全反式维甲酸诱导小鼠碱性磷酸酶基因启动子区染色体重构

背景：碱性磷酸酶基因是成骨细胞分化和骨形成的重要标志。在C3H10T1/2细胞中,全反式维甲酸可通过核受体上调小鼠碱性磷酸酶的表达,与MAPK通路无关。目的：从染色体结构调控方面揭示全反式维甲酸上调碱性磷酸酶表达的分子机制。方法：10-6mol/L全反式维甲酸处理C3H10T1/2细胞0,1,6,12h,DNA酶Ⅰ超敏感实验确定全反式维甲酸调控区域的位置,染色质免疫共沉淀实验检验全反式维甲酸处理细胞后一系列转录相关因子与全反式维甲酸调控区域结合的量效关系以及时相分布。结果与结论：DNA聚合酶Ⅰ超敏感实验表明,小鼠碱性磷酸酶启动子转录起始位点上游约520bp附近为潜在的全反式维甲酸调控区域;染色质免疫共沉淀实验表明,全反式维甲酸对小鼠碱性磷酸酶的上调作用是通过一系列转录相关因子的时序性共同作用来实现。表明全反式维甲酸诱导小鼠碱性磷酸酶基因转录的过程中伴随着染色质重构和组蛋白的修饰作用。     

全反式维甲酸对人骨肉瘤细胞抑制增殖和诱导分化的实验

目的:探讨应用全反式维甲酸处理细胞增殖和分化对人骨肉瘤细胞的影响。方法:实验于2004-08/2005-01在第四军医大学唐都医院解放军骨科中心骨肿瘤研究所完成。以1×10-6mol/L的全反式维甲酸处理人骨肉瘤OS-9901细胞为试验组,对照组细胞不加全反式维甲酸处理。观察维甲酸对骨肉瘤细胞诱导分化向良性细胞发展的作用。①计算细胞增殖抑制率,通过四唑盐检测。②用药后细胞形态的变化,以显微镜观察。③骨肿瘤较为特异性的碱性磷酸酶表达变化,应用碱性磷酸酶染色观察。④用药对骨形成蛋白2表达的影响,表达增高促进骨肿瘤细胞的增殖,应用免疫组织化学染色观察。⑤细胞的变化应用透射电镜观察。⑥计算成瘤率,并对试验组与对照组肿瘤体积大小进行比较,采用裸鼠移植瘤试验。结果:①全反式维甲酸处理第2天对人骨肉瘤OS-9901细胞生长的平均抑制率为25.2%,第4天达到51.7%,第6天为68.4%。②显微镜下可见处理后的细胞生长及形态有明显改变,增殖缓慢,生长差,数量减少,分裂像少见。③碱性磷酸酶和骨形成蛋白2的表达减少。④透射电镜下出现处理后细胞膜绒毛减少,胞核光滑无切迹,核浆比例下降等良性分化改变。⑤各组肿瘤的成瘤率均为100%,成瘤期对照组约为7d,实验组约为10d,用药组瘤细胞核浆比例较对照组减小,出现大量的凋亡细胞和大片的坏死区,显示有明显抑制增值和向良性转变倾向。结论:全反式维甲酸有抑制骨肿瘤细胞增殖,并诱导其向良性分化作用。     

全反式维甲酸对人骨肉瘤细胞抑制增殖和诱导分化的实验

目的：探讨应用全反式维甲酸处理细胞增殖和分化对人骨肉瘤细胞的影响。方法：实验于2004-08／2005-01在第四军医大学唐都医院解放军骨科中心骨肿瘤研究所完成。以1&;#215;10^-6mol／L的全反式维甲酸处理人骨肉瘤OS-9901细胞为试验组，对照组细胞不加全反式维甲酸处理。观察维甲酸对骨肉瘤细胞诱导分化向良性细胞发展的作用。①计算细胞增殖抑制率，通过四唑盐检测。②用药后细胞形态的变化，以显微镜观察。③骨肿瘤较为特异性的碱性磷酸酶表达变化，应用碱性磷酸酶染色观察。④用药对骨形成蛋白2表达的影响，表达增高促进骨肿瘤细胞的增殖，应用免疫组织化学染色观察。⑤细胞的变化应用透射电镜观察。⑥计算成瘤率，并对试验组与对照组肿瘤体积大小进行比较，采用裸鼠移植瘤试验。结果：①全反式维甲酸处理第2天对人骨肉瘤OS-9901细胞生长的平均抑制率为25.2％，第4天达到51．7％，第6天为68．4％。②显微镜下可见处理后的细胞生长及形态有明显改变，增殖缓慢，生长差，数量减少，分裂像少见。③碱性磷酸酶和骨形成蛋白2的表达减少。④透射电镜下出现处理后细胞膜绒毛减少，胞核光滑无切迹，核浆比例下降等良性分化改变。⑤各组肿瘤的成瘤率均为100％，成瘤期对照组约为7d，实验组约为10d，用药组瘤细胞核浆比例较对照组减小，出现大量的凋亡细胞和大片的坏死区，显示有明显抑制增值和向良性转变倾向。结论：全反式维甲酸有抑制骨肿瘤细胞增殖，并诱导其向良性分化作用。     

丝裂原活化蛋白磷酸酶1调控法尼醇X受体转录活性的研究

目的:探讨丝裂原活化蛋白磷酸酶1(mitogen activated protein kinase phosphatase-1,MKP-1)调控法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)转录活性的作用。方法:采用实时定量PCR和蛋白印迹法,检测肥胖小鼠模型肝脏FXR和MKP-1的mRNA和蛋白表达;采用免疫共沉淀和荧光素酶报告基因实验,探讨MKP-1调控FXR转录活性的作用。结果:肥胖小鼠的肝脏组织中,FXR的表达显著下调(P<0.05),而MKP-1的表达则显著增加(P<0.05);免疫共沉淀和荧光素酶报告基因实验结果显示,MKP-1与FXR间存在蛋白-蛋白相互作用。MKP-1过表达后,可抑制FXR的转录活性(P<0.05),而干扰MKP-1的表达则可上调其转录活性(P<0.05)。结论:MKP-1可能作为FXR的辅抑制因子,从而参与肝脏糖脂代谢的调控。     

联合应用地塞米松和维甲酸诱导兔骨髓基质细胞向成骨方向的转化

目的:观察维甲酸和地塞米松对兔骨髓基质细胞的成骨诱导影响,探讨二者联合诱导兔骨髓基质细胞向成骨细胞分化的可能性和适当条件,使兔骨髓基质细胞向成骨诱导得以优化,从而为临床治疗骨缺损提供实验基础。方法:实验于2005-12/2006-3在锦州医学院附属第一医院骨科实验室完成。①体外培养兔骨髓基质干细胞。②用不同的诱导剂将其向类成骨细胞诱导。实验分非诱导组(用DMEM培养基培养),地塞米松诱导组(培养基中加入地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C),维甲酸诱导组(培养基中加入维甲酸),地塞米松与维甲酸联合诱导组(培养基中加入地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C和维甲酸)。③通过倒置相差显微镜对细胞的形态进行观察;于第4,6,8,10,12天定量检测其分泌的碱性磷酸酶;应用原位杂交技术检测Ⅰ型胶原的表达情况。结果:①原代和传代培养时不同组别兔骨髓基质细胞的生长情况:地塞米松诱导组细胞形态向类成骨细胞转化,维甲酸诱导组细胞与神经干细胞类似,地塞米松与维甲酸联合诱导组细胞与地塞米松诱导组细胞形态变化大体一致,但细胞更饱满,多角形细胞比例更高,部分区域细胞呈现漩涡状分布。②各组碱性磷酸酶活性检测结果:非诱导组碱性磷酸酶表达量低,随时间略有增加;地塞米松诱导组碱性磷酸酶表达呈曲线升高[6,8,10,12d依次为(265.9±47.3),(445.4±69.4),(650.3±52.0),(703.6±62.5)nkat/L];维甲酸诱导组基本无碱性磷酸酶表达;地塞米松与维甲酸联合诱导组碱性磷酸酶表达趋势与地塞米松诱导组相似,但绝对值有所增高[6,8,10,12d依次为(355.4±62.2),(631.3±84.4),(925.0±69.0),(1039.5±85.2)nkat/L]。③各组原位杂交技术检测Ⅰ型胶原结果:地塞米松诱导组和地塞米松、维甲酸联合诱导组检测Ⅰ型胶原结果发现胞浆内可见大量棕黄色颗粒,非诱导组与维甲酸诱导组为阴性。结论:适当浓度地塞米松可成功的将兔骨髓基质细胞向成骨细胞诱导,维甲酸与地塞米松联合诱导可使成骨能力进一步加强,表现为碱性磷酸酶表达明显增高,并表达Ⅰ型胶原,具体浓度条件有待进一步研究。     

多种生长因子诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞

背景:以往研究已证明胚胎干细胞可被诱导分化为胰岛素分泌细胞,但诱导时间较长,大部分需要1个月左右.目的:体外联合应用激活素A、全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子和烟酰胺4种生长因子,观察能否在较短的时间内将小鼠胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞.设计:细胞观察实验.单位:上海市内分泌及代谢病研究所,上海交通大学医学院附属瑞金医院.材料:实验于2004-10/2006-02在上海市内分泌研究所完成.清洁级孕12.5～14.5d龄昆明小白鼠2只,由上海斯莱克实验动物有限公司提供,动物质量合格证号2004A034,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.小鼠胚胎干细胞株由法国里昂CNRSUMR5641实验室张昌贤教授提供.激活素A为R&D公司产品;全反式维甲酸,烟酰胺由Sigma公司提供;碱性成纤维细胞生长因子由Gibco公司提供.方法:取孕鼠胚胎,除去头部和内脏,将剩余组织剪碎,胰酶消化后制备细胞悬液,取上层离心重悬,按3×108L-1接种培养,传2～3代时作为滋养层细胞.将鼠胚胎干细胞接种到新鲜滋养层上,加入含白血病抑制因子的knockout DMEM培养基,常规培养两三天后按1:3～1:6传代,当细胞与细胞之间分开时加入含血清的培养液终止消化,离心弃上清,制成单细胞悬液按2.5×104密度接种,加入不含白血病抑制因子的培养液,24～48h后收集形成的胚胎体,铺于Matrigel铺底的培养皿中.胚胎体贴壁后,在含有100μg/L激活素的10% FBS/DMEM中培养24h,再将培液换为10% FBS/DMEM培养6~8h作为间隔,然后把分化的胚胎体在含10-6mol/L全反式维甲酸的10% FBS/DMEM中培养24h,在含10μg/L碱性成纤维细胞生长因子的10% FBS/DMEM中培养3～5d,在含N2、 B27、1μg/L层粘连蛋白、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、10mmol/L烟酰胺的DMEM/F12培液中培养3～5d.诱导结束后,采用双硫腙染色、免疫荧光染色、RT-PCR检测分化细胞胰岛素的表达.主要观察指标:[1]胚胎干细胞的诱导情况.[2]双硫腙染色及免疫荧光染色.[3]RT-PCR检测.结果:[1]滋养层上的小鼠胚胎干细胞呈集落状态贴壁生长,集落边缘清晰,细胞之间的界限不明显.胚胎体形成后转至matrigel板上2d即贴壁.激活素A和全反式维甲酸间歇诱导后,碱性成纤维细胞生长因子培液中的细胞大部分变为上皮细胞样;经含N2、B27、层粘连蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、烟酰胺的DMEM/F12培液作用后,细胞形成小的簇状结构.[2]诱导生成的胰岛素分泌细胞经双硫腙染色呈暗红色,免疫荧光染色呈红色,均为阳性反应.[3]经激活素A、全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子、烟酰胺四种生长因子诱导2周后,分化细胞不表达Insulin 1mRNA,表达Insulin 2, Pdx1, Nkx6.1, Nkx2.2, PP, LAPP, Glutt2, Somastatin, Hnf3 β及Neuro D mRNA.结论:体外联合应用激活素A、全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子和烟酰胺4种生长因子,能够将小鼠胚胎干细胞成功诱导分化为胰岛素分泌细胞,且诱导时间缩短至2周.     

C3H10T 1/2小鼠胚胎成纤维细胞Dlxin 1基因表达及骨形态发生蛋白2的调控机制

背景:Dlxin 1可与成骨相关转录因子Dlx、Msx家族成员相互作用调节其转录活性,骨形态发生蛋白2可诱导小鼠胚胎成纤维细胞(C3H10T 1/2)向成骨细胞分化.目的:对C3H10T 1/2小鼠胚胎成纤维细胞中Dlxin 1基因的表达及骨形态发生蛋白2调控机制进行初探.设计、时间及地点:细胞分子水平实验,于2007-03/10在暨南大学生物工程研究所实验室完成.材料:C3H10T 1/2细胞为ATCC产品,骨形态发生蛋白2为自产,DH5α为自备.方法:用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测骨形态发生蛋白2对基因表达的影响,用双荧光报告载体系统搜寻Dlxin 1的上游启动子元件,用凝胶迁移实验(EMSA)对其精确定位.主要观察指标:①细胞中Dlxin 1基因mRNA的表达情况.②pGL3-Dlxin 1系列缺失突变报告载体荧光活性及启动子片段与C3H10T 1/2细胞核蛋白的结合能力检测.结果:在转录水平上骨形态发生蛋白2可以诱导Dlxin 1基因表达上调;Dlxin 1启动子基础活性和骨形态发生蛋白2诱导活性调控区域均位于转录起始位点上游-943～-728 bp之间;EMSA证实,-758～-748 bp这一片段是调控核心区域.结论:转录因子通过与Dlxin 1启动子上游TATA box结合来调控Dlxin 1基因的转录.     

转录因子GATA-2对iASPP基因的转录调控研究

癌基因iASPP促进细胞增殖、抑制细胞凋亡,其转录起始位点上游序列有转录因子GATA-2的假定结合位点,GATA-2在造血干/祖细胞的增殖和分化中起重要作用。本研究旨在探讨GATA-2对iASPP的转录调控作用。首先检测了部分白血病细胞系中iASPP和GATA-2蛋白的表达,然后构建带有GATA-2开放读码框的真核表达载体与带有iASPP转录起始位点上游3000 bp至下游500 bp序列中GATA-2假定结合位点的荧光素酶报告载体,共转染HEK293和CV-1细胞,检测荧光素酶活性,并对荧光素酶活性上调的结合位点区进行染色质免疫共沉淀实验。结果显示,白血病细胞系中iASPP高表达的细胞大多存在GATA-2的高表达;GATA-2对iASPP报告基因荧光素酶活性有显著影响,并呈现明显的＂剂量-效应＂关系。当pCMV5-GATA2转染剂量上升至100 ng时,iASPP荧光素酶活性在HEK293细胞中上调到2倍;此转录激活作用在CV-1细胞中尤为显著,荧光素酶活性上调可达6.7。染色质免疫共沉淀结果证实GATA-2与iASPP转录起始区nt-361～-334有特异性结合。结论：转录因子GATA-2可以与iASPP的转录调控区结合,并促进iASPP基因转录。     

全反式维甲酸诱导Rig-g基因表达的调控机制研究

为了揭示全反式维甲酸(ATRA)诱导急性早幼粒白血病(APL)细胞株NB4细胞分化过程中rig-g基因表达的分子机制,进一步阐明ATRA在APL细胞分化中的信号转导网络,采用荧光素酶报告基因试验、蛋白质免疫共沉淀试验以及染色质免疫共沉淀试验等对直接启动rig-g基因表达的转录因子及其作用机制进行研究。结果显示:在NB4细胞中,STAT2、IRF-9和IRF-1均能够被ATRA诱导表达,但表达时相有所不同。STAT2和IRF-9可以发生相互作用,形成复合物,并与rig-g基因启动子上的序列结合,激活rig-g基因的表达。IRF-1单独也能激活含rig-g基因启动子的报告基因,但是C/EBPα能强烈抑制IRF-1的这种转录激活作用。结论:在维甲酸诱导APL细胞分化过程中,ATRA首先诱导IRF-1的表达;随着C/EBPα的逐渐下调,IRF1-继而又进一步使细胞内的IRF-9和STAT2的蛋白水平上升。IRF-9和STAT2相互作用形成的复合物是直接诱导rig-g基因表达最基本的转录因子。本研究对于深入理解ATRA诱导APL细胞分化的信号转导网络具有一定的意义。     

全反式维甲酸诱导神经干细胞向神经元的分化

背景:目前研究证实全反式维甲酸在调控多种组织和细胞的增殖、生长发育、代谢以及维持内环境稳定等方面具有广泛生物学作用.目的:探讨全反式维甲酸诱导神经干细胞分化为神经元过程中的作用及其分子机制.设计、时间及地点:对照观察,体外细胞学实验,于2006-07/2007-06在上海同济大学附属医院实验室完成.材料:普通级孕13～14 d雌性SD大鼠6只,取胎鼠用于制备神经干细胞.诱导剂全反式维甲酸为Sigma公司产品.方法:取第3代神经干细胞,以2×108 L-1密度接种,分为全反式维甲酸诱导1 d,3 d,7d,10d组和空白对照组,各诱导组均加入1 μ mol/L全反式维甲酸,空白对照组仅加入等量生理盐水.主要观察指标:免疫荧光染色鉴定结果,计数分化为神经元的比例,应用半定量RT-PCR法检测维甲酸受体α mRNA的表达.结果:全反式维甲酸诱导后神经元特异性烯醇化酶染色呈阳性,细胞有多个细长突起,胞体呈绿色荧光,胞核呈蓝色荧光.与空白对照组比较,诱导3 d,7 d,10 d组神经元特异性烯醇化酶染色阳性细胞率均明显升高(P<0.05),且诱导7 d组达峰值.与空白对照组比较,各诱导组维甲酸受体α mRNA的表达量均明显升高(P<0.01).结论:全反式维甲酸能显著提高大鼠胚胎神经干细胞分化为神经元的比例,同时发现细胞维甲酸受体α mRNA的表达增加.