真核表达载体pIRES2-EGFP-PDLIM2的构建及在EJ细胞中的表达

背景：核因子κB在肿瘤生成过程中起重要作用,PDLIM2基因可以介导终止核因子κB的活性,解除核因子κB对肿瘤细胞的凋亡抑制作用。目的：克隆人PDLIM2全长基因,构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。方法：采用反转录-聚合酶链反应从新鲜膀胱组织总RNA中克隆PDLIM2全长基因,与经BamHI、XhoⅠ相同双酶切的pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组质粒pIRES2-EGFP-PDLIM2,经酶切及测序鉴定重组质粒中PDLIM2基因的完整性和忠实性。荧光显微镜下观察重组质粒转染的EJ细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞PDLIM2的表达进行RT-PCR检测。结果与结论：经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的EJ细胞中获得PDLIM2的高效表达。表明用反转录-聚合酶链反应方法成功从膀胱组织中克隆出PDLIM2全长基因,成功构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP-2）是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07／2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。材料：pcDNA3．1（＋）载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录．聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM．T-hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5n后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3．1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP．2的表达。主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM．T-hBMP-2和pcDNA3．1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1．2kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3．1-hBMP-2构建正确；该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

构建真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3及其在脐血CD34+细胞中的表达

目的构建真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3配体,为研究Flt3配体对急性放射复合伤造血功能恢复作用提供实验物质基础.方法实验于2003-05/09在第三军医大学劳动卫生教研室完成.先用SalⅠ和BglⅡ双酶切pUMVC3-hFLT3配体,得到全长的人FLT3配体序列(0.8kb),两端抹平后克隆至pIRES2-EGFP载体的BglⅡ位点.然后用NheⅠ和XhoⅠ酶切鉴定;最后用脂质体转染的方法将重组质粒转入脐血CD34+细胞中,经过G418筛选,在荧光显微镜下观察其表达.结果①构建了双顺反子真核表达载体pIRES2-EGFP-FLT3.②重组质粒pIRES2-EGFP-FLT3能在脐血CD34+细胞中的表达,凝胶电泳和测序结果证明将FLT3 cDNA亚克隆入pIRES2-EGFP内,荧光显微镜下可见脐血CD34+细胞胞体发出绿色荧光.③转染效率为10.3%.结论①携带标记基因的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3能稳定地转入真核细胞表达载体.②该质粒转染到分离纯化的脐血CD34+细胞中,并获得阳性转染细胞的克隆.     

构建真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3及其在脐血CD34^＋细胞中的表达

目的：构建真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3配体,为研究Flt3配体对急性放射复合伤造血功能恢复作用提供实验物质基础.方法：实验于2003-05/09在第三军医大学劳动卫生教研室完成.先用SalⅠ和BglⅡ双酶切pUMVC3-hFLT3配体,得到全长的人FLT3配体序列（0.8kb）,两端抹平后克隆至pIRES2-EGFP载体的BglⅡ位点.然后用NheⅠ和XhoⅠ酶切鉴定;最后用脂质体转染的方法将重组质粒转入脐血CD34^＋细胞中,经过G418筛选,在荧光显微镜下观察其表达.结果：①构建了双顺反子真核表达载体pIRES2-EGFP-FLT3.②重组质粒pIRES2-EGFP-FLT3能在脐血CD34^＋细胞中的表达,凝胶电泳和测序结果证明将FLT3 cDNA亚克隆入pIRES2-EGFP内,荧光显微镜下可见脐血CD34^＋细胞胞体发出绿色荧光.③转染效率为10.3%.结论：①携带标记基因的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3能稳定地转入真核细胞表达载体.②该质粒转染到分离纯化的脐血CD34^＋细胞中,并获得阳性转染细胞的克隆.     

利用基因工程技术构建重组人血小板因子4真核表达载体

目的:构建携带绿色荧光蛋白标签的重组人血小板因子4基因(plateletfactor4,PF4)的真核表达载体,并在真核细胞中表达,为研究其生物学功能奠定基础。方法:人工合成PF4基因模板,通过PCR方法扩增PF4-cDNA,然后克隆至pUC19克隆载体,经序列测定后重组入pIRES2-EGFP真核表达载体并进行酶切鉴定。将鉴定正确的质粒用脂质体转染法瞬式转染至COS7细胞中。结果:获得了PF4-cDNA基因,序列分析表明,该序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒酶切鉴定表明,PF4基因已与pIRES2-EGFP真核表达载体正确连接。荧光显微镜示,此载体成功转染至COS7细胞中,并获得有效表达。结论:利用基因工程技术,成功的构建了携带绿色荧光蛋白标签的PF4的真核表达载体,并在真核细胞中获得有效表达,为下一步研究其在真核细胞中的生物学功能奠定基础。     

利用基因工程技术构建重组人血小板因子4真核表达载体

目的：构建携带绿色荧光蛋白标签的重组人血小板因子4基因(plateletfactor4，PF4)的真核表达载体，并在真核细胞中表达，为研究其生物学功能奠定基础。方法：人工合成PF4基因模板，通过PCR方法扩增PF4-cDNA，然后克隆至pUCl9克隆载体，经序列测定后重组入pIRES2-EGFP真核表达载体并进行酶切鉴定。将鉴定正确的质粒用脂质体转染法瞬式转染至COS7细胞中。结果：获得了PF4-cDNA基因，序列分析表明，该序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒酶切鉴定表明，PF4基因已与pIRES2-EGFP真核表达载体正确连接。荧光显微镜示，此载体成功转染至COS7细胞中。并获得有效表达。结论：利用基因工程技术，成功的构建了携带绿色荧光蛋白标签的PF4的真核表达载体，并在真核细胞中获得有效表达，为下一步研究其在真核细胞中的生物学功能奠定基础。     

大鼠成纤维细胞生长因子2分子克隆及其真核表达载体的构建

目的:实验旨在克隆大鼠成纤维细胞生长因子2CDS区基因全长,并将其于真核表达载体PIRES2-EGFP相连接,构建成纤维细胞生长因子2的真核表达载体.方法:实验于2007-03/06在苏州大学生物技术研究所完成.①实验材料:克隆载体PMD18-T-vector(takara):真核表达载体PIRES2-EGFP由苏州大学第一附属医院消化科叶建新博士惠赠:大肠杆菌TOP10购自英俊公司:清洁级新生一两天SD大鼠2只.②实验过程及评估:体外分离培养新生SD大鼠心室肌细胞.Trizol法抽提心室肌细胞总mRNA,采用反转录-聚合酶链反应的方法反转录获得总的cDNA,聚合酶链反应的方法扩增成纤维细胞生长因子2基因的CDS区片断全长.将扩增出来的基因片断和克隆载体PMD18-T-vector连接,转化TOP10感受态细菌,阳性克隆经电泳,质粒聚合酶链反应和酶切等鉴定正确后送去测序确认.测序正确后抽重组质粒,bgl Ⅱ和pst Ⅰ同时双酶切PMD18-T-FGF-2和PIRES2-EGFP,将切下的目的基因片段和线性PIRES2-EGFP空质粒载体在T4DNA连接酶作用下进行连接,构建其真核表达载体.结果:①成功培养出了形态典型的SD大鼠的心室肌细胞.②所获的大鼠成纤维细胞生长因子2DNA序列与GeneBank中收录的大鼠成纤维细胞生长因子2序列完全一致.③PIRES2-EGFP-bFGF真核表达载体的构建测序表明,成纤维生长因子2成功插入真核表达载体PIRES2-EGFP之中.结论:实验成功克隆了大鼠成纤维细胞生长因子2基因全长,并构建了其真核表达载体.为转基因细胞制备和移植治疗心肌梗死奠定基础.     

人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒的构建及体外表达

目的:构建人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒。方法:实验于2005-03/2005-10在华中科技大学同济医学院公共实验平台完成。①通过聚合酶链反应对pcDNA3.1-BMP2及pUC-CAGGS-VEGF165的目的基因片段亚克隆并引入新的酶切位点,将其分别定向连入真核双表达载体pIRES,构建同时表达两个目的基因的双顺反子,通过聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定鉴定重组质粒。②重组质粒经脂质体介导体外转染小鼠骨髓基质细胞,通过反转录-聚合酶链反应检测骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165mRNA的表达。结果:①pIRES-BMP2-VEGF165双基因表达质粒的构建和鉴定:将重组质粒pIRES-BMP2-VEGF165分别作XhoI/MluI和XbaI/NotI双酶切,经10g/L琼脂糖凝胶电泳可见1.2kbp的人骨形成蛋白2条带和592bp的血管内皮生长因子165条带,酶切条带与聚合酶链反应产物电泳带处于相同位置。经聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定证实,目的基因插入片段方向正确,DNA序列无突变。②骨形成蛋白2、血管内皮生长因子165mRNA的表达:以转染pIRES空质粒为阴性对照,48h后提取转染细胞的RNA分别用P1,P2和P3,P4作为引物进行反转录-聚合酶链反应。结果表明转染pIRES-BMP2-VEGF165的小鼠骨髓基质细胞扩增出1.2kbp及592bp两条带。证实该重组质粒能在体外同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165mRNA。结论:成功构建了可同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165的双基因真核表达质粒,为进行联合基因治疗骨缺损的实验研究奠定了基础。     

构建血红素氧合酶1基因真核表达质粒及在大鼠主动脉平滑肌细胞中的表达

目的：克隆血红素氧合酶1基因并构建其真核表达重组质粒，进一步检测血红素氧合酶1基因转染大鼠主动脉平滑肌细胞及其表达目的蛋白的效果。 方法：实验于2007-02／12在泸州医学院中心试验室完成。取雄性健康成年SD大鼠1只，腹腔注射氯化汞（1mg／kg）24h后，麻醉状态下取肾脏，从大鼠肾组织中提取总RNA，通过反转录-聚合酶链反应扩增大鼠血红素氧合酶1基因片段，并将其克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，运用脂质体将重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1转染主动脉平滑肌细胞，通过反转录-聚合酶链反应和Western blot分析血红素氧合酶1基因细胞转染及表达的效果。 结果：经双酶切及测序鉴定证明，正确克隆了血红素氧合酶1基因并成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。反转录-聚合酶链反应及Western blot分析显示血红素氧合酶1基因能成功转染主动脉平滑肌细胞并在mRNA水平和蛋白水平有效表达。 结论：①成功构建血红素氧合酶1基因真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。②脂质体包裹重组质粒瞬时成功转染到体外培养的主动脉平滑肌细胞并得到有效表达。     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。     

pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

背景:骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增,还易于外源基因的转入及表达,在人类医学上被认为是一种理想的治疗性细胞和基因治疗中的靶细胞.目的:探讨脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其基因的表达.设计:单一样本观察.单位:大连市干细胞与组织工程研发中心,大连医科大学基础医学院生化室.材料:实验于2006-03/2007-06在大连市干细胞与组织工程研发中心及大连医科大学基础医学院生化室完成.新西兰大白耳兔,5月龄,雌雄不拘,体质量2.0～2.5 kg.方法:以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板,用PCR方法获得目的基因片段,定向克隆至载体pMD19-T,限制性内切酶消化鉴定、基因测序后,构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒.同时对兔骨髓间充质干细胞取材、培养、鉴定.真核表达质粒经酶切鉴定后,采用Lipofectamine 2000介导法转染经过鉴定的兔骨髓间充质干细胞.并于转染后24 h 在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.主要观察指标:表达载体的构建及基因转染骨髓间充质干细胞鉴定.结果:实验克隆出胞嘧啶脱氨酶基因,并将其与带荧光的真核表达载体pIRES2-AcGFP1连接.经转染兔骨髓间充质干细胞24 h 后,在倒置荧光显微镜488 nm 蓝光激发下观察,pIRES2-AcGFP1-CD组和pIRES2-AcGFP1空载体组均可见细胞发出绿色荧光,未经转染的细胞未见发出绿色荧光,说明胞嘧啶脱氨酶基因成功转染了骨髓间充质干细胞.结论:骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体.     

人脑源性神经营养因子和神经营养素3真核双表达载体的构建与鉴定

背景：脑源性神经营养因子（brain-derived ;neurotrophic factor,BDNF）和神经营养素3（Neurotrophines-3,NT-3）在细胞分化过程中有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。目的：构建双基因共表达载体pIRES 2-BDNF-NT-3并对其进行鉴定。方法： BDNF和NT-3基因核心序列是通过直接PCR的方法从外周血单个核细胞的基因组DNA中获取。然后将BDNF的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建pIRES2-BDNF-EGFP载体,随后将NT-3 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-BDNF-EGFP中,最后构建成为含有内部核糖体进入位点（IRES）的pIRES2-BDNF-NT-3双基因共表达载体。实验通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达。 结果与结论：DNA测序显示,提取的BDNF和NT-3均与基因库报道序列一致。构建的pIRES 2-BDNF-NT-3双基因共表达载体经Eco RⅠ/Bam HⅠ切出BDNF条带,经Bam HⅠ/NotⅠ双酶切后切出IRES-NT-3片段,经Eco RⅠ/NotⅠ双酶切后切出BDNF-IRES-NT-3片段。RT-PCR与Western-blot方法检测显示,此载体转染后的HEK293细胞均能表达BDNF和NT-3 mRNA和蛋白。结果证实,实验成功采用IRES序列构建了能分别表达的 BDNF 和 NT-3双基因真核表达载体。     

人同源盒基因HoxB4真核表达载体的构建及鉴定

本研究旨在构建人同源盒基因HoxB4真核表达载体并进行鉴定,为进一步研究HoxB4的作用提供物质基础。采用RT-PCR的方法从健康产妇脐血单个核细胞中扩增出该基因,并将HoxB4的PCR产物用EcoRI和BamHI双酶切后连接到用EcoRI和BamHI双酶切的带有EGFP编码序列和内部核糖体转入位点(IRES)的真核表达载体pIRES2-EGFP中,重组质粒在大肠杆菌DH5α内扩增后,对其进行双酶切及测序鉴定以证实载体构建成功。结果表明,双酶切和质粒测序结果证明HoxB4基因正确的连接到真核表达载体pIRES2-EGFP中,开放阅读框架正确,pIRES2-EGFP/HoxB4真核表达载体构建成功。结论 :利用PCR,DNA重组等分子生物学技术,成功构建了pIRES2-EGFP/HoxB4真核表达载体,为探讨HoxB4基因在造血干细胞的增殖和分化的调控功能提供了实验基础。     

pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

背景：骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入及表达，在人类医学上被认为是一种理想的治疗性细胞和基因治疗中的靶细胞。 目的：探讨脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其基因的表达。 设计：单一样本观察。 单位：大连市干细胞与组织工程研发中心，大连医科大学基础医学院生化室。 材料：实验于2006—03／2007—06在大连市干细胞与组织工程研发中心及大连医科大学基础医学院生化室完成。新西兰大白耳兔，5月龄，雌雄不拘，体质量2．0～2．5kg。 方法：以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，用PCR方法获得目的基因片段，定向克隆至载体pMD19-T，限制性内切酶消化鉴定、基因测序后，构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒。同时对兔骨髓间充质干细胞取材、培养、鉴定。真核表达质粒经酶切鉴定后，采用Lipofectamine2000介导法转染经过鉴定的兔骨髓间充质干细胞。并于转染后24h在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。主要观察指标：表达载体的构建及基因转染骨髓间充质干细胞鉴定。 结果：实验克隆出胞嘧啶脱氨酶基因，并将其与带荧光的真核表达载体pIRES2-AcGFP1连接。经转染兔骨髓间充质干细胞24h后，在倒置荧光显微镜488am蓝光激发下观察，pIRES2-AcGFP1-CD组和pIRES2-AcGFP1空载体组均可见细胞发出绿色荧光，未经转染的细胞未见发出绿色荧光，说明胞嘧啶脱氨酶基因成功转染了骨髓间充质干细胞。 结论：骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体。     

纳米载体介导人胰岛素样生长因子1基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达

目的：构建增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced-green fluorescent protein，EGFP）标记的人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor，hIGF-1）真核表达载体，转染至兔骨髓间充质干细胞，为组织工程关节软骨的构建提供基因改良的种子细胞。方法：实验于2005—03／2006—01在重庆医科大学儿科研究所完成。根据GeneBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物，从质粒pcDNA3．1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1，亚克隆至pMD-T18载体，测序鉴定后酶切出目的基因片段并插入pIRES2-EGFP中，构建成真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，经PCR及双酶切鉴定正确后用非病毒类纳米材料基因转移载体PAMAM-D介导转入兔骨髓间充质干细胞，通过荧光观察、流式细胞仪、RT-PCR等方法从各个水平检测hIGF-1在细胞的表达。结果：成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因标记的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，并检测到目的基因hIGF-1在兔骨髓间充质干细胞的理想表达。结论：新型纳米材料PAMAM-D是高效、简便、表达持久的基因转染方法，经IGF-1基因修饰的骨髓间充质干细胞是软骨组织工程种子细胞的理想选择。     

人骨唾液蛋白非融合荧光蛋白载体的构建及在乳腺癌细胞中的表达

背景人骨唾液蛋白基因在矿化组织以外的易发生骨转移的人乳腺癌中表达.临床观察显示骨转移处的乳腺癌细胞骨唾液蛋白的表达量要高于原发部位的乳腺癌细胞,因此骨唾液蛋白有可能与肿瘤特异性骨转移的关系密切.研究乳腺癌骨转移可为将来临床的预防和治疗提供新的药物靶点.目的建立骨唾液蛋白的稳定表达乳腺癌细胞系,观察骨唾液蛋白在乳腺癌骨转移的整个过程中的作用.设计对照实验.单位华南理工大学生物科学与工程学院,解放军广州军区广州总医院医学实验中心.材料实验于2003-11/2004-03在解放军广州军区广州总医院医学实验室完成.质粒、菌种和细胞pIRES2-EGFP载体质粒,E.Coli.Top10、含有人骨唾液蛋白基因全长的克隆载体pB-hBSP和发生特异性骨转移以及脑转移的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231BO和MDA-MB-231BR.方法将人骨唾液蛋白基因通过聚合酶链式反应的方法从构建好的pB-hBSP载体中亚克隆出来,在其5'和3'端分别引入BglⅡ和Pst Ⅰ限制性酶切位点,定向克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP,构建重组载体pIRES2-hBSP-EGFP.利用脂质体转染的方法将构建好的重组质粒转入特异性脑转移和骨转移的乳腺癌细胞株MDA-MB-231BR和MDA-MB-231BO中.主要观察指标pIRES2-hBSP-EGFP重组表达载体的构建.重组表达载体pIRES2-hBSP-EGFP转染乳腺癌细胞.结果①成功构建人骨唾液蛋白和绿色荧光蛋白非融合表达的真核表达载体pIRES2-hBSP-EGFP.②成功转染特异骨转移和脑转移的乳腺癌细胞株,可在荧光显微镜下观察到荧光蛋白标记,人骨唾液蛋白得到相应表达.结论真核表达载体pIRES2-hBSP-EGFP的构建及转染可为骨唾液蛋白在乳腺癌骨转移中的作用的体内、外研究奠定一定的基础.     

pcDNA3/BDNF真核表达载体的构建

背景：脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）作用广泛,但属于生物大分子,不能通过血脑屏障。基因治疗是目前解决脑源性神经营养因子给药途径最有希望的方案。目的：拟构建大鼠脑源性神经营养因子基因真核表达载体。方法：采用反转录聚合酶链式反应技术从SD大鼠脑组织提取总RNA,扩增脑源性神经营养因子基因cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,分别取10g质粒pcDNA3和纯化的目的基因分别进行EcoRⅠ、xhoⅠ双酶切。将目的基因片段和pcDNA3载体连接,转入感受态DH5α细胞中,经酶切鉴定后送上海博亚生物技术有限公司测序。结果与结论：RT-PCR产物为749bp的特异片段,重组质粒pcDNA3/BDNF酶切后产生749bp和5446bp的片段,DNA测序证实749bp片段的碱基序列与大鼠脑源性神经营养因子基因序列完全一致,成功构建了pcDNA3/BDNF重组质粒。