壳聚糖球形多孔微载体支持下人肝细胞L-02的高浓度细胞培养

背景：微载体培养技术作为一项体外高浓度细胞培养技术,近年来已在肝细胞的体外培养中得到应用。目的：对壳聚糖球形多孔微载体培养的人肝细胞L-02进行定时的形态学观察。方法：以自制的壳聚糖球形多孔微载体样本为支架来培养人肝细胞L-02设为实验组;无壳聚糖球形多孔微载体支持下人肝细胞的培养设为对照组。对两组细胞进行定时的细胞计数,并对实验组进行形态学观察,包括倒置相差生物显微镜观察和扫描电子显微镜观察。结果：两组培养的细胞数量均呈现前3d增长,在第3天细胞数量达到最高值;而且实验组3个样本培养的细胞数明显高于对照组无微载体培养的细胞数量（P〈0.05）,实验组各样本之间差异无显著性意义（P〉0.05）;倒置相差生物显微镜下动态观察,可见前3d微载体表面黏附生长的肝细胞则逐渐增多,第3天可见大部分微载体表面有许多肝细胞黏附成团,总的存活率均在90%以上,且肝细胞保持着良好的形态学结构;扫描电子显微镜观察,微载体表面、切面和内部均可看到有许多球状肝细胞紧密黏附。提示,以自制的壳聚糖球形多孔微载体作为一种支架,在体外三维环境下可以进行高浓度细胞培养。     

壳聚糖球形多孔微载体支持下培养的肝细胞功能及其代谢活性检测

背景：在肝细胞移植及生物型人工肝研究中,肝细胞培养仍然是其关键,如何方便地获取足够数量、活性较好、功能良好的肝细胞已经成为其首要问题。微载体培养技术作为一项体外高密度细胞培养技术,近年来已在肝细胞的体外培养中得到应用。目的：对壳聚糖球形多孔微载体培养的人肝细胞L-02进行定时的细胞功能和代谢活性检测。方法：对以自制的壳聚糖球形多孔微载体样本为支架培养的人肝细胞L-02进行定时的细胞功能检测（包括测定谷草转氨酶,谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶质量浓度）和代谢活性检测（包括检测培养基中白蛋白、尿素、葡萄糖含量）,其中实验组为壳聚糖球形多孔微载体支持下培养人肝细胞L-02,对照组为无壳聚糖球形多孔微载体支持下培养人肝细胞L-02,检测时间点为人肝细胞L-02培养的第1,2,3,4,5天。结果与结论：实验组和对照组测定的谷草转氨酶、谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶活性在前3d持续下降,第3天降到最低,而从第4天开始重新反弹上升;但白蛋白、尿素和葡萄糖水平在前3d持续上升,第3天升到最高值,而从第4天开始逐渐下降,实验组每天测定上述各项水平始终明显高于对照组（P〈0.05）,提示实验组中的人肝细胞L-02代谢活性较对照组增强。     

壳聚糖球形多孔微载体支持下培养的肝细胞功能及其代谢活性检测

背景:在肝细胞移植及生物型人工肝研究中,肝细胞培养仍然是其关键,如何方便地获取足够数量、活性较好、功能良好的肝细胞已经成为其首要问题。微载体培养技术作为一项体外高密度细胞培养技术,近年来已在肝细胞的体外培养中得到应用。目的:对壳聚糖球形多孔微载体培养的人肝细胞L-02进行定时的细胞功能和代谢活性检测。方法:对以自制的壳聚糖球形多孔微载体样本为支架培养的人肝细胞L-02进行定时的细胞功能检测(包括测定谷草转氨酶,谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶质量浓度)和代谢活性检测(包括检测培养基中白蛋白、尿素、葡萄糖含量),其中实验组为壳聚糖球形多孔微载体支持下培养人肝细胞L-02,对照组为无壳聚糖球形多孔微载体支持下培养人肝细胞L-02,检测时间点为人肝细胞L-02培养的第1,2,3,4,5天。结果与结论:实验组和对照组测定的谷草转氨酶、谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶活性在前3d持续下降,第3天降到最低,而从第4天开始重新反弹上升;但白蛋白、尿素和葡萄糖水平在前3d持续上升,第3天升到最高值,而从第4天开始逐渐下降,实验组每天测定上述各项水平始终明显高于对照组(P<0.05),提示实验组中的人肝细胞L-02代谢活性较对照组增强。     

壳聚糖球形多孔微载体的血液相容性评价

背景:文献报道的微载体大多为实心的、大孔的,虽然较二维微载体的比表面积有明显的增加,但距理想的三维微环境相差甚远。目的:构建壳聚糖球形多孔微载体,通过溶血实验、凝血实验、血小板计数及聚集实验评价其血液相容性。方法:利用液氮冷冻干燥技术成功构建浓度为1%,2%,3%的壳聚糖球形多孔微载体。选择健康成年新西兰兔为宿主,采用溶血实验、凝血实验、血小板计数及其聚集实验评价壳聚糖球形多孔微载体的血液相容性。结果与结论:浓度为1%,2%,3%的壳聚糖球形多孔微载体的溶血率分别为1.56%,2.07%,2.31%,均小于5%,均无致溶血性;3种浓度壳聚糖球形多孔微载体样本材料对兔血时间无明显影响,三者与生理盐水阴性对照组间也无明显差别(P>0.05);3种浓度壳聚糖球形多孔微载体样本材料对兔血小板计数无明显影响,注入浸提液前后比较和组间比较差异均无显著性意义(P>0.05)。证实壳聚糖球形多孔微载体无致溶血性、无凝血性和无血小板聚集性,表明壳聚糖球形多孔微载体具有良好的血液相容性。     

壳聚糖球形多孔微载体的血液相容性评价

背景：文献报道的微载体大多为实心的、大孔的,虽然较二维微载体的比表面积有明显的增加,但距理想的三维微环境相差甚远。目的：构建壳聚糖球形多孔微载体,通过溶血实验、凝血实验、血小板计数及聚集实验评价其血液相容性。方法：利用液氮冷冻干燥技术成功构建浓度为1%,2%,3%的壳聚糖球形多孔微载体。选择健康成年新西兰兔为宿主,采用溶血实验、凝血实验、血小板计数及其聚集实验评价壳聚糖球形多孔微载体的血液相容性。结果与结论：浓度为1%,2%,3%的壳聚糖球形多孔微载体的溶血率分别为1.56%,2.07%,2.31%,均小于5%,均无致溶血性;3种浓度壳聚糖球形多孔微载体样本材料对兔血时间无明显影响,三者与生理盐水阴性对照组间也无明显差别（P〉0.05）;3种浓度壳聚糖球形多孔微载体样本材料对兔血小板计数无明显影响,注入浸提液前后比较和组间比较差异均无显著性意义（P〉0.05）。证实壳聚糖球形多孔微载体无致溶血性、无凝血性和无血小板聚集性,表明壳聚糖球形多孔微载体具有良好的血液相容性。     

原代小型猪肝细胞微载体培养及其功能特性

目的 研究原代小型猪肝细胞微载体培养方法的建立及肝细胞功能特性。方法将3.20×107个的肝细胞及2g/L cytodexTM 3微载体连同40ml含100ml/L Hyclone小牛血清及其他辅助因子的RPMI 1640培养基加入250ml已硅化的方瓶中培养。对不同培养时间的肝细胞进行形态学观察。同时测定不同培养时期肝细胞生物合成及生物转化功能。结果肝细胞产量为6.8×109～8.1×109(7.58±0.57)×109/肝细胞;肝细胞活率为92.0%～99.0％(96.25％±3.10％);肝细胞具有正常肝细胞的超微结构特征;接种培养后肝细胞呈明显的朝CytodexTM 3聚集,二者易相粘贴,粘附在微载体上的肝细胞增殖生长旺盛;当肝细胞数为3.20×107个时,接种后24h肝细胞尿素及白蛋白合成量分别为1.22mmol/L及0.075g/L;随着时间的延长,利多卡因的转化率逐渐增加,在24h时即达到100％。结论 使用微载体培养的小型猪肝细胞具有较旺盛的增殖生长能力、良好的生物转化及生物合成功能,可作为体外生物人工肝较为理想的细胞来源。     

微载体及其在肝细胞培养中的作用与应用

微载体具有比表面较大等优点，是目前较常用而有效的动物细胞大规模培养的载体，微载体培养技术已经成为动物细胞工程的基础和细胞学研究的主要技术和热点之一，广泛地应用于生产一些具有重要实用和商业价值的产品，积累了大量的实践经验和关键的实验数据，并在肝细胞、软骨细胞、成纤维细胞等组织工程种子大规模扩增研究领域取得了许多进展。文章就微载体及其在肝细胞培养中的研究进展做一综述，为动物细胞培养的载体研究提供理论基础。     

微载体悬浮培养体系对人脂肪基质干细胞增殖与分化的影响

目的：观察微载体悬浮培养系统对成人脂肪基质干细胞的培养效果及培养后细胞的分化能力。方法：实验于2004-09／12在军事医学科学院组织工程中心完成。悬浮培养系统采用Cytodex3微载体为贴壁依赖性细胞脂肪基质干细胞提供贴壁条件，浓度为5g／L。常规静止培养在12孔培养板中进行。两系统细胞接种密度均为1&;#215;10^8L^-1。分别观察细胞增殖情况，并对用悬浮培养体系培养的细胞进行细胞表型及分化能力检测。结果：微载体悬浮培养9d后达到最大活细胞密度(1．60&;#215;10^9L^-1)，常规静止培养第7天就达到最大活细胞密度(3．38&;#215;10^8L^-1)。在微载体悬浮培养条件下，脂肪基质干细胞生长更为旺盛，细胞产量更高，优于常规静止培养。微载体悬浮培养11d后，脂肪基质干细胞依然保持多向分化能力。结论：利用悬浮培养体系系统以及微载体技术有利于脂肪基质干细胞的大规模快速生长，细胞扩增后仍然保持其细胞表型及分化能力。获得的脂肪基质干细胞可以作为组织工程种子细胞实验研究及其临床应用。     

超声微泡造影剂促进腺病毒载体感染肝细胞的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂促进腺病毒载体感染肝细胞的有效性。方法 将昆明小白鼠分为三组，每组5只，一组经尾静脉输入含腺病毒载体的造影剂1ml，用低频超声波照射至微泡完全消失(约5min)。第二组经尾静脉输入含腺病毒载体的微泡造影剂，不采用超声波照射。第三组既不输入腺病毒载体也不采用超声波照射，用于对照。转基因后第14d，断颈处死小鼠，立即剖腹，取出肝脏，进行冰冻切片，在荧光显微镜下观察肝组织内荧光蛋白表达情况。结果 以超声触发破坏携带腺病毒微泡方式进行感染的小鼠肝脏中，绝大多数肝细胞均有大量荧光素蛋白表达；而单纯静脉注射腺病毒载体小鼠肝脏中，仅见少数肝细胞中有荧光素蛋白的表达；对照组小鼠肝组织中无荧光素蛋白的表达。结论 利用低频超声波在肝脏局部击碎携带腺病毒的微泡造影剂，有效地提高了腺病毒载体在肝细胞的感染率。     

微载体悬浮培养体系对人脂肪基质干细胞增殖与分化的影响

目的:观察微载体悬浮培养系统对成人脂肪基质干细胞的培养效果及培养后细胞的分化能力。方法:实验于2004-09/12在军事医学科学院组织工程中心完成。悬浮培养系统采用Cytodex3微载体为贴壁依赖性细胞脂肪基质干细胞提供贴壁条件,浓度为5g/L。常规静止培养在12孔培养板中进行。两系统细胞接种密度均为1×108L-1。分别观察细胞增殖情况,并对用悬浮培养体系培养的细胞进行细胞表型及分化能力检测。结果:微载体悬浮培养9d后达到最大活细胞密度(1.60×109L-1),常规静止培养第7天就达到最大活细胞密度(3.38×108L1)。在微载体悬浮培养条件下,脂肪基质干细胞生长更为旺盛,细胞产量更高,优于常规静止培养。微载体悬浮培养11d后,脂肪基质干细胞依然保持多向分化能力。结论:利用悬浮培养体系系统以及微载体技术有利于脂肪基质干细胞的大规模快速生长,细胞扩增后仍然保持其细胞表型及分化能力。获得的脂肪基质干细胞可以作为组织工程种子细胞实验研究及其临床应用。     

构建与人肝细胞系L02相容的聚丙烯生物杂化界面

学术背景：具有良好生物相容性的肝细胞/聚合物界面是生物反应器设计和构建的关键因素,然而,目前临床实践中使用的生物反应器并不理想。目的：构建与人肝细胞相容的聚丙烯生物杂化界面,为用聚丙烯中空纤维管构建生物人工肝反应器奠定基础。设计、时间及地点：对比观察,细胞相容性实验,于2003-02/10在上海交通大学完成。材料：聚丙烯利用光化学接枝聚合改性技术,在微孔聚丙烯超滤膜表面通过化学键的形式接枝亲水性丙烯酰胺基团形成接枝改性微孔聚丙烯超滤膜。方法：将人肝细胞系L02接种于聚丙烯膜、接枝改性聚丙烯膜表面,以聚苯乙烯作为正常对照。主要观察指标：聚丙烯膜接枝改性前后的静态水相接触角度;人肝细胞系L02在不同材料表面形态、贴壁率及增殖活性。结果：聚丙烯膜接枝改性后的静态水相接触角小于接枝前（P〈0.05）。人肝细胞L02在改性后聚丙烯膜上的贴壁率为0,细胞成球形聚集体生长,其增殖活性明显高于聚苯乙烯和改性前聚丙烯膜。结论：在聚丙烯表面接枝聚丙烯酰胺可建立良好的人肝细胞系L02与聚丙烯生物杂化界面,并可通过简单的静止培养形成肝细胞球形聚集体。     

纳米石墨碳对人L-02细胞系生长状况的影响

目的研究纳米石墨碳对人正常肝细胞系L-02生长状况的影响。方法电子显微镜观察纳米石墨碳颗粒的形态,激光粒度分析仪测定其粒径及Zeta电位;流式细胞术检测纳米石墨碳作用24 h对L-02肝细胞生长周期的影响;电镜观察细胞剖面,用以考察纳米石墨碳颗粒对L-02肝细胞亚显微结构的影响。结果电镜下纳米石墨碳颗粒呈微小球形,粒径在20～50 nm,表面带负电荷,电位值为-14.8 mV;流式细胞检测结果示实验组L-02肝细胞G0/G1细胞百分数低于对照组,G2/M细胞百分数高于对照组,S期细胞百分数高于对照组;电镜观察纳米石墨碳在细胞质和细胞核内均有分布,实验组肝细胞内的线粒体与对照组无明显差异,胞膜核膜均完整。结论纳米石墨碳颗粒促进了L-02肝细胞的增殖,纳米石墨碳颗粒可以很好地进入到L-02肝细胞内部,未见其对细胞亚显微结构造成损伤。     

Assessing the compatibility of primary human hepatocyte culture within porous silk sponges

Donor organ shortages have prompted the development of alternative implantable human liver tissues for patients suffering from end-stage liver failure. Purified silk proteins provide desirable features for generating implantable tissues, including sustainable sourcing from insects/arachnids, biocompatibility, tunable mechanical properties and degradation rates, and low immunogenicity upon implantation. While different cell types were previously cultured for weeks within silk-based scaffolds, it remains unclear whether such scaffolds can be used to culture primary human hepatocytes (PHH) isolated from livers. Therefore, here we assessed the compatibility of PHH culture within porous silk scaffolds that enable diffusion of oxygen/nutrients through the pores. We found that incorporation of type I collagen during the fabrication and/or autoclaving of porous silk scaffolds, as opposed to simple adsorption of collagen onto pre-fabricated silk scaffolds, was necessary to enable robust PHH attachment/function. Scaffolds with small pores (73 ± 25 μm) promoted larger PHH spheroids and consequently higher PHH functions than large pores (235 ± 84 μm) for at least 1 month in culture. Further incorporation of supportive fibroblasts into scaffolds enhanced PHH functions up to 5-fold relative to scaffolds with PHHs alone and 2D co-cultures on plastic. Lastly, encapsulating PHHs within protein hydrogels while housed in the silk scaffold led to higher functions than protein hydrogel-only or silk-only controls. In conclusion, porous silk scaffolds containing extracellular matrix proteins can be used for the culture of PHHs ± supportive non-parenchymal cells, which can be further built on in the future to create optimized silk-based liver tissue surrogates for cell-based therapy.

Porous silk scaffolds hybridized with extracellular matrix proteins are useful for culture of primary human hepatocytes ± supportive non-parenchymal cells.     

瘦素对人L-02脂肪变肝细胞胆固醇流出的影响

目的 观察瘦素对人L-02脂肪变肝细胞胆固醇流出及小凹蛋白（cavdin-1）、三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ASCAI）mRNA表达的影响，探讨瘦素在非酒精性脂肪性肝病发生、发展中的作用。方法 用20％的医用脂肪乳配制成10％的浓度，与10％的胎牛血清培养基共同培养细胞，造模时间24h，造模后分别用瘦素处理，浓度分别为10^-5、10^-6、10^-7mol／L，处理24h。每纽均行油红“O”染色。用RT—PCR测定cavelin—1、ABCA1mRNA表达。结果 油红“O”染色显示，10％的脂肪乳处理24h能成功制造肝细胞脂肪变性模型。RT—PCR显示肝细胞脂肪变性后cavelin-1及ABCA1mRNA表达增加。模型组加入瘦素处理后cavelin-1、ABCA1mRNA表达明显增加，且与瘦素浓度呈正相关。结论 10％的脂肪乳能导致肝细胞脂肪变性，肝细胞脂肪变性时，10^-7-10^-5mol／L浓度的瘦素能上调cavdin—1、ABCA1mRNA表达，促进细胞内胆固醇的逆转运。提示瘦素对治疗非酒精性脂肪肝病有一定作用。     

聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子对异种移植猪肝细胞凋亡的抑制作用

目的：观察聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子对猪肝细胞异种移植后移植肝细胞凋亡的抑制作用. 方法：实验于2004-03/2005-03在南通大学神经再生实验室完成,选用中国实验用小型猪（n=5）及SD大鼠（n=123）.①实验分组及方法：采用原位胶原酶循环灌注法分离猪肝细胞.D-氨基半乳糖腹腔内注射制作大鼠急性肝衰竭模型,按随机数字表法分成3组（n=41）,分别在单纯肝细胞移植组、胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组急性肝衰竭大鼠腹腔内移植震荡培养24 h的猪肝细胞悬液、Ⅰ型胶原凝胶固定培养24 h的猪肝细胞、Ⅰ型胶原凝胶包埋的聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子培养24 h的猪肝细胞.②实验评估：观察移植肝细胞的病理变化、培养和移植肝细胞的凋亡率、坏死率及活率. 结果：①各组移植肝细胞的活率及凋亡率：纳米胶原肝细胞移植组移植肝细胞的存活时间最长.肝细胞体外培养1 d后,3组肝细胞均存在不同程度的凋亡,以单纯肝细胞移植组凋亡率最高,纳米胶原肝细胞移植组最低.胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组的移植肝细胞凋亡率随着移植时间的延长呈缓慢上升趋势,但较单纯肝细胞移植组为低;移植后1,2 d,胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组的移植肝细胞活率明显高于单纯肝细胞移植组（P＜0.05）;移植后3,5 d时,纳米胶原肝细胞移植组移植肝细胞凋亡率明显低于胶原肝细胞移植组（P＜0.05）,活率则明显高于胶原肝细胞移植组（P＜0.05）.②各组移植肝细胞的坏死率：移植后1 d,胶原肝细胞移植组移植肝细胞坏死率明显上升;移植后2 d,3组肝细胞坏死率均有不同程度的上升,胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组明显高于单纯肝细胞移植组（P＜0.05）,胶原肝细胞移植组高于纳米胶原肝细胞移植组（P＜0.05）.移植后3 d,单纯肝细胞移植组肝细胞坏死率大幅度上升,胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组无明显变化,但显著低于单纯肝细胞移植组（P＜0.05）,胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组之间差异无显著性意义（P＞0.05）.移植后5 d,胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组肝细胞坏死率进一步上升,纳米胶原肝细胞移植组显著低于胶原肝细胞移植组（P＜0.05）. 结论：聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子有抑制培养和移植肝细胞凋亡、提高移植肝细胞活率的作用,聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子和Ⅰ型胶原结合可增强抗培养和移植肝细胞凋亡的能力,延长移植肝细胞的生存时间.