大肠杆菌表达抗原结合片段的策略

背景：抗原结合片段在大肠杆菌中表达量低是制约其大规模生产和应用的主要因素,通过对宿主细胞、表达载体、表达条件和纯化条件等进行改造与优化,将有可能获得基因工程抗体的高效表达。目的：总结并介绍抗原结合片断抗体在大肠杆菌中的表达和纯化的最新策略。方法：由第一作者用计算机检索中国期刊全文数据库（CNKI：1990/2010）和Medline数据库（1990/2010）,检索词分别为＂大肠杆菌,抗原结合片段,表达,纯化,抗体＂和＂Escherichiacoli,Fab,Expression,antibody,purification＂,语言分别设定为中文和英文。从Fab抗体在大肠杆菌中表达方式及纯化2方面进行总结,对抗原结合片断抗体在大肠杆菌中最新的表达和纯化等方面进行介绍。结果与结论：共检索到125篇文章,按纳入和排除标准对文献进行筛选,共纳入30篇文章。结果表明抗原结合片段抗体在大肠杆菌中表达方式主要为细胞质表达和分泌表达,其纯化主要有金属离子螯和纯化和特异蛋白亲和纯化,抗原结合片断在大肠杆菌中表达的影响因素是多方面且相互关联的。目前研究对大幅提高抗原结合片断抗体在大肠杆菌中最新的表达量和最适纯化策略尚不一致。     

双亲和柱分离纯化高纯度抗体Fab酶切片段

目的建立利用抗原亲和柱及蛋白G亲和柱纯化抗体木瓜蛋白酶酶切产物中高纯度Fab片段的方法。方法以抗体对应的抗原蛋白与NHS-activatedSepharose4FastFlow活化偶联填料偶联制备抗原免疫亲和层析柱,将抗体木瓜蛋白酶酶切产物分剐通过蛋白G柱及抗原亲和柱制备抗体的Fab片段。通过sDS-PAGE电泳、ELISA瓣3定及临床类风湿因子阳性血清的干扰实验鉴定其制备效果。结果抗体木瓜蛋白酶酶切产物分别通过蛋白G柱及抗原亲和柱后可以依次去除抗体Fc片段及未切开的抗体、木瓜蛋白酶及失活的Fab抗体片段,最终获得高纯度、高活性的Fab抗体片段。SDS-PAGE电泳、ELISA测定抗体Fc段被完全去除,双抗夹心nIsA检测能消除类风湿因子阳性血清导致的假阳性。结论成功建立了双亲和柱分离纯化抗体Fab片段的方法,该方法适用于快速、高质量、大规模制备Fab抗体片段。     

成骨蛋白1在椎间盘退变和修复中的作用

背景:椎间盘的再生修复是当前骨科疾病治疗所面临的一个难题,而成骨蛋白1具有强大的骨诱导活性,能够在体内诱导骨和软骨形成.目的:总结并讨论成骨蛋白1在椎间盘退变和修复中的作用.方法:由第一作者用计算机检索中国期刊全文数据库(CNKI:1990/2010)和Pubmed数据库(1990/2010),检索词分别为"椎间盘,退变,成骨蛋白1/骨形态发生蛋白7"和"intervertebral disc,degeneration,osteogenic protein-1/bone morphogenic protein-7"语言分别设定为中文和英文.从体外和体内两方面对成骨蛋白1对椎间盘细胞及其退变的影响进行介绍.结果与结论:共检索到56篇文章,按纳入和排除标准对文献进行筛选,共纳入27篇文章.结果表明成骨蛋白1具有促进细胞合成蛋白多糖和胶原的作用,可调节和恢复椎间盘退变中细胞外的基质代谢,可有效延缓椎间盘退变.     

人源性抗血小板噬菌体抗体库的构建

目的　应用噬菌体表面呈现表达系统构建一个经血小板主动免疫的人抗体组合文库 ,并筛选与人血小板结合的噬菌体抗体 (Fab片段 )。方法　从一反复输注血小板并出现血小板输注无效的患者的外周血分离淋巴细胞 ,提取mRNA ,逆转录合成cDNA ,用半巢式PCR扩增重链Fd和κ轻链基因。依次将PCR产物插入载体pComb3相应的位点 ,构建噬菌体抗体Fab组合文库。并以人血小板膜蛋白包被 96孔板 ,对抗体库进行 3轮吸附 洗脱 扩增的亲和选择 ,获得与人血小板膜抗原结合的噬菌体抗体 (Fab片段 )库。结果　半巢式PCR有效地扩增出重链Fd和κ轻链基因 ,以此构建了噬菌体呈现文库。通过特异性筛选 ,获得可与人血小板特异结合的Fab噬菌体抗体次级库。结论　构建的人抗体组合文库通过筛选得到与人血小板特异结合的噬菌体抗体 (Fab片段 )次级库。其对抗血小板抗体药物研究、与血小板相关抗体有关的疾病研究、血小板血型抗原表位研究、进而进行血小板血型分型研究等 ,都有重要意义     

鼠抗人肥大细胞类糜蛋白酶N端片段抗体的制备与鉴定

目的:在大肠杆菌中表达人肥大细胞类糜蛋白酶(hMCC)N端片段(hMCC-N),并制备其鼠源性多克隆抗体。方法:通过PCR法扩增hMCC-N端基因片段,将其克隆至pMAL-c2x原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达,通过Amylose树脂亲和层析纯化目的蛋白,以纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备鼠抗hMCC-N端片段多克隆抗体,并以间接ELISA测定抗体效价,以Westernblot鉴定抗体的特异性。结果:PCR扩增得到360bp的hMCC-N端基因片段,克隆入表达载体pMAL-c2x,构建了与标签蛋白麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体pMAL-c2x/hMCC-N,融合蛋白在大肠杆菌中得到了稳定表达,并经亲和层析,纯化出可溶性的重组蛋白,用其免疫小鼠,获取了鼠抗hMCC-N端片段的多克隆抗体,ELISA结果显示效价达1∶12800,Westernblot分析表明该抗体能特异结合hMCC。结论:成功地制备了效价高、特异性较强鼠抗hMCC-N端片段抗体,为进一步建立hMCC的ELISA检测方法打下了良好的基础。     

肌肉萎缩与过氧化体增殖活化受体辅γ助活化因子1α的关系

背景:过氧化体增殖活化受体γ 辅助活化因子1α(peroxisome proliferator-activated receptorγ coactivator 1α,PGC-1α)能调节骨骼肌的功能,包括有:线粒体的生物发生、底物氧化和肌纤维类型等,最近还有研究发现PGC-1α 能够预防肌肉的萎缩.目的:总结并讨论PGC-1α 与肌肉萎缩之间的关系.方法:由第一作者用计算机检索中国期刊全文数据库(CNKI:2000/2010)和Medline 数据库(2000/2010),关键词分别为"肌肉萎缩,PGC-1α,运动"和"muscle atrophy,PGC-1α,exercise".共检索到56 篇文章,按纳入和排除标准对文献进行筛选,共纳入22 篇文章.从PGC-1α 与肌肉萎缩、运动与PGC-1α 共2 个方面进行总结.结果与结论:PGC-1α 表达增强能提高线粒体功能、人体的运动能力、降低氧化应激和抑制肌肉萎缩特异性基因的表达.说明运动可通过调节PGC-1α 的表达来干预肌肉萎缩.     

解脲支原体1型MB抗原保守区基因片段的克隆、表达及纯化

目的 以解脲支原体1型培养液为模板，PER获得其MB抗原保守区部分基因，进行体外表达和纯化。方法用ExPasy网上软件Protscale分析Uu14个血清型的MB蛋白结构特点及抗原特性，选定14个血清型均在该蛋白同一保守区域有较好的抗原性，针对该序列设计特异性引物，并以UU血清1型DNA为模板进行PER，获得其MB抗原基因相应的片断，克隆入表达载体经测序鉴定后。在大肠杆菌中表达并纯化，以Western—blot鉴定表达产物。结果 准确扩增了解脲支原体1型MB抗原保守区基因片段，并在大肠杆菌中获得表达。结论 成功构建了pQE30／MB抗原部分保守序列的原核表达载体，在体外成功表达并纯化。表达和纯化的产物具有免疫反应性。     

GST-IRS-4原核表达载体的构建、表达及抗GST-IRS4多克隆抗体的制备

目的:在大肠杆菌中表达胰岛素抵抗受体底物-4(insulinreceptorsubstrate4,IRS4)与谷胱甘肽-S转移酶的融合蛋白,并制备抗IRS4的多克隆抗体(pAb)。方法:从肝癌细胞系HepG2提取总RNA,用RT-PCR扩增出IRS4PTB结构域的cDNA,克隆入表达载体pGEX-Teasy中,重组载体酶切鉴定后,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-IRS4蛋白,SDS-PAGE分析表达产物,包涵体经变性复性后,通过亲和层吸法纯化表达的GST-IRS4融合蛋白,并以此为抗原制备pAb。Westernblot检测重组抗原的免疫活性。结果:酶切及测序鉴定证明,IRS4基因已正确插入到pGEX-Teasy中,经IPTG诱导后,表达出相对分子量为44ku的融合蛋白。用Westernblot鉴定所制备的多克隆抗体可以与IRS4特异性结合。结论:IRS4片段在大肠杆菌中的成功表达及制备得到多克隆抗体,为检测IRS4及其在其他组织中的表达,进一步研究磷酸化酪氨酸结合结构域(PTB)的结构和生物学功能奠定基础。     

人天然噬菌体抗体库的构建及抗gp96抗体的初步筛选

目的 构建人天然Fab段抗体库,并用从膀胱尿路上皮癌组织中提取纯化的gp96筛选抗gp96特异性抗体,为恶性肿瘤的免疫治疗提供新方法 .方法 取4个健康献血员新鲜血液各200 ml,分离淋巴细胞,提取总RNA,经逆转录合成cDNA,设计多对引物,以PCR扩增抗体轻链和重链Fd段cDNA.轻链PCR产物和噬粒载体pComb3经Sac Ⅰ和Xba Ⅰ酶切,由T4 DNA连接酶连接,电穿孔转化感受态大肠杆菌XL1-Blue,扩增后提取噬粒,构建轻链库.轻链库和重链Fd段PCR产物经Xho Ⅰ和Spe Ⅰ酶切,以同样方法 连接后转化XL1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM13,产生噬菌体抗体全库.提取噬粒酶切鉴定轻链库和全库有无插入片段.分别以噬菌体全库和提取的噬粒为模板,以轻、重链不同引物组合进行PCR扩增.应用亲和层析和离子交换层析从膀胱癌组织中提取纯化gp96,并以此为抗原对构建的抗体库进行3轮筛选.结果 提取的淋巴细胞总RNA及逆转录合成的cDNA质量好,部分重链Fd片段、部分κ轻链和λ轻链cDNA得到扩增.Fab全库库容达6.6×106,酶切和PCR显示有插入片段.用从膀胱尿路上皮癌组织中提取出的gp96进行3轮筛选,抗体库得到68倍的富集.结论 本研究构建的人天然Fab段噬菌体抗体库可为进一步筛选特异性抗体、肿瘤免疫治疗打下基础.     

抗CD133单链抗体/白喉毒素DAB389融合蛋白的基因构建、表达、纯化及鉴定

目的构建抗CD133单链抗体(scFV)/白喉毒素DAB389融合蛋白,在大肠杆菌里表达,并鉴定及纯化。方法采用PCR的方法,扩增融合基因DAB389-Linker-CD133(scFV),并插入到原核表达载体pET28a中,构建了重组表达载体pET28a-DAB389-CD133,融合蛋白在BL21(DE3)中表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定,通过Ni柱纯化目的蛋白,获得了纯度达95%的DAB389-Linker--CD133(scFV)融合蛋白。Western blot鉴定蛋白活性。流式细胞仪检测能否与CD133抗原特异性结合。结果扩增的片段与理论值一致,序列分析正确;纯化得到纯度为95%的重组蛋白。Western blot分析能特异性地与抗白喉抗体结合。流式细胞仪检测能与CD133抗原特异性结合。结论成功构建了抗CD133单链抗体(scFV)/白喉毒素DAB389融合蛋白,具有结合抗原和免疫毒素双重活性,为进一步靶向治疗奠定了基础。