p38MAPK信号通路的抑制减轻缺氧复氧环境下心肌细胞凋亡

目的研究p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路抑制剂对缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡的影响。方法心肌细胞H9C2分为对照组(Con组)、缺氧复氧组(H/R组)、p38MAPK信号通路抑制剂SB203580组(SB203580组),Con组细胞正常培养,H/R组、SB203580组进行缺氧复氧处理,SB203580组细胞在缺氧前用p38MAPK信号通路抑制剂SB203580预处理24 h。噻唑蓝(MTT)检测细胞存活情况,流式细胞术检测细胞凋亡,二硝基苯肼显色法检测上清中乳酸脱氢酶(LDH)含量,用硫代巴比妥酸比色法检测细胞中丙二醛(MDA)含量,用黄嘌呤氧化法检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)含量,二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)法检测细胞中活性氧(ROS)含量,Western blot检测细胞中p38MAPK、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)蛋白表达。结果 H/R组、SB203580组细胞存活率低于Con组,凋亡率高于Con组,细胞中MDA、ROS含量高于Con组,培养液上清中LDH高于Con组,细胞中SOD含量低于Con组,细胞中p-p38MAPK、Cleaved Caspase-3蛋白水平高于Con组。SB203580组细胞存活率高于H/R组,凋亡率低于H/R组,细胞中MDA、ROS含量低于H/R组,培养液上清中LDH低于H/R组,细胞中SOD含量高于H/R组,细胞中p-p38MAPK、Cleaved Caspase-3蛋白水平低于H/R组。结论 p38MAPK信号通路抑制剂能够减轻缺氧复氧环境下心肌细胞凋亡和氧化损伤。     

microRNA-1对心肌缺氧复氧中细胞凋亡的影响

目的明确心肌缺氧复氧(H/R)时miR-1的表达变化及其对细胞凋亡的影响。方法建立乳大鼠心肌细胞H/R模型,TUNEL检测细胞凋亡、Western-Blot检测凋亡蛋白表达和实时荧光定量PCR检测miR-1表达。重组miR-1慢病毒感染乳大鼠心肌细胞,Western-Blot检测各组相关凋亡蛋白的表达。重组miR-1慢病毒感染乳大鼠心肌细胞后H/R处理,通过TUNEL检测心肌细胞凋亡,软件分析和计算心肌细胞凋亡率。结果心肌细胞H/R后,细胞凋亡率明显增加,同时促凋亡蛋白(Bax和Caspase-3)表达水平增加和抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平下降。在成功构建心肌细胞缺氧复氧细胞模型后,检测到心肌细胞miR-1表达水平下降。与对照组相比,感染LV-rno-miR-1组促凋亡蛋白(Bax和Caspase-3)明显增加和抗凋亡蛋白Bcl-2降低,而感染LV-rno-miR-1 sponge凋亡蛋白的结果相反。相对于感染LV-rnomiR-1组和缺氧复氧组,感染LV-rno-miR-1病毒后缺氧4小时复氧12小时,细胞凋亡率进一步增加。结论 miR-1具有促进细胞凋亡的作用。miR-1表达下降可能是心肌细胞缺氧复氧时维持稳态的一种自我调节机制。     

天麻素对缺氧缺糖星形胶质细胞氧化损伤的影响

目的探讨天麻素对缺氧缺糖星形胶质细胞氧化损伤的影响。方法分离培养乳鼠星形胶质细胞,建立缺氧缺糖星形胶质细胞模型,同时在缺氧缺糖处理前给予天麻素预处理,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖,乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测LDH的漏出率,流式细胞术检测细胞凋亡,Western印迹检测细胞中Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平,JC-1法检测线粒体膜电位,Western印迹检测胞质中细胞色素(Cyt)C蛋白水平。结果缺氧缺糖处理后的星形胶质细胞中LDH漏出率显著升高,细胞增殖活性显著降低,细胞凋亡显著增多,细胞中Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平显著升高,细胞线粒体膜电位显著降低,胞质中CytC蛋白水平显著升高(均P0.05)。天麻素预处理后的缺氧缺糖星形胶质细胞增殖活性升高,细胞LDH漏出率显著降低,细胞凋亡显著减少,细胞中Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平显著下降,细胞线粒体膜电位显著升高,CytC蛋白水平显著降低,与未经天麻素处理的星形胶质细胞比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论天麻素能降低缺氧缺糖星形胶质细胞氧化损伤,减少细胞凋亡。     

小RAN干扰Trx1促进大鼠缺血再灌注损伤的星形胶质细胞凋亡、抑制其增殖及作用机制

目的研究硫氧还蛋白(Trx)1在氧糖剥夺(OGD)损伤后对星形胶质细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法将体外培养原代星形胶质细胞分为对照组、OGD模型组、小干扰(si)RNA-NC组、siRNA-Trx1组,采用携带Trx1的siRNA星形胶质细胞抑制Trx1表达后进行OGD/复氧(R)干预,氧糖剥夺6 h,复氧24 h,对照组为正常培养的星形胶质细胞。实时荧光定量PCR(qPCR)检测干扰效果。噻唑蓝(MTT)实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫印迹试验检测含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、活化的(Cleaved)Caspase-3、B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)水平。结果与对照组相比,OGD模型组、siRNA-NC组、siRNA-Trx1组Trx1 mRNA表达水平显著增加(P0.05),Bcl-2蛋白显著下降(P0.05),Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平显著增加(P0.05);与OGD模型组相比,siRNA-NC组星形胶质细胞的增殖、凋亡及凋亡蛋白水平无显著变化(P0.05),siRNA-Trx1组细胞的增殖显著降低(P0.05),凋亡显著增加(P0.05),Bcl-2蛋白水平显著降低(P0.05),Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平显著增加(P0.05)。结论 Trx1可促进氧糖剥夺损伤的星形胶质细胞增殖、抑制其凋亡,其作用机制可能与调控Bcl-2/Bax/Cleaved Caspase-3信号通路有关。     

HMGB1 siRNA对缺氧复氧胃黏膜上皮细胞凋亡的影响及机制

目的探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)siRNA对缺氧复氧胃黏膜上皮细胞凋亡的影响及机制。方法将体外培养的人胃黏膜上皮GES-1细胞随机分为对照组(正常培养)、A/R组(缺氧复氧培养)、A/R+si NC组(转染Control siRNA后,缺氧复氧培养)和A/R+si HMGB1组(转染HMGB1 siRNA后,缺氧复氧培养),MTT法检测细胞的活力,流式细胞仪检测细胞的凋亡,Western blotting检测细胞中HMGB1、NF-κB p65和IκB-α、Bcl-2和Bax蛋白表达,ELISA法检测LDH含量。结果 A/R处理能够引起GES-1细胞存活率降低,细胞凋亡率和LDH含量升高,Bcl-2和IκB-α蛋白表达下降,HMGB1、Bax和NF-κB p65蛋白表达上调;HMGB1siRNA则能够抑制A/R的作用,升高GES-1细胞存活率,降低细胞凋亡率和LDH含量,上调Bcl-2和IκB-α蛋白表达,下调HMGB1、Bax和NF-κB p65蛋白表达。结论缺氧复氧可引起胃黏膜上皮GES-1细胞中HMGB1表达升高,下调HMGB1表达可明显抑制缺氧复氧诱导的细胞凋亡,其机制可能与抑制NF-κB信号通路有关。     

MiR-499靶向HMGB1保护缺氧复氧心肌细胞损伤的分子机制探讨

目的研究miR-499对缺氧复氧心肌细胞H9c2损伤的影响,并探讨其作用机制。方法运用免疫印迹法(Western blot)检测缺氧复氧心肌细胞中高迁移率族蛋白1(HMGB1)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、免抗人单克隆抗体(Bax)、caspase-3的蛋白表达;将H/R+miR-con组(转染miRcon)、H/R+miR-499组(转染miR-499 mimics)、miR-con组(转染miR-con)、miR-499组(转染miR-499mimics)、anti-miR-con组(转染anti-miR-con)、anti-miR-499组(转染anti-miR-499)、H/R+si-con组(转染si-con)、H/R+si-HMGB1组(转染si-HMGB1)、H/R+miR-499+Ctrl组(miR-499 mimics和pcDNA3.1共转染)、H/R+miR-499+HMGB1组(miR-499 mimics和pcDNA3.1-HMGB1共转染),均以脂质体法转染至H9c2细胞;实时荧光定量聚合酶链锁反应(q RT-PCR)检测各组细胞中miR-499的表达;流式细胞术检测各组细胞的凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测各组细胞的荧光活性。结果与NC组相比,H/R组细胞中HMGB1蛋白表达显著升高,miR-499表达显著降低(P0.05);过表达miR-499或敲减HMGB1均可显著下调H/R H9c2细胞凋亡率,显著下调Bax、caspase-3的蛋白表达,上调Bcl-2的蛋白表达(P均0.05);过表达HMGB1可逆转miR-499对H/R H9c2细胞凋亡的抑制作用。结论 MiR-499可抑制缺氧复氧心肌细胞H9c2凋亡,保护心肌细胞,其机制与靶向HMGB1有关,将可为心脏病的治疗提供新靶点。     

lncRNA NEAT1调控miR-206对缺氧复氧大鼠心肌细胞氧化应激损伤和凋亡的影响

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)NEAT1调控miR-206对缺氧复氧诱导的心肌细胞氧化应激损伤和凋亡的影响和机制。方法 体外培养H9c2心肌细胞,构建心肌细胞缺氧复氧模型。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测缺氧复氧诱导后lncRNA NEAT1和miR-206的表达水平。将lncRNA NEAT1小干扰RNA(si-lncRNA NEAT1)、miR-206模拟物(miR-206 mimics)分别转染H9c2细胞,缺氧复氧诱导后,检测细胞中丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)含量以及细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved Caspase-3)和cleaved Caspase-9蛋白表达。利用荧光素酶报告基因实验以及RT-qPCR验证lncRNA NEAT1和miR-206的靶向结合关系。结果 缺氧复氧诱导后H9c2细胞中lncRNA NEAT1的表达显著升高,miR-206的表达显著降低(P＜0.05)。转染si-lncRNA NEAT1或miR-206 mimics处理缺氧复氧H9c2细胞,细胞存活率显著升高,MDA、ROS含量以及LDH活性显著降低,cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白的表达显著降低,细胞凋亡率显著降低(P＜0.05)。lncRNA NEAT1靶向miR-206并负调控miR-206表达。抑制miR-206部分逆转沉默lncRNA NEAT1对缺氧复氧诱导的心肌细胞氧化损伤和凋亡的影响(P＜0.05)。结论 沉默lncRNA NEAT1通过上调miR-206可减轻缺氧复氧诱导的心肌细胞氧化应激损伤和细胞凋亡,进而发挥心肌保护作用。     

上调Yes相关蛋白对缺氧复氧心肌细胞损伤保护作用的实验研究

目的研究Yes相关蛋白(YAP)在缺氧复氧(H/R)心肌细胞损伤中的作用。方法用过表达YAP重组慢病毒感染心肌细胞,给予H/R处理,用real-time PCR和Western blot检测细胞中YAP表达情况。CCK8法测定增殖变化,二硝基苯肼显色法检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,流式细胞术检测凋亡变化,Western blot检测活化型Caspase-3和Caspase-9蛋白水平,DCFH-DA法检测活性氧(ROS)水平,黄嘌呤氧化法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性,JC-1法检测线粒体膜电位,Western blot法检测胞浆和线粒体中细胞色素C(Cytochrome C)蛋白水平。结果过表达YAP重组慢病毒感染可以提高H/R条件下心肌细胞中YAP表达水平。H/R处理后的心肌细胞增殖活性降低,LDH漏出率升高,细胞凋亡率升高,细胞中活化型Caspase-3和Caspase-9蛋白水平升高,ROS水平也升高,SOD活性降低,线粒体膜电位下降,胞浆中Cytochrome C蛋白水平升高,线粒体中Cytochrome C蛋白水平降低。上调YAP可以提高H/R条件下心肌细胞增殖活性,降低LDH漏出率,减少细胞凋亡,降低细胞中活化型Caspase-3和Caspase-9蛋白水平表达,提高SOD活性,减少细胞中ROS水平,提高线粒体膜电位,降低胞浆中Cytochrome C蛋白水平,提高线粒体中Cytochrome C蛋白水平。结论上调YAP减轻缺氧复氧心肌细胞损伤,减少细胞凋亡,作用机制可能与提高抗氧化酶活性,减少细胞内ROS水平,抑制线粒体凋亡途径有关。     

莱菔硫烷对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:探讨莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法:H9C2心肌细胞随机分为3组:正常对照组、缺氧/复氧组(H/R组)和SFN预处理组(10μmol/L SFN预处理细胞12 h后,进行缺氧/复氧处理)。采用倒置显微镜观察各组细胞形态及凋亡程度,CCK8法检测各组H9C2心肌细胞存活率,Western blot法检测血红素氧化酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)、Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。结果:与正常对照组相比,H/R组和SFN预处理组心肌细胞存活率均降低(P均0.01),HO-1、NQO1、Bcl-2和Bax蛋白表达水平及Bcl-2/Bax均升高(P均0.01)。与H/R组相比,SFN预处理组的细胞生长状态较好,细胞存活率明显提高[(76.00±0.52)%对(55.73±0.43)%,P0.01],HO-1(3.24±0.01对1.86±0.01,P0.01)、NQO1(1.67±0.01对0.95±0.01,P0.01)和Bcl-2(0.70±0.00对0.48±0.01,P0.01)蛋白表达水平及Bcl-2/Bax(1.22±0.01对0.56±0.00,P0.01)均明显升高,Bax蛋白表达水平明显降低(0.57±0.00对0.85±0.01,P0.01)。结论:SFN对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤有保护作用,可能与促进HO-1、NQO1、Bcl-2蛋白表达,抑制Bax蛋白表达有关。     

microRNA-1在急性心肌梗死大鼠中的表达以及对心肌细胞凋亡影响

目的研究microRNA-1(miR-1)在急性心肌梗死(AMI)大鼠中的表达及对心肌H9C2细胞凋亡的影响。方法将30只8～10周龄大鼠随机分为正常对照组、假手术组和模型组,每组10只。模型组采用开胸结扎冠状动脉(冠脉)的方法建立急性心肌梗死大鼠模型,假手术组大鼠仅开胸不结扎冠脉,正常对照组大鼠不做任何处理。通过缺氧、无血清培养构建缺血H9C2细胞模型,将H9C2细胞分为三组:对照组、阴性组和抑制组,对照组细胞不做任何处理,阴性组细胞转染NC,抑制组细胞转染miR-1 inhibitor。荧光定量PCR(qPCR)检测大鼠缺血心肌组织和H9C2细胞中miR-1的表达量,流式细胞术检测H9C2细胞凋亡率,免疫印迹试验(Western Blot)检测H9C2细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)蛋白表达量。结果正常对照组和假手术组大鼠心肌组织中miR-1表达量差异无统计学意义(P0.05);与正常对照组和假手术组大鼠相比,模型组鼠心肌组织中miR-1的表达量显著升高(P0.05);对照组和阴性组H9C2细胞中miR-1表达量、细胞凋亡率和细胞中Cleaved Caspase-3蛋白表达水平差异均无统计学意义(P0.05);与对照组和阴性组相比,抑制组H9C2细胞中miR-1的表达量显著下调(P0.05),细胞凋亡率和细胞中Cleaved Caspase-3蛋白表达水平水平显著降低(P0.05)。结论 miR-1在大鼠心肌梗死模型中的表达量增加,具有促进心肌细胞凋亡的作用。     

人参皂苷Rb1对H9c2细胞缺氧复氧的作用

目的观察人参皂苷Rb1对H9c2细胞缺氧复氧的作用。方法采用人参皂苷Rb1对H9c2细胞缺氧复氧进行预处理,通过检测氧化应激、凋亡指标观察人参皂苷Rb1的作用。将细胞随机分为对照组、缺氧复氧组、缺氧复氧加人参皂苷Rb1(50、100、200μmol/L),按实验设计因素处理后,通过蛋白电泳检测凋亡相关蛋白caspase-3,检测氧化应激指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS),TUNEL法检测细胞凋亡。结果缺氧复氧处理可使H9c2心肌细胞的ROS和MDA水平显著增加,SOD活性显著下降,上调caspase-3的表达,增加H9c2心肌细胞的凋亡。人参皂苷Rb1预处理可减少缺氧复氧H9c2细胞MDA表达量,增加SOD活性,降低ROS水平,且人参皂苷Rb1预处理可减少缺氧复氧H9c2细胞caspase-3的表达量及凋亡细胞数量。结论人参皂苷Rb1可降低缺氧复氧对H9c2心肌细胞的氧化应激损伤及凋亡,从而对缺氧复氧H9c2心肌细胞起保护作用。     

黄芪多糖对大鼠缺氧/复氧诱导的心肌细胞自噬及凋亡抑制作用的机制探讨

目的：探究黄芪多糖（APS）通过调控高迁移率族蛋白1/Toll样受体4/核转录因子-κB(HMGB1/TLR4/NF-κB)信号通路对大鼠缺氧/复氧（H/R）诱导的心肌细胞自噬及凋亡的抑制作用。方法：建立H9C2心肌细胞H/R损伤模型并分为4组：对照组、H/R组、APS组和HMGB1抑制剂组。CCK-8法和EdU染色法检测细胞增殖能力;酶联免疫吸附试验检测细胞肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、IL-6含量;透射电镜观察细胞自噬小体的形成;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（AnnexinV-FITC/PI）双染法检测细胞凋亡;实时定量PCR检测细胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法检测细胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)、P62、微管相关蛋白1A/1B-轻链3(MAP1LC3,缩写为LC3)-Ⅱ蛋白表达水平。结果：与对照组相比,H/R组细胞增殖能力明显减弱,凋亡及自噬水平明显增加,细胞内可见大量自...     

调控自噬对H9c2心肌细胞缺氧／复氧损伤的影响

目的探讨调控自噬水平对H9c2心肌细胞缺氧／复氧（H／R）损伤的影响及意义。方法将H9c2心肌细胞缺氧2h／复氧4h,建立H／R损伤模型。以3-甲基腺嘌呤（3-MA）为自噬特异抑制剂和雷帕霉素为自噬增强剂,试验随机分为四组：正常对照组（C组）、H／R组、H／R＋100mol／L3-MA组（M＋H／R组）、H／R＋100nmol／L雷帕霉素（R＋H／R组）,应用MTT法检测细胞活力,透射电镜检测心肌细胞自噬小体,流式细胞技术检测细胞凋亡比例,Westernblot法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1,凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及下游活性片段Caspase-9、Caspase-3蛋白表达。结果H／R组明显诱导H9c2心肌细胞自噬发生、细胞活力下降、凋亡增加（P〈O．01）．Westernblot检测发现,Bax、Caspase-9、Caspase-3活性片段蛋白表达明显增加,Bcl-2表达明显抑制,Bax／Bcl-2比值、活化蛋白Caspase-3、Caspase-9表达增加（P〈O．01）;M＋H／R组H／R损伤作用明显减弱,线粒体凋亡通路及下游蛋白表达抑制（P〈O．01）;而R＋H／R组线粒体凋亡通路进一步激活,促进细胞凋亡发生（P〈O．01）。结论自噬在H9c2心肌细胞H／R损伤中起到致命性作用,抑制自噬可保护心肌细胞H,R氧化应激损伤,其机制与抑制线粒体凋亡通路有关。     

Netrin-1对心肌细胞H9c2缺氧复氧损伤中的保护作用研究

目的研究Netrin-1在心肌细胞H9c2缺氧复氧损伤中的作用,并探讨其机制。方法建立心肌细胞H9c2缺氧复氧损伤模型;将A/R+Netrin-1组(转染pcDNA 3.1-Netrin-1)、A/R+Ctrl组(转染pcDNA 3.1)、A/R+Netrin-1+LY294002组(转染pcDNA 3.1-Netrin-1与抑制剂LY294002共处理)、A/R+Netrin-1+DMSO组(转染pcDNA 3.1-Netrin-1与DMSO共处理)均用脂质体法转染H9c2细胞;ELISA检测细胞中LDH、MDA、SOD的含量;MTT法检测细胞活力;WB检测细胞中Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、Netrin-1、p-AKT的蛋白表达;流式细胞术检测细胞的凋亡率。结果与A/R+Ctrl组相比,A/R+Netrin-1组细胞中LDH、MDA含量明显降低,SOD含量明显升高,细胞活力显著升高,Bax、Cleaved caspase-3的蛋白表达量均显著降低,Bcl-2蛋白表达量显著升高,Netrin-1、p-AKT蛋白表达均显著升高,细胞凋亡率显著降低(P0.05);与A/R+Netrin-1+DMSO组相比,A/R+Netrin-1+LY294002组细胞中LDH、MDA含量明显升高,SOD含量明显降低,细胞活力显著降低,Bax、Cleaved caspase-3的蛋白表达量均显著升高,Bcl-2蛋白表达量显著降低,Netrin-1、p-AKT蛋白表达均显著降低,细胞凋亡率显著升高(P0.05)。结论 Netrin-1可通过激活Akt通路促进缺氧复氧心肌细胞活力,抑制凋亡,发挥保护作用,将可为心肌损伤的治疗提供理论依据。     

miR-200c-3p靶向XIAP调控缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡

目的探讨miR-200c-3p对缺氧复氧心肌细胞凋亡的影响及作用机制。方法构建缺氧复氧(H/R)H9c2细胞。运用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测细胞中miR-200c-3p、X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)信使核糖核酸(mRNA)的表达。将H9c2细胞分为H/R+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、H/R+anti-miR-200c-3p组(转染anti-miR-200c-3p)、H/R+pcDNA组(转染pcDNA)、H/R+pcDNA-XIAP组(转染pcDNA-XIAP)、H/R+anti-miR-200c-3p+si-NC组(共转染anti-miR-200c-3p和si-NC)、H/R+anti-miR-200c-3p+si-XIAP组(共转染anti-miR-200c-3p和si-XIAP),用脂质体法转染至H9c2细胞,再进行缺氧复氧处理。免疫印迹(Western blot)、噻唑蓝(MTT)、流式细胞术检测细胞中XIAP、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved Caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病2 X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)的表达、细胞增殖、细胞凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞中miR-200c-3p与XIAP的结合力。结果成功构建缺氧复氧H9c2细胞;与正常培养的H9c2细胞比较,H/R组H9c2细胞中miR-200c-3p表达明显上调,XIAP表达明显下调;抑制miR-200c-3p、过表达XIAP均可抑制H/R H9c2细胞的凋亡,下调cleaved Caspase-3、Bax,上调Bcl-2;miR-200c-3p可显著抑制XIAP 3′UTR野生型报告基因活性,并负向调控XIAP的表达;敲减XIAP可逆转抑制miR-200c-3p对H/R H9c2细胞的凋亡抑制作用。结论 miR-200c-3p可诱导缺氧复氧心肌细胞的凋亡,其机制与靶向XIAP有关,可为心血管疾病的治疗提供新靶点。     

视神经萎缩相关蛋白A1在缺氧心肌细胞凋亡中的抑制作用

目的:探讨视神经萎缩相关蛋白A1(OPA1)在缺氧心肌细胞凋亡中的保护作用。方法:利用小干扰RNA(siRNA)在体外下调OPA1表达后,采用流式检测下调OPA1对缺氧心肌细胞凋亡的影响;用Western blot检测下调OPA1对缺氧心肌细胞线粒体细胞色素C释放及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶Caspase-3与Caspase-9活性的影响;用流式分析下调OPA1对缺氧心肌细胞活性氧(ROS)产生的影响。结果:下调OPA1可明显加重缺氧诱导的心肌细胞凋亡,诱导线粒体细胞色素C释放并激活Caspase-3与Caspase-9活性,诱导心肌细胞中ROS产生。结论:OPA1分子具有抑制缺氧心肌细胞凋亡的作用,其机制可能是OPA1介导的线粒体融合抑制了线粒体中细胞色素C的释放与ROS的生成。     

心复力颗粒诱导缺氧无血清条件下H9C2心肌细胞自噬发挥抗凋亡作用的实验研究

目的探讨中药复方心复力颗粒(XG)诱导缺氧无血清条件下H9C2心肌细胞自噬发挥抗凋亡的作用机制。方法将H9C2心肌细胞随机分为正常组、缺氧无血清组、XG(100～800μg/mL)组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(5μmol/L)、XG(400μg/mL)+3-MA(5 mmol/L)组,在缺氧无血清培养条件下处理24 h后,Hoechst33342荧光染色观察细胞凋亡,单丹磺酰尸胺(MDC)染色观察自噬小体形成,Western blotting方法检测凋亡和自噬蛋白表达水平。结果 Western blotting结果显示,缺氧无血清条件明显抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达,促进凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达。心复力颗粒处理后,可显著抑制细胞凋亡,Bcl-2表达上调,Bax和Caspase-3的表达下调,且呈浓度依赖性,在XG 400组作用最显著,与正常组比较,缺氧无血清组自噬小体明显减少,而在心复力颗粒各处理组中,随着药物浓度增加,自噬小体数量明显增加,在XG 400组最明显。同时LC3Ⅱ/LC3Ⅰ呈剂量依赖性增加,并在XG 400组表达水平达到峰值。用自噬特异性抑制剂3-MA处理细胞后,与缺氧无血清组比较,细胞凋亡明显增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著减少,而凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达呈上升趋势。结论缺氧无血清培养条件可以引起明显的细胞凋亡和抑制细胞自噬;心复力颗粒干预后显著减少细胞凋亡同时诱导自噬发生,并呈现一定的浓度依赖性;心复力颗粒通过诱导细胞自噬下调细胞凋亡水平。心复力颗粒通过诱导缺氧无血清条件下的H9C2心肌细胞自噬,从而发挥抗凋亡作用,保护缺血心肌。     

CaSR对过氧化氢作用后心肌细胞活性和凋亡影响

目的探讨钙敏感受体(Ca SR)对过氧化氢作用后的心肌细胞活性和凋亡的影响。方法用过氧化氢处理大鼠心肌细胞H9C2记为模型组,用Ca SR抑制剂(NPS2300)处理后再用过氧化氢处理的H9C2记为抑制剂组,同时以正常培养的H9C2为对照组,荧光定量PCR检测细胞中Ca SR水平。MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡,二硝基苯肼显色法检测上清中乳酸脱氢酶(LDH)水平,硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)水平,黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶(SOD)水平,Western blot法检测细胞中活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、信号转导与转录因子3(STAT3)、磷酸化信号转导与转录因子3(p-STAT3)水平。结果模型组细胞中Ca SR水平高于对照组,差异有统计学意义(P0.05),而抑制剂组细胞中Ca SR水平低于模型组,差异有统计学意义(P0.05)。模型组细胞凋亡率、细胞中MDA含量、培养液上清中LDH水平、细胞中Cleaved Caspase-3水平均高于对照组(P0.05),而抑制剂组细胞凋亡率、细胞中MDA含量、培养液上清中LDH水平、细胞中Cleaved Caspase-3水平均低于模型组(P0.05)。模型组细胞增殖活性、细胞中SOD水平、细胞中p-STAT3水平均低于对照组(P0.05),而抑制剂组细胞增殖活性、细胞中SOD水平、细胞中p-STAT3水平均明显高于模型组(P0.05)。结论抑制Ca SR可以减弱过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡,增加细胞增殖活性,减少氧化损伤,作用机制可能与STAT3信号通路有关。     

当归多糖对缺氧-复氧损害H9c2心肌细胞的保护作用

目的探讨当归多糖(angelica sinensis polysaccharide,ASP)对缺氧-复氧损害H9c2心肌细胞的保护作用。方法噻唑蓝[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]检测ASP对H9c2细胞增殖的影响;在体外ASP培养后,再缺氧-复氧培养H9c2心肌细胞为实验组,以正常培养细胞为对照组,以仅缺氧-复氧培养细胞为缺氧-复氧组。观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(2′,7′-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)检测细胞活性氧水平;生化检测细胞丙二醛(malondialdehyde,MDA)、8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine,8-OHdG)浓度;实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(humanγ-glutamyl systeine synthetase,γ-GCS)、红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、醌氧化还原酶1[NAD(P)H dehydrogenase 1,NQO1]mRNA表达;Western bloting实验检测细胞B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X(Bcl-2-Associated X,Bax)、核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)蛋白浓度。结果在常氧环境中ASP可浓度-时间依赖地抑制H9c2细胞增殖;缺氧-复氧诱导H9c2细胞显著凋亡(P0.05)、活性氧水平显著升高(P0.05),同时造成活性氧清除相关酶γ-GCS、HO-1、NQO1 m RNA表达及Nrf2蛋白表达显著下调(P0.05);而ASP可浓度依赖地显著抑制缺氧-复氧诱导的H9c2细胞凋亡(P0.05),降低缺氧-复氧诱导的H9c2细胞活性氧水平(P0.05),显著提高缺氧-复氧诱导的H9c2细胞中γ-GCS、HO-1、NQO1mRNA表达及Nrf2蛋白表达(P0.05)。结论 ASP可上调Nrf2表达,提高心肌细胞内抗氧自由基酶的表达,降低由缺氧-复氧所导致心肌细胞的氧化应激水平,抑制心肌细胞凋亡。     

RNA干扰程序性细胞死亡因子4表达对缺氧/复氧H9C2心肌细胞凋亡的影响及其机制

目的 探讨RNA干扰程序性细胞死亡因子4（PDCD4）表达对缺氧/复氧（H/R）H9C2心肌细胞凋亡的影响及其机制。方法 将H9C2心肌细胞分为对照组、H/R组、H/R+NC组和H/R+siPDCD4组。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）分别检测4组H9C2心肌细胞中PDCD4 mRNA和蛋白水平,流式细胞仪检测其凋亡率,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其上清液中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）水平,Western blot检测磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路相关蛋白水平。结果H/R组H9C2心肌细胞PDCD4 mRNA和蛋白、活化的Caspase-3、Bcl-2相关X(Bax)蛋白、上清液中LDH、MDA水平及凋亡率均高于对照组,而上清液中SOD水平、H9C2心肌细胞Bcl-2和p-AKT蛋白水平均低于对照组（P<0.05）。H/R+siPDCD4组H9C2心肌细胞PDCD4 mRNA和蛋白、活化的Caspase-3、Bax蛋白、上清液中LDH、MDA水平及凋亡率均低于H/R组,而上清液中SOD、H9C2心肌细胞Bcl-2和p-AKT蛋白水平均高于H/R组（P<0.05）。结论 RNA干扰PDCD4表达可抑制H/R引起的H9C2心肌细胞凋亡,其作用机制可能与激活PI3K/AKT信号通路进而降低氧化应激反应有关。