海藻酸钠复合载体长期培养软骨细胞的生物学稳定性

背景：近年研究发现在海藻酸钠三维培养体系中软骨细胞存活时间延长,细胞外基质分泌旺盛。目的：观察海藻酸钠复合载体对体外长期培养软骨细胞生物学稳定性的影响。方法：将兔软骨细胞接种至以海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖、纤维连接蛋白、碱性成纤维细胞生长因子为主要成分的复合载体三维培养体系中,以平面培养作为对照。定期观察在两种不同培养体系中软骨细胞形态学改变,细胞生长曲线差异,细胞上清液糖胺多糖含量差异。结果与结论：软骨细胞在海藻酸钠复合载体中生长良好,生长旺盛,并形成球状细胞团,细胞分裂增殖活跃;培养2d时复合载体培养软骨细胞增殖稍高于平面培养软骨细胞;培养4d时可见复合载体培养软骨细胞增殖明显加快;培养6~14d时复合载体培养的仍保持较稳定增殖,而平面培养的软骨细胞增殖逐渐降低;复合载体细胞外液糖胺多糖含量明显高于平面培养软骨细胞。说明海藻酸钠复合载体可以长期培养软骨细胞并保持其生物学稳定性。     

海藻酸钠载体中成年兔关节软骨细胞生长情况

目的:软骨细胞单层培养条件下增殖较快,但极易失分化,在生物载体材料构成的立体环境中培养,则能较好的维持表型。实验以海藻酸钠为载体,观察兔关节软骨细表型及增殖情况。方法:实验于2005-09/2006-12在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。①实验动物和材料:6月龄新西兰大白兔24只,雌雄各半。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。海藻酸钠由青岛明月海藻公司提供。②实验方法:以培养液配制的0.4% Pronease酶、0.025%Ⅱ型胶原酶顺序消化兔软骨分离细胞,以4×109 L-1海藻酸钠的浓度制成细胞悬液。③实验评估:倒置显微镜观察细胞在海藻酸钠中的形态及增殖情况,检测细胞收获效率和存活率。苏木精-伊红染色和AB-PAS染色观察软骨细胞的生长情况及评价软骨分泌胶原的情况。免疫组织化学定性观察Ⅱ型胶原的含量变化及有无Ⅰ型胶原的产生。Alcian blue染色法测定细胞盘中蛋白多糖的含量变化。结果:①软骨经两步酶消化软骨基质逐步解离和降解,细胞被完全分离,消化分离的软骨细胞总数达到5×106,细胞成活率达95.5%。②软骨细胞与海藻酸钠复合后体外培养,细胞生长旺盛、增殖活跃,增殖成株状或岛状,株状细胞团周围有类似的软骨陷窝形成,细胞排列密集,核圆形。③Ⅱ型胶原免疫组化和AB-PAS染色均呈阳性,细胞盘中蛋白多糖含量随培养时间延长逐渐增加。结论:海藻酸钠凝胶能与软骨细胞完全嵌合,是一种良好的软骨组织工程材料。     

藻酸钙凝胶为载体体外短期培养羊软骨细胞的生物学性状

目的：观察以海藻酸钠为载体的成年羊软骨细胞移植前体外短期培养的生物学性状。方法：实验于2004-07／2005-11在解放军总医院骨科研究所完成。①取成年山羊关节软骨，酶消化法得到原代软骨细胞，体外培养扩增，选用培养的第2，3代羊关节软骨细胞与12g／L海藻酸钠混合，种植密度为2&;#215;10^9L^-1，将102mmol／L氯化钙溶液滴入软骨细胞藻酸钠悬液，形成藻酸钙软骨细胞凝胶，用软骨细胞培养液培养。②3，6，9，12d分别取凝胶，测定DNA、蛋白聚糖含量，并行苏木精-伊红、藩红花O染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果：①藻酸钙凝胶中细胞的光镜形态学观察：软骨细胞在藻酸钙中呈丛状或球状生长，细胞在整个培养过程维持球形状态。②复合软骨细胞的藻酸钙凝胶的组织形态学及免疫组化测定结果：木精-伊红染色可见随培养时间的延长，细胞群增多变大；藩红花0染色显示软骨细胞周围存在不断增大的橙红染区，提示软骨细胞分泌蛋白聚糖含量持续增加。Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。③软骨细胞藻酸钙凝胶培养过程中DNA及蛋白聚糖含量的测定：随时间的延长，DNA的量逐渐增加，说明藻酸钙中的软骨细胞在不断增殖。藻酸钙中软骨细胞分泌的特异性基质蛋白聚糖随时间的延长而增多，象征着软骨细胞表型的稳定。结论：成年羊软骨细胞在藻酸钙中短期培养生长增殖良好，藻酸钙能保留羊软骨细胞表型，具备植入体内的条件。     

藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞

目的 观察胎儿关节软骨细胞在藻酸钙微载体培养中的特征，探计用藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞的优缺点。方法 用藻酸钙微载体和体外单层培养法培养胎儿关节软骨细胞，观察细胞形态学变化，测定细胞数量变化及其生长曲线，观察细胞增殖；借助免疫组织化学的方法了解细胞Ⅱ型胶原的合成情况。结果 体外单层培养的胎儿关节软骨细胞传至第5代已出现明显的反分化，多数细胞变为成纤维细胞状，合成Ⅱ型胶原的能力明显减弱；而用藻酸钙微载体培养的软骨细胞3个月后仍瓮中保持有旺盛的合成Ⅱ型胶原的能力。结论 用藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞可较长时间保持其表型及合成基质能力，防止反分化的发生。     

人胎关节软骨细胞体外培养的生物学特性

目的:研究软骨组织工程中传代软骨细胞与原代的差异。方法:用5个月人胎关节软骨分离培养细胞,观察细胞存活率、贴壁率、生长曲线和组织形态学的改变。结果:(1)软骨块在4℃下,3d 内细胞存活率可达 93.4％～97.6％。(2)原代细胞为圆形或三角形;第4代有一半转变成梭形,到第6代全部变为长梭形。(3)传代细胞贴壁时间(2～3h)短于原代(4～7h)。玻璃瓶内贴壁率传代细胞为78.7％～85.5％,原代8.8％。(4)生长曲线表明,从原代到第4代都有高增殖力;到第8代时增殖降低;到第12代几乎丧失细胞增殖。结论:软骨块4℃冷藏,3d内对细胞存活率无明显影响。第4代细胞贴壁快、增殖快,适于作为组织工程用细胞。第8代以后不适合。     

冻存复苏培养的人鼻中隔软骨细胞生物学特性观察

目的：观察冻存复苏过程对人鼻中隔软骨细胞生物学特性的影响。方法：体外培养人鼻中隔软骨细胞，对冻存1周组、1个月组、3个月组和新鲜制备组的软骨细胞进行倒置相差显微镜动态观察、甲苯胺蓝异染和Ⅱ型胶原的免疫组化染色，并测定”S-Na2SO4掺入量以观察对软骨细胞蛋白多糖合成量的影响，在细胞表型和功能方面进行比较。结果：各组间软骨细胞的生长过程、特殊染色无明显差别，蛋白多糖合成量(^35S-Na2SO4掺入量)测定值为(3.2&;#177;0.24)&;#215;10^3dpm／ug DNA，统计分析其差异无显著性意义(F=0.6，P&;gt;0.05)。各组间细胞存活率差异没有显著性意义(F=2．1．P&;gt;0．05)。结论：冻存复苏的人鼻中隔软骨细胞保持了其生物特性，且冻存时间长短对冻存的软骨细胞存活率无显著影响。     

藻酸钙凝胶为载体体外短期培养羊软骨细胞的生物学性状

目的:观察以海藻酸钠为载体的成年羊软骨细胞移植前体外短期培养的生物学性状。方法:实验于2004-07/2005-11在解放军总医院骨科研究所完成。①取成年山羊关节软骨,酶消化法得到原代软骨细胞,体外培养扩增,选用培养的第2,3代羊关节软骨细胞与12g/L海藻酸钠混合,种植密度为2×109L-1,将102mmol/L氯化钙溶液滴入软骨细胞藻酸钠悬液,形成藻酸钙软骨细胞凝胶,用软骨细胞培养液培养。②3,6,912d,分别取凝胶,测定DNA、蛋白聚糖含量,并行苏木精-伊红、藩红花O染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果:①藻酸钙凝胶中细胞的光镜形态学观察:软骨细胞在藻酸钙中呈丛状或球状生长,细胞在整个培养过程维持球形状态。②复合软骨细胞的藻酸钙凝胶的组织形态学及免疫组化测定结果:木精-伊红染色可见随培养时间的延长,细胞群增多变大;藩红花O染色显示软骨细胞周围存在不断增大的橙红染区,提示软骨细胞分泌蛋白聚糖含量持续增加。Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。③软骨细胞藻酸钙凝胶培养过程中DNA及蛋白聚糖含量的测定:随时间的延长,DNA的量逐渐增加,说明藻酸钙中的软骨细胞在不断增殖。藻酸钙中软骨细胞分泌的特异性基质蛋白聚糖随时间的延长而增多,象征着软骨细胞表型的稳定。结论:成年羊软骨细胞在藻酸钙中短期培养生长增殖良好,藻酸钙能保留羊软骨细胞表型,具备植入体内的条件。     

藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞

目的观察胎儿关节软骨细胞在藻酸钙微载体培养中的特征,探讨用藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞的优缺点。方法用藻酸钙微载体和体外单层培养法培养胎儿关节软骨细胞,观察细胞形态学变化,测定细胞数量变化及其生长曲线,观察细胞增殖;借助免疫组织化学的方法了解细胞II型胶原的合成情况。结果体外单层培养的胎儿关节软骨细胞传至第5代已出现明显的反分化,多数细胞变为成纤维细胞状,合成II型胶原的能力明显减弱;而用藻酸钙微载体培养的软骨细胞3个月后仍保持有旺盛的合成Ⅱ型胶原的能力。结论用藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞可较长时间保持其表型及合成基质能力,防止反分化的发生。     

冻存复苏培养的人鼻中隔软骨细胞生物学特性观察

目的:观察冻存复苏过程对人鼻中隔软骨细胞生物学特性的影响。方法:体外培养人鼻中隔软骨细胞,对冻存1周组、1个月组、3个月组和新鲜制备组的软骨细胞进行倒置相差显微镜动态观察、甲苯胺蓝异染和Ⅱ型胶原的免疫组化染色,并测定35S-Na2SO4掺入量以观察对软骨细胞蛋白多糖合成量的影响,在细胞表型和功能方面进行比较。结果:各组间软骨细胞的生长过程、特殊染色无明显差别,蛋白多糖合成量(35S-Na2SO4掺入量)测定值为(3.2±0.24)×103dpm/μgDNA,统计分析其差异无显著性意义(F=0.6,P>0.05)。各组间细胞存活率差异没有显著性意义(F=2.1,P>0.05)。结论:冻存复苏的人鼻中隔软骨细胞保持了其生物特性,且冻存时间长短对冻存的软骨细胞存活率无显著影响。     

自体血清与胎牛血清培养兔关节软骨细胞的生物学特性

背景：目前培养软骨细胞多使用胎牛血清。但近年异种血清培养组织向临床应用的安全性受到质疑,因此自体血清培养越来越受到重视。目的：比较体积分数10%兔自体血清与体积分数10%胎牛血清培养兔关节软骨细胞生物学特性的差异。方法：兔自体血清培养液制备后,分离培养兔关节软骨细胞,分别在体积分数10%自体血清和体积分数10%胎牛血清中进行单层传代培养至1,3,5代,采用光镜观察细胞形态变化,绘制生长曲线评估细胞增殖速度,观察甲苯胺蓝染色、Ⅰ,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果,以流式细胞仪分析细胞Ⅰ,Ⅱ型胶原以及CD26,CD44的表达变化。结果与结论：①在细胞形态上自体血清和胎牛血清培养的软骨细胞差异不大。②自体血清培养的软骨细胞较胎牛血清培养的软骨细胞生长速度更快。③甲苯胺蓝染色结果示,无论是自体血清还是胎牛血清所培养的细胞,染色随代龄的增加逐渐变浅,细胞传至第5代时两组几乎均无异染。对于1代和3代细胞而言,自体血清培养的软骨细胞较胎牛血清所培养的软骨细胞较为深染。④Ⅰ型胶原的表达随代数的增加而增加,而Ⅱ型胶原的表达则随代数的增加而减少。在3代时自体血清培养的软骨细胞Ⅰ型胶原的表达水平低于胎牛血清培养的软骨细胞（P〈0.05）;在1代和3代时自体血清培养的软骨细胞Ⅱ型胶原的表达水平高于胎牛血清培养的软骨细胞（P〈0.05）。⑤CD26表达呈现先升高后降低的趋势,而CD44的表达不随传代数的增加而改变。提示同异体体积分数10%的胎牛血清相比,体积分数10%的自体血清培养的兔软骨细胞生长速度快,且在大部分指标上可以较好地保持细胞表型。     

分离扩增肋软骨细胞在三维支架上的种植与培养

背景:外科长段气管切除后,需要应用气管替代物,理想的替代材料需具有相当的强度、可弯曲性以及内面覆盖的上皮.合适的种子细胞、性质优良的载体、良好的生长媒介是组织工程化气管构建中最重要的组成部分.目的:寻找分离培养肋软骨细胞的最佳方法,构建软骨-支架模型.方法:将取出的兔第5,6肋软骨切成组织片,经胰酶、蛋白酶消化或酶处理后贴壁,分离肋软骨细胞并扩增.传代2次后种植于聚乳酸羟基乙酸或涤纶支架上,继续载体外环境下培养.观察单层培养扩增中软骨细胞的形态、结构,及在支架上培养时的细胞生长状态、外分泌基质.结果与结论:酶消化法和组织块培养法所获细胞均为原代肋软骨细胞,单次传代时间为5 d,但组织块培养法分离细胞较慢,且存在成纤维细胞污染情况,提示酶消化法适合用于肋软骨细胞的分离.肋软骨细胞种植于支架后贴附良好,第2周时可见基质分泌,获得软骨-支架模型,可用于构建组织工程化气管.     

藻酸钠复合自体软骨细胞修复猪关节软骨缺损的近期效果

目的:采用藻酸钠自体软骨细胞混合物修复猪的关节软骨缺损,观察近期成骨效应。方法:实验于2004-03/2005-04在中山大学附属第二医院实验中心完成。3个月龄的小型猪8只,取其关节软骨进行细胞原代培养,获取原代细胞后,分别进行免疫组织化学法检测细胞Ⅱ型胶原表达。然后对8只小型猪的32个关节进行动物关节缺损的模型建立,每个关节共造3个人工缺损,选择关节左右随机对照。将已经培养好的软骨细胞与已经配制好并消毒的藻酸钠混合,移植到猪的关节软骨缺损处。每只猪关节内注射3个实验点,1个用藻酸钠/细胞混合液为实验组,1个单纯支架材料为单纯材料对照组,1个缺损做空白对照组,模型中缺损区均为关节负重区,胶原纤维绿色(亮绿复染)。修复所用细胞为自体软骨体外培养后,进行移植修复,采用3代体外培养软骨细胞,均匀混和藻酸钠后,行自体移植。8周后取实验关节进行大体观察、苏木精-伊红染色、Masson染色、免疫组织化学法染色观察及O’driscoll组织学评分。结果:纳入小型猪8只,除其中1例因手术切断伸直肌腱而使猪关节活动障碍,其余均未见手术后关节活动障碍,所有手术无术后感染,无关节内感染,无动物死亡。移植的软骨细胞在藻酸钠载体中生长良好,形成透明软骨。根据O’driscoll组织学评分标准,实验组32个猪关节缺损修复的组织学评分为(20.25±1.64)分,高于单纯材料对照组的(7.46±1.29)分及空白对照组的(6.00±2.09)分。免疫组织化学染色可见修复软骨以表达Ⅱ型胶原为主,无Ⅰ型胶原。结论:藻酸钠复合自体软骨细胞作为软骨移植的替代物是可行的,远期效果还有待进一步研究。     

Effect of sodium alginate on the stability of natural soybean oil body emulsions

In this work, the influence of an anionic polysaccharide, sodium alginate (ALG), on the stability of soybean oil body (OB) emulsions under different environmental conditions, including NaCl, pH and freeze–thaw cycling, was studied by analyzing the particle electric charge, particle size and distribution, and using optical and fluorescence microscopy. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) showed that the proteins on the surface of oil bodies were mainly oleosins. It was found that ALG can be adsorbed to the surface of oil bodies by strong electrostatic interactions at pH 4.5 and the optimal concentration of ALG was 0.35 wt% for 1 wt% OB emulsions. At pH 4–8, ALG-coated OB emulsions were more stable than uncoated OB emulsions with smaller particle size and more uniform size distribution due to the interaction between OB and ALG. The ALG-coated OB emulsions were also all stable against NaCl within the concentration range of 0–250 mM at pH 7 while uncoated OB emulsions aggregated gradually with the increase of NaCl concentration. For OB emulsions with higher concentration of 10–40 wt% which are frequently used in the food industry, the minimal concentration of ALG required to make stable emulsions was found to be 0.5–1 wt%, correspondingly. Coating oil bodies with ALG also significantly improved the stability of natural oil body emulsions against freeze–thaw cycling, which is of great significance to the further development of natural oil body-based products in food industry.

For the first time sodium alginate is used to improve the stability of oil body emulsions against salt, pH and freeze–thaw cycling.     

可注射性材料藻酸钠体外培养幼猪关节软骨细胞及形成组织工程化软骨的能力

目的:观察以藻酸钠为载体体外培养幼猪关节软骨细胞的增殖及形成工程化软骨的能力;评价藻酸钠凝胶作为培养软骨细胞载体的可行性。方法:实验于2003-10/2004-03在中山大学附属第二医院实验中心完成。取3个月龄小型猪膝关节软骨,酶消化法得到高纯度软骨细胞,体外培养3代后与藻酸钠混合,调节软骨细胞密度为5×109L-1,接种于96孔培养板中,每孔接种50μL,25g/L氯化钙溶液凝胶化10min后,DMEM培养基加体积分数为0.1的胎牛血清于96孔培养板中培养。4周后取材观察,行苏木精-伊红染色、Masson染色及免疫组织化学分析,观察软骨细胞形态,Ⅱ型胶原表达及成软骨能力。结果:①单层培养的软骨细胞呈多角形,细胞浆内表达Ⅱ型胶原;藻酸钠与软骨细胞复合后,藻酸钠凝胶材料与透明软骨细胞之间嵌合好。②苏木精-伊红染色见幼猪软骨细胞在海藻酸钠中增殖成株状或岛状;Masson染色见类似软骨陷窝之间胶原被染成绿色,可见细胞周围胶原分泌;免疫组织化学染色见细胞岛及其周围基质呈橘红色,细胞分泌Ⅱ型胶原较多。结论:幼猪软骨细胞在藻酸钠中可良好生长增殖,幼猪软骨细胞和藻酸钠复合可在体外成功构建组织工程化软骨。     

兔关节软骨细胞在藻酸盐串珠中培养维持其表型稳定的研究

目的:软骨细胞在单层培养时,多次传代后细胞表型发生改变。将兔关节软骨细胞在藻酸盐串珠中作立体培养,以保持其特有表型。方法:用酶消化法获取兔关节软骨细胞,分别在普通培养瓶中作贴壁的单层培养,并传代;或制成细胞/藻酸盐悬液,再进一步制成串珠,使细胞在具有三维立体结构的串珠中生长、繁殖。细胞涂片、石蜡切片,爱尔新蓝染色,采用倒置显微镜、透射电镜观察;以RT-PCR方法检测软骨细胞中II型胶原及凝集聚糖mRNA的表达。结果:单层培养时有较高的细胞增殖率,5代以后渐失去软骨细胞特有的表型。立体培养时细胞分泌的基质大部分位于自身的周围,特有表型可长期保持稳定。3个月后藻酸盐串珠中的软骨细胞仍可测得II型胶原和凝集聚糖的表达。结论:软骨细胞在藻酸盐串珠中培养有助于其合成、分泌基质,维持细胞特有表型的稳定。     

自组装短肽水凝胶体外三维培养兔关节软骨细胞

背景:自组装短肽是人工设计合成的一类新型纳米生物材料,与软骨细胞复合培养后如能促进细胞基质的分泌,细胞分裂增殖及细胞表型的维持,将有可能成为一种较理想的细胞支架应用在软骨组织工程中。目的:观察兔关节软骨细胞在纳米自组装短肽KLD-12水凝胶中三维培养的生物学特性。设计、时间及地点:观察性实验,于2007-11/2008-04在四川大学纳米生物医学技术与膜生物学研究所实验室完成。材料:纳米短肽KLD-12序列为:Ac-KLDLKLDLKLDL-CONH2,由上海波泰生物公司合成。方法:取新西兰兔关节软骨,通过酶消化法获取软骨细胞,体外培养2代后以5×109L-1的密度接种于4g/L的自组装短肽KLD-12溶液中,用磷酸盐缓冲液诱导成胶后进行三维培养。主要观察指标:①通过倒置相差显微镜观察软骨细胞在纳米短肽水凝胶中的形态。②用甲苯胺蓝染色,免疫组化检测细胞外基质分泌情况。③反转录-聚合酶链反应检测软骨细胞黏多糖、前Ⅱ型胶原、前Ⅰ型胶原基因的表达情况。结果:①兔关节软骨消化分离的软骨细胞成活率达95%以上。②软骨细胞在纳米短肽水凝胶中体外培养时,细胞生长旺盛、增殖活跃,细胞为圆形聚集成团状或岛状,细胞团周围有类似的软骨陷窝形成。③甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化均呈阳性,细胞基质中黏多糖、Ⅱ型胶原含量随培养时间延长逐渐增加。④反转录-聚合酶链反应结果显示软骨细胞在纳米短肽水凝胶经过3周体外培养一直保持了分泌黏多糖及表达Ⅱ型胶原的能力。结论:自组装短肽KLD-12三维水凝胶能较好维持软骨细胞正常形态、功能和增殖能力。