别保留了66%、85%和54%,表明其仍具备一定的生物活性。结论:本研究方法能够成功制备理想的去细胞化子宫支架,并且支架的基质成分和理化特性完整保留,能够作为子宫组织工程研究的良好载体。  相似文献   

7.
目的 探讨小鼠腔前卵泡在淋巴结脱细胞支架中的发育情况。方法 10周龄C57BL/6J小鼠的腋下淋巴结,使用0.5%的十二烷基硫酸钠(SDS)进行脱细胞处理,HE染色和扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察支架形态,DAPI染色和琼脂糖凝胶电泳和DNA含量检测观察细胞和DNA残留情况。中国仓鼠卯巢细胞(CHO)与支架共培养后,CCK-8验证脱细胞支架对细胞活力的影响。将小鼠腔前卵泡注射到支架内进行体外培养,HE染色观察卵泡的生长情况。免疫组化染色观察CYP-17/A1和FSHR的表达情况,ELISA检测细胞支架培养液中雌激素分泌水平。结果 与新鲜淋巴结相比,脱细胞后淋巴结外观变得透明,形态保持完整。HE和SEM发现支架内密集分布大量的三维纤维网架结构。DAPI染色未发现细胞的残留,琼脂糖凝胶电泳未发现明显DNA残留。DNA定量分析表明DNA的去除率为88%[(1 390.0±248.6)ng·mg-1 vs.(342.6±116)ng·mg-1](P<0.05)。CCK-8检测结果表明,在2...  相似文献   

8.
目的 用一种新的灌注脱细胞方案对离体SD大鼠心脏进行脱细胞处理,对其脱细胞效果进行检测与评估。方法 取12只2月龄同窝雄性SD大鼠,按随机数字表法分为脱细胞组和对照组,每组6只。将各组大鼠麻醉并行全身肝素化后取出心脏。取脱细胞组心脏称取重量,然后将灌注针逆行插入升主动脉,连接好灌注装置进行脱细胞,观察脱细胞过程中心脏外观的变化,结束后称取脱细胞后的质量。在各心脏左心耳、右心耳、心尖部及右室流出道的同一部位取少量组织测定dsDNA含量,余组织制作石蜡切片并行HE染色及Masson染色后采集图像分析。结果 脱细胞过程中,心脏颜色逐渐变得淡红,再变得相对透明,最后变成乳白色,肉眼可见冠脉血管结构保存完好。脱细胞组脱细胞前后心脏质量分别为(1.27±0.03)g、(0.49±0.02)g,差异有统计学意义(t=111.164,P<0.001)。2组心脏各处测得的dsDNA含量差异均有统计学意义(均P<0.01),且脱细胞组各处测得的dsDNA含量均显著低于50 ng/mg。对照组心脏HE染色切片及Masson染色切片均可见典型的心肌组织切片图像。而脱细胞组HE染色切片及Masson...  相似文献   

9.
软骨细胞与异体软骨微粒脱细胞基质体外相容性的研究   总被引:5,自引:0,他引:5  
Han XF  Yang DP  Guo TF  Fang DY  Xu XW  Zhang Y 《中华医学杂志》2005,85(27):1895-1898
目的探索以异体软骨微粒脱细胞基质为支架构建组织工程化软骨。方法多步骤酶法将绵羊关节软骨制成微粒脱细胞基质,行大体、光镜(苏木素伊红、胶原、甲苯胺蓝染色)、扫描电镜观察,同时测定微粒的胶原、氨基葡聚糖、DNA含量。异体绵羊关节软骨细胞分离、体外扩增,并与软骨微粒脱细胞基质混合体外培养0~35d,倒置显微镜及扫描、透射电镜观察,同时测定羟脯氨酸,氨基葡聚糖,DNA含量及细胞黏附率。结果软骨微粒脱细胞基质只含有基质成分,直径0.100~0.154mm,胶原,氨基葡聚糖及DNA含量分别为204.4±3.1μg/mg,18.3±2.0μg/mg和0.042±0.013μg/mg。异体软骨细胞紧紧围绕于异体软骨微粒脱细胞基质四周,二者形成的复合物中胶原、氨基葡聚糖及DNA含量于第7d与0d相比具有统计学意义(P<0.05),分别与14d(胶原、DNA)和21d(氨基葡聚糖)达高峰,随后维持在高水平。细胞黏附率为92%。结论软骨细胞与异体软骨微粒脱细胞基质有良好的生物相容性,为组织工程方法再造软骨提供又一支架材料。  相似文献   

10.
目的:探讨大块异种脱细胞骨基质的制备及生物相容性,为其在骨缺损修复领域中的临床应用提供实验依据。方法:取牛股骨下端松质骨切割制作4.0 cm×2.0 cm×1.0 cm大小的骨块,用10%NaCl和0.5%曲拉通X-100联合脱细胞处理,分为48 h、72 h、96 h三个时间段;处理后的大块异种脱细胞骨基质行HE染色、Masson染色及扫描电镜观察,观察大块异种脱细胞骨基质的脱细胞程度;用处理后的大块脱细胞骨基质制作浸提液,行急性毒性实验、热源实验,观察大块异种脱细胞骨基质有没有毒性反应及热源性;用处理后的大块异种脱细胞骨基质材料与SD大鼠骨髓间充质干细胞体外复合培养,观察细胞生长、细胞增殖及蛋白质含量测定。结果:4.0 cm×2.0 cm×1.0 cm骨块经过10%NaCl和0.5%曲拉通X-100联合处理72 h组及96 h组的异种脱细胞骨基质经HE染色及扫描电镜观察未见细胞成分,Masson染色观察胶原纤维基本结构未被破坏,材料浸提液急性毒性实验、热源实验符合规定标准,且骨髓间充质干细胞能够贴附在异种脱细胞骨基质孔隙内生长,细胞生长及蛋白合成功能不受异种脱细胞骨基质的影响。结论:大块异种脱细胞骨基质具有良好的生物相容性,可作为骨缺损修复的支架材料。  相似文献   

11.
不同培养时间软骨细胞的生物学特性   总被引:7,自引:0,他引:7  
目的 探讨软骨细胞在体外不同培养时间的生物学特性。方法 把罗骨细胞置盖玻片上2,观察不同培养时间细胞的形态学变化和增殖能力,应用阿新蓝和三色染色,观察细胞在培养过程中酸性粘多糖(GAG)、和胶原分泌情况。结果 软骨细胞经体外单层培养,传代4~5代后,细胞形态逐渐由多角形变为俊形,基质分泌减少,GAG和胶原染色变浅。结论 软骨细胞在体外培养3周左右是作为有组织工程的最佳种子细胞。  相似文献   

12.
目的:构建一种脱细胞软骨/GelMA复合材料支架用于修复软骨缺损。方法:对α-1,3-半乳糖苷转移酶基因敲除(GTKO)猪肋软骨脱细胞处理,得到低免疫原性脱细胞软骨基质,进行4,6-脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色、DNA含量检测评估脱细胞效果,苏木素-伊红(HE)染色、Masson三色染色分别评估细胞外基质结构及蛋白保留情况。再将脱细胞软骨冷冻研磨成粉末状,选取聚合物甲基丙烯酰化明胶(GelMA)溶液与脱细胞软骨粉末按不同比例均匀混合,制备一种可注射型生物材料,经紫外交联后获得可生物降解的复合支架,通过溶胀性能、储能模量检测对支架进行表征,并观察支架上细胞增殖情况。结果:天然软骨DNA含量为161.2 ng/mg,脱细胞软骨DNA含量仅为15.27 ng/mg,该种脱细胞方法效果良好。HE染色显示细胞外基质结构完整,Masson三色染色显示脱细胞组织保留了大部分细胞外基质成分。与纯GelMA相比,脱细胞软骨/GelMA复合支架溶胀率低,力学强度稍强。骨髓间充质干细胞能在支架上黏附并增殖。结论:通过可注射型脱细胞软骨/GelMA复合材料制备的支架具有低免疫原性,适宜的储能模量,良好的生物相容性,适用于软骨修复。  相似文献   

13.
目的:探讨骨调素(OPN)和单核细胞趋化蛋白(MCP1)在大鼠梗阻性模型中的表达及其在肾脏纤维化发病机制中的作用。方法:采用单侧输尿管结扎(UUO)制造梗阻性肾病模型,分别于造模后第7天、14天取肾组织,用HE和Masson染色法观察UUO大鼠术后不同时间点肾脏病理改变,免疫组化方法检测肾组织中OPN和MCP1蛋白的表达。结果:OPN、MCP1表达主要位于肾小管上皮细胞,随着梗阻时间的延长,肾组织中OPN、MCP1蛋白表达明显增加。表达分别与肾间质胶原相对面积呈正相关。结论:OPN、MCP1蛋白在梗阻性肾病大鼠肾组织表达明显增加介导炎症过程,参与肾间质纤维化。  相似文献   

14.
目的通过研究兔声带固有层损伤后不同时期组织病理及主要细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)的变化情况,探讨声带损伤后的自身修复特点。方法对实验用兔声带行锐性损伤深达声韧带,于术后3 d~12个月观察声带形态学变化,HE染色、Masson染色、Alcian Blue染色及免疫组化染色,观察声带组织学结构变化及固有层内胶原、透明质酸及纤维连接蛋白等主要ECM的分布及含量变化。结果兔声带损伤后3 d~3个月成纤维细胞明显增加,40 d~12个月纤维组织持续增生,12个月声带局部无分层结构。ECM中胶原在损伤后3 d~12个月含量均明显高于正常对照组(P<0.05),在固有层内不规则紊乱分布;透明质酸在损伤后40 d内含量有增加趋势,其后降低至正常对照组水平;纤维连接蛋白在损伤后40 d~12个月时含量均高于正常对照组(P<0.05),散在分布于固有层各层。结论兔声带损伤后,在损伤早、中期各种ECM分泌增加,主要表现为以胶原为主的纤维组织明显增多且呈无序排列,透明质酸略有增加,纤维连接蛋白明显增加;在损伤后期胶原和纤维连接蛋白含量持续高于正常,声带局部瘢痕形成。  相似文献   

15.
目的观察研究姜黄素(Cur)和维生素E(VE)联用预防大鼠肝纤维化的疗效。方法建立四氯化碳(CCl4)大鼠肝纤维化模型,Cur和VE及两药联用预防后观察肝左叶HE染色和Masson染色下形态学变化。结果 HE染色与Masson染色结果与模型组比较,预防组较模型组肝纤维化有明显改善,以药物联用组尤为显著。结论 Cur和VE对CCl4诱导的肝纤维化均有预防作用,两者合用预防肝纤维化效果更佳,具有协同作用。  相似文献   

16.
  目的  探讨非诺贝特在单侧输尿管结扎诱导的小鼠肾纤维化中的作用机制,为肾纤维化提供潜在的治疗靶点。  方法  成年雄性C57BL/6J小鼠31只,随机分为假手术组(Sham组,n=9)、单侧输尿管结扎组(UUO组,n=10)和单侧输尿管结扎+非诺贝特治疗组(UUO+Feno组,n=12)。UUO组及UUO+Feno组小鼠均结扎左侧输尿管,Sham组小鼠仅游离左侧输尿管,不做结扎处理。术后第二日起,UUO+Feno组每日给予10 mg/kg (终浓度为0.08 mg/mL)的非诺贝特溶液灌胃,持续14 d;其余两组每日灌胃等量生理盐水。术后第15 天灌胃结束后处死小鼠取材,检测血清肌酐和尿素氮,肾组织行HE染色、Masson染色和Sirius Red染色,检测肾组织羟脯氨酸含量,免疫组化染色检测肾组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(COLⅠ)蛋白表达,Western blot法检测肾组织α-SMA、COLⅠ蛋白表达变化,实时荧光定量(RT)- PCR法检测肾组织纤维化相关基因基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、COLⅠA1、COLⅠA2、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-SMA mRNA的表达变化。  结果  与Sham组相比,UUO组小鼠血清肌酐及尿素氮水平升高(P<0.05);与UUO组相比,UUO+Feno组小鼠血清肌酐及尿素氮水平降低(P<0.05)。HE染色、Masson染色、Sirius Red染色以及肾羟脯氨酸含量的结果均表明UUO组较Sham组胶原沉积明显增多,炎性细胞浸润明显,UUO+Feno组较UUO组胶原沉积程度显著减轻,炎性细胞浸润程度显著改善,对肾纤维化的启动阶段有抑制作用。免疫组化结果显示:与Sham组相比,UUO组 α -SMA、COLⅠ在肾组织中的表达水平升高(P<0.05);与UUO相比,UUO+Feno组α-SMA、COLⅠ在肾组织中的表达水平降低(P<0.05);RT-PCR和Western blot结果显示:与Sham组相比,UUO组纤维化相关因子的mRNA及α-SMA、COLⅠ蛋白表达水平均升高(P<0.05);与UUO组相比,UUO+Feno组纤维化相关因子的mRNA及蛋白表达水平均降低(P< 0.05)。  结论  非诺贝特通过调控与肾脏纤维化相关因子的表达水平改善肾脏纤维化。  相似文献   

17.
谢敏  周建华  朱国琴 《四川医学》2013,(8):1084-1086
目的观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在单侧输尿管梗阻大鼠中的表达情况,探讨其与肾间质纤维化的关系。方法采用单侧输尿管结扎术制备肾间质纤维化模型,将60只SD大鼠随机分为假手术组,模型组,每组分别于术后7、14、21d各处死10只大鼠,取梗阻侧肾组织行HE、Masson染色观察肾间质纤维化程度,行免疫组化方法检测两组大鼠不同时间段α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平。结果假手术组中,肾小球、肾小管和间质细胞均无α-SMA,与假手术相比,模型组手术后7d,肾间质中α-SMA阳性细胞数增多,呈进行性升高趋势,其与肾间质纤维化程度呈正相关。结论α-平滑肌肌动蛋白在肾间质纤维化的进展过程中发挥重要作用。  相似文献   

18.
目的 探讨氟浓度对体外培养软骨细胞糖胺多糖(GAG)和Ⅱ型胶原分泌的影响.方法 取2月龄雌性SD大鼠下肢髋关节及膝关节软骨,分离、培养出软骨细胞后,接种于细胞培养瓶,经鉴定后,分为空白对照组和NaF受试组(6.25 μmol/ml、12.50μmol/ml、25.00 tmol/ml、50.00 μmol/ml和100.00 μmol/ml),孵育6d后,分别进行GAG含量测定、阿利新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色.结果 NaF受试6d后,大鼠软骨细胞培养液GAG含量各组无显著性差异(P>0.05);阿利新蓝染色显示,大鼠软骨细胞内的糖原异染颗粒亦无明显差异;Ⅱ型胶原免疫组化染色则显示,不同剂量NaF可引起对软骨细胞外Ⅱ型胶原染色积分随剂量的升高逐渐上升(P<0.05).结论 NaF对大鼠软骨细胞GAG分泌可能无影响,但可能影响Ⅱ型胶原的分泌.  相似文献   

19.
肾炎康复片对大鼠肾间质纤维化的保护作用   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的:研究肾炎康复片对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾间质纤维化的保护作用。方法:21只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、肾间质纤维化组(UUO组)及肾炎康复片组(SKT组),观察大鼠UUO术后14d梗阻侧肾脏的组织学变化、纤维连接蛋白(FN)及基质金属蛋白酶抑制物-1(TIMP-l)的表达情况。结果:与Sham组相比,UUO组大鼠肾间质纤维化面积显著增加(P<0.01),FN及TIMP-1表达均有显著增高(P<0.01);与UUO组相比,SKT组大鼠肾间质纤维组织面积减少,FN及TIMP-1表达减弱(P<0.01);UUO组和SKT组大鼠FN及TIMP-1与肾间质纤维化面积成正相关(P<0.01)。结果:肾炎康复片可下调FN和TIMP-1在UUO大鼠肾间质中的表达,从而延缓肾间质纤维化的进展。  相似文献   

20.
目的:评价羟苯磺酸钙对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化影响,并探讨其作用机制。方法:21只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、肾间质纤维化组(UUO组)及羟苯磺酸钙组(CDT组),分别采用病理及免疫组织化学方法观察UUO术后14 d大鼠梗阻侧肾脏的组织学变化和MMP-9、TIMP-l表达情况。结果:与Sham组相比,UUO组大鼠肾间质纤维组织面积显著增加(P<0.01),MMP-9、TIMP-1表达均有显著增高(P<0.01)。与UUO组相比,CDT组大鼠肾间质纤维组织面积减少,MMP-9表达增强、TIMP-1表达减弱(P<0.01),UUO组和CDT组大鼠左肾MMP-9/TIMP-1与肾间质纤维化面积成负相关,且有统计学意义(P<0.01)。结论:羟苯磺酸钙可缓解输尿管梗阻导致的肾间质纤维化,其机制可能与其调节MMP-9/TIMP-1紊乱、改善基质代谢有关。  相似文献   

设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号