兔外周血间充质干细胞的分离培养及冻存

目的建立兔外周血间充质干细胞（MSCs）体外分离培养及冻存的方法。方法用密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化兔外周血MSCs，MSCs经液氮冻存半年复苏，观察细胞冻存前后的生长状况，并用台盼蓝法测定其存活率。结果MSCs于体外培养2h开始贴壁生长，细胞形态为梭形、多角形及纺锤状等。传代MSCs变为形态均一、排列有序的长梭形细胞，增殖活跃；MSCs经6mo冻存后复苏培养，台盼蓝法计数存活率达95％以上，细胞形态及生长状况与冻存前无明显差别，均呈长梭形，细胞生长增殖旺盛。结论采用密度梯度离心法和贴壁法可以有效获得应用G-CSF动员后的外周血MSCs，且细胞纯度高，生长增殖活性好，采用液氮冻存MSCs的方法十分有效可行。     

无血清培养基对深低温冻存复苏后的间充质干细胞免疫功能的研究

目的:探讨无血清培养基对冻存后的间充质干细胞（HUC-MSCs）免疫调节功能的影响,明确其成脂成骨生物学特性,为临床应用奠定基础。方法:（1）分离脐带中的HUC-MSCs,传代纯化后深低温冻存。（2）冻融后的HUC-MSCs分别以含10%胎牛血清的培养基（SCM）,无血清培养基两种培养条件培养。（3）观察两组细胞生长状态,革兰染色计数,计算细胞活率。（4）流式细胞术检测两组细胞的表面标志物。（5）成脂成骨诱导,茜红素染色和油红染色观察诱导情况。结果:（1）两组细胞均以漩涡状贴壁,无血清培养基培养的细胞体积略小。（2）在细胞总数及活性方面,两组细胞有些微差异,可忽略不计。（3）流式细胞术显示其对PE-CD34不表达,对PE-CD105、PE-CD90、PE-CD73、PE-CD44和PE-CD29高表达。（4）对无血清培养基（SFM）所培养得到的HUC-MSCs历经约21 d的成骨细胞和脂肪细胞专向分化诱导,发现其具有可媲美SCM培养的HUC-MSCs的分化能力。结论:无血清培养基同有血清培养基相比,对深低温冻存复苏后的间充质干细胞免疫调节功能无明显差异,可替代有血清培养基进行细胞培养。     

苦参碱联合DMSO大规模冻存人胎肝细胞的实验研究

目的 应用苦参碱联合DMSO大规模冻存人胎肝细胞,观察苦参碱对大规模低温冻存人胎肝细胞功能的影响。方法 改良肝细胞获取方法分离人胎肝细胞,经过1h预培养后。将5种不同浓度（1×107,2.5×107,5×107,7.5×107,10×107)的胎肝细胞以6mg/L苦参碱+5%DMSO冻存保护液置于骨髓干细胞冻存袋在液氮中冷冻保存1个月。1个月后复苏,进行活率、形态学及功能检测。结果 五种不同浓度的细胞冻存一月后,细胞浓度为2.5×107/ml组复苏后存活率与其余四组相比差异有统计学意义（P<0.05）且明显高于其余四组。复苏后细胞存活率和24h贴壁率分别为73%、69%,经过短期培养后,细胞功能逐渐恢复。结论 (1苦参碱对低温冻存之人胎肝细胞有保护作用,与二甲基亚砜联合使用可降低后者的浓度;（2）以5%DMSO+6mg/L苦参碱作为冻存保护剂,细胞浓度在2.5×107冻存效果最佳。该大规模冻存方法基本上可以满足生物人工肝肝细胞应用的需求。     

HEK-293细胞复苏培养及冻存

目的通过对人胚肾293细胞的复苏培养及其冻存的研究,为进一步行干细胞标记实验奠定基础。方法复苏培养人胚肾293细胞,倒置显微镜观察人胚肾293细胞的生长状况,计算细胞贴壁率,绘制细胞生长曲线,冻存保留细胞。结果人胚肾293细胞在普通培养条件下生长良好,6h后大部分细胞已经贴壁,8h细胞已完全贴壁。结论人胚肾293细胞采用改进方法复苏培养及冻存是简便可行的,为进一步行干细胞标记实验奠定了坚实的前期基础。     

人脐带华通氏胶间充质干细胞的分离、培养、鉴定及冻存、复苏

目的：探讨从人脐带华通氏胶（Wharton’s jelly,WJ）中分离、培养、鉴定间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）及其冻存、复苏的方法。方法：采用植块法分离、培养间充质干细胞,流式细胞仪检测P3代细胞免疫表型,鉴定其向成骨、成脂方向诱导分化的能力;将P1细胞冻存6个月后复苏,鉴定复苏后细胞的特性。结果：植块法容易从人脐带华通氏胶中获得间充质干细胞;组织块贴壁后6 d可见组织块周围细胞爬出,原代培养14~18 d细胞融合70%~80%;P3代细胞强烈表达CD73、CD90、CD105,不表达CD14、CD34、CD45、CD79a和HLA-DR;成骨诱导分化后10 d,可见明显钙结节;成脂诱导14 d,有明显的脂滴出现,油红O染色阳性。冻存再复苏细胞活力达80%,细胞免疫表型及成骨、成脂诱导显示与冻存前细胞呈相同的特性。结论：组织块培养法可从人脐带华通氏胶中分离、培养出纯度较高间充质干细胞,冻存、复苏不改变其特性。     

家蝇胚胎细胞系MDEC-07114的储存方法

目的探讨家蝇胚胎细胞系(MDEC~07114)的储存方法。方法采用不同的冻存方法储存MDEC~07114,复苏后观察细胞贴壁及生长情况。结果4℃保存1~2个月内,细胞复苏后能贴壁生长。其他4种方法处理后液氮冻存的细胞,复苏后细胞生长状态均较好。结论短期储存可选用4℃保存法;长期保存细胞,用90%胎牛血清冻存液改良液氮冻存法。     

人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的：探讨人脐带华通胶间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及冻存、复苏的方法。方法收集健康足月新生儿脐带组织,采用组织块贴壁法分离、培养脐带间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面抗原,将细胞冻存3个月后复苏,鉴定复苏后细胞的特性。结果组织块贴壁法获得脐带间充质干细胞成功率高;细胞表面高表达CD29、CD44、CD90和CD105,不表达造血干细胞表型CD34、CD45等;冻存后再复苏细胞活性高达80％～90％。结论组织块贴壁法可以从人脐带华通胶中较好的分离、培养出间充质干细胞,为干细胞移植实验研究和临床治疗提供了理想的细胞来源。     

树鼩主动脉内皮细胞株的建立及其生物学特性的研究

将树鼩胸主动脉分层剥离,用组织块贴壁法,体外培养出主动脉内皮细胞,历经一年,传至23代,命名为TSaec-8910。倒置显微镜下细胞单层生长,呈铺路石样镶嵌排列,第Ⅷ因子相关抗原阳性,透射电镜观察,细胞质内未找到Weibel-Palade小体。细胞生长曲线及分裂指数示9～12d汇合成单层,按1:2或1:3传代,传代间隔为lO～14d,细胞冻存复苏后接种存活率为31.5％,细胞染色体检查为二倍体细胞,2n=62,雄性。内皮细胞生长因子、上皮细胞生长因子、条件培养基和附着底物对TSaec-8910细胞有明显影响,细胞在玻璃瓶壁上贴壁时间为24～18h,而在涂有鼠尾胶瓶壁则为4h左右,内皮细胞生长因子、上皮细胞生长因子能促进TSaec-8910细胞贴壁和增殖,20％TSaec-8910细胞条件培养基亦能良好地维持细胞形态。     

VEGF经PI3K-Akt-Bad通路降低冻存后EOCs凋亡率

目的：探讨血管内皮生长因子（VEGF）对低温冻存内皮生长晕细胞（EOCs）凋亡率的影响及其与PI3K-Akt-Bad信号通路的关系,研究VEGF降低低温冻存EOCs凋亡率的可能机制。方法：采用密度梯度离心法分离人脐带血中的单个核细胞,经体外扩增培养EOCs,用免疫细胞化学染色及荧光染色法鉴定细胞的内皮特性。以扩增后的第二代细胞为生物材料,将其分为W组（wortmannin干预24 h后冻存）、W+V组（wortmannin 干预24 h后+50μg/L VEGF冻存）、BC组（空白对照组）、V组（50μg/L VEGF冻存）,于-80 ℃冻存24 h后复苏。用流式细胞术检测EOCs凋亡率,Western blot法检测p-Akt、Bad、Caspase 3的表达量。结果：采用体外扩增培养的EOCs具有多种内皮细胞特性。低温冻存会增加EOCs的凋亡率（为5.36%±0.27%）,但50μg/L VEGF能够降低低温冻存和复苏过程EOCs的凋亡率（为3.36%±0.27%,P＜0.05）;经wortmannin对PI3K特异性抑制后,VEGF对EOCs的保护作用减弱,细胞的凋亡率增加（为8.34%±0.57%,P＜0.05）;加50μg/L VEGF的EOCs冻存细胞p-Akt表达升高而Bad和Caspase 3表达降低（均P＜0.05）,经wortmannin干预24 h后的EOCs冻存细胞p-Akt表达降低而Bad和Caspase 3表达升高（均P＜0.05）。结论：50μg/L VEGF能够降低低温冻存EOCs的凋亡率,其作用可能通过PI3K-Akt-Bad信号通路来实现。     

用培养的大鼠血管内皮细胞建立血管紧张素转换酶体外模型初步研究

目的分离大鼠肺血管及腹主动脉的内皮细胞,建立研究血管紧张素转换酶(ACE)表达的体外模型。方法分离大鼠肺血管内皮细胞采用活体胶原酶灌注法、腹主动脉内皮细胞采用贴壁法;二种方法均用胰酶不完全消化和加入血清或无血清培养相结合的方法得到纯化的内皮细胞。结果肺血管内皮细胞灌注法细胞传代至第4代后其增生速度趋于稳定,内皮细胞纯度达到95%以上,冻存后细胞复苏率(0.816±0.085)和贴壁率(0.758±0.079)均较高、生长良好。腹主动脉内皮细胞贴壁法第4代传代后细胞增生速度较慢,纯度为78%,冻存后传代细胞复苏率为0.724。结论肺血管内皮细胞灌注法分离到的大鼠肺血管内皮细胞,纯度高,可作为进一步研究ACE调控的良好体外模型。     

低温-18℃冷冻保存人肝癌细胞的实验研究

目的：了解低温－１８℃保存人肝癌细胞Ｂｅｌ７４０２回收率,并观察其复苏后培养的形态。方法：采用不同浓度的二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）为冻冻保护剂,直接于－１８℃冰箱中冻存人肝癌细胞株Ｂｅｌ７４０２,于冻存后１周、１个月、２个月和３个月分别取样观察分析。结果：冻存３个月后,台盼蓝拒染存活率〉７０％,置瓶培养后第４天细胞均可贴壁生长、形成克隆。结论：用－１８℃普通冰箱冻存肿瘤细胞效果好,方法简单易行。     

人食管上皮细胞培养、冻存及复苏方法的实验研究

目的比较K-SFM无血清培养基及DMEM有血清培养基在人食管上皮细胞培养中的作用,并比较不同冻存方法对人食管上皮细胞复苏后存活率的影响,探讨适合应用于组织工程食管研究的人食管上皮细胞培养、冻存及复苏方法。方法人食管上皮细胞来源于食管癌患者手术切除的食管。采用组织块法和消化法培养,两种方法均分别加入K-SFM无血清培养基及DMEM有血清培养基。采用直接观察、锥虫蓝染色活力鉴定及细胞计数法绘制细胞生长曲线,对比细胞在不同培养基中的生长情况。分别以两种培养基配制的冻存液进行冻存,复苏后的细胞采用锥虫蓝染色法鉴定其存活率。结果细胞呈典型“铺路石”状排列,免疫组织化学检测细胞角蛋白呈阳性结果,证明培养的细胞为人食管上皮细胞。人食管上皮细胞在K-SFM无血清培养基中生长快,细胞形态好,不易被成纤维细胞污染。以K-SFM培养液配制的冻存液冻存的细胞复苏后的存活率明显高于以DMEM配制的培养液。结论应用K-SFM无血清培养基培养和冻存人食管上皮细胞的方法简便、培养效果好,适合推广应用。     

豚鼠骨髓间充质干细胞分离培养及形态学观察

目的：分离和培养豚鼠骨髓间充质干细胞（MMSCs）,并通过观察了解其细胞生物学特性。方法：利用MMSCs和其它细胞不同的生长特性,采用细胞差速贴壁法,以含10%（体积分数）标准胎牛血清的L-DMEM培养基培养;用2.5%胰蛋白酶、37℃条件下消化,按1∶2的比例传代;倒置相差荧光显微镜下逐日观察各代MMSCs形态及生长情况。结果：经数次换液和连续传代培养,红细胞等杂质逐渐减少,可得到形态较均一的MMSCs,其增殖速度和细胞活性良好。结论：细胞差速贴壁法经济可靠、操作简单、易于掌握,是体外分离培养MMSCs的可行的实验方法;以此法获得的豚鼠MMMSCs生长旺盛,活性好,增殖能力强。     

大鼠骨髓来源内皮祖细胞的分离培养及鉴定

目的建立体外分离培养及鉴定大鼠骨髓来源内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）的方法。方法采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离得到骨髓单个核细胞,并结合差时贴壁法,收集24h后未贴壁细胞,然后用添加有多种细胞因子的内皮细胞基础培养基（endothelial basal medium,EBM-2）诱导培养获取EPCs。通过形态学观察、CD133和VEGFR-2抗体免疫荧光染色并结合FITC-UEA-1和Dil—ae—LDL的摄取功能来对EPCs进行鉴定分析,同时通过体外管样结构形成能力对EPCs进行功能性评价。结果在EBM-2培养基中诱导培养7d后,出现类似于血岛样的细胞集落,集落中央的细胞呈圆形,周边的细胞呈放射状;80％以上的细胞都是CD133＋／VEGFR＋2＋细胞,并且这些细胞同时能够摄取Dil-ac—LDL和结合FITC-UEA-1;EPCs在基质胶表面形成管腔样结构。结论密度梯度离心法结合差时贴壁法从骨髓中分离获得的单个核细胞,然后经EBM-2条件培养基诱导培养可获得较高纯度的EPCs。     

人扁桃体隐窝上皮细胞的分离、原代培养与鉴定

目的：建立高效、稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代培养方法。方法：收集80例3~5岁儿童手术切除的扁桃体组织,分别采用组织块贴壁法和Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶?EDTA消化法提取扁桃体隐窝上皮细胞并比较两种方法的提取效果;应用无血清角化细胞培养基进行细胞纯化及原代培养;用相差显微镜观察细胞形态和生长特点、免疫细胞化学染色及免疫荧光技术鉴定细胞来源。结果：Ⅱ型中性蛋白酶联合消化法在分离扁桃体隐窝上皮细胞成功率、细胞密度以及细胞融合时间方面均高于组织块贴壁法（P < 0.05）,细胞接种后第2天开始贴壁,外观呈现多边形,岛状生长,培养12 d左右,细胞连成单层,呈现铺路石样生长。免疫细胞化学染色显示广谱角蛋白表达阳性,波形蛋白阴性;免疫荧光鉴定角蛋白8/18染色阳性。结论：应用Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶?EDTA消化法以及无血清角化细胞培养基可建立高效稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代分离方法和体外培养体系。     

冻存对血管内皮干细胞增殖、分化能力的影响

目的 探讨冻存对人脐血来源血管内皮干细胞（EPCs）增殖、分化能力的影响。 方法 采用密度梯度离心法结合MACS分选法提取人脐血中CD133＋细胞，进行流式细胞仪检测纯度；将EPCs冻存3, 6, 12, 18个月后进行常规培养、诱导分化，利用细胞免疫组化进行鉴定，并比较不同冻存时间的EPCs的增殖能力。 结果 经流式细胞仪检测CD133＋细胞平均占单核细胞的（1.13±0.10）％，磁珠分选所得CD133＋细胞平均纯度为(91.45±1.04)％；CD133＋细胞贴壁生长，可分化为梭形血管内皮细胞及形成集落，经免疫组化检测大部分表达CD34和Ⅷ因子；冻存3, 6, 12, 18个月后，EPCs的增殖、分化能力有所下降。结论 长时间的冻存可减弱EPCs的增殖、分化能力。     

树突状细胞体外培养体系的优化

目的：探讨无血清专用培养基从人外周血单个核细胞（DC）分离培养树突状细胞的优化方法。方法：取正常成人新鲜血液，经密度梯度离心法，利用连续贴壁的方法获得单个核细胞，采用无血清培养基经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白介素-4（rhIL-4）和肿瘤坏死因子-α（TNF—α）诱导产生成熟DC，倒置显微镜观察树突状细胞结构，流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平。结果：连续贴壁法无血清专用培养基体外分离培养人外周血DC，所获得DC数量和纯度均都多于以往一次贴壁分离含10％胎牛血清RPMI培养基培养的DC。培养1周的DC高表达CD83、HLA-DR、CD80、CD86、CD83^＋HLA—DR^＋及CD80^＋CD86^＋。结论：采用无血清专用培养基连续贴壁法可分离培养数量较大、纯度较高的人外周血来源的DC。     

人脐静脉血管内皮细胞培养、冻存、复苏与鉴定

目的：探讨人脐静脉血管内皮细胞（humanumbicicalveinendothelialcell,HUVEC）体外分离、培养、冻存、复苏与鉴定的可靠方法。方法：采用改良的胶原酶灌注消化法对HUVEC进行分离、培养与鉴定,并遵循”慢冻快复”的原则进行冻存与复苏,同时使用Ⅷ因子相关抗原染色法进行鉴定。结果：分离的HUVEC生长良好,细胞总数可达I-3×10^2。Ⅷ因子相关抗原染色鉴定结果为95％以上阳性,冻存后复苏的细胞活性超过90％。结论：HUVEC可以从脐带获得并通过原代培养成为细胞系,获得了人脐静脉血管内皮细胞体外培养、冻存、复苏与鉴定的可靠方法。     

当归多糖对脐血造血细胞的抗冷冻损伤作用

目的：探讨当归多糖（APS）对脐血造血细胞的抗冷冻损伤作用.方法：采用细胞计数法比较羟乙基淀粉（HES）、明胶、淋巴细胞分离液（Ficoll）分离脐血单个核细胞（MNC）的回收率.应用细胞计数法、台盼蓝拒染法、集落形成实验和流式细胞术,检测冻存1,3,6mo脐血MNC的生物学活性,将脐血MNC与不同浓度APS共培养24h后冻存,1mo后复苏,观察APS对脐血MNC抗冷冻损伤的作用.结果：HES法、明胶法的MNC回收率均大于85%,显著高于Ficoll法（50.00±4.00）%（P〈0.05）;冻存1,3,6mo组MNC,CFU-Mix,CD34＋细胞回收率及台盼蓝拒染率差异均无显著性,且脐血MNC的损伤与冻存时间不相关.APS50,100,200,400mg/L不同浓度APS组MNC,CFU-Mix回收率和台盼蓝拒染率除APS400mg/L组下降外,其余各组明显上升（P〈0.05）;各组组间CD34＋细胞回收率差异无显著性.结论：APS可有效提高脐血造血细胞的抗冷冻损伤能力.     

人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为角膜缘干细胞的研究

目的探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞（human bone mesenchymal stem cells,HBMSCs）分化为角膜缘干细胞（limbal stem cells,LSCs）的可行性。方法用密度梯度离心法体外分离HBMSCs,用消化后组织块培养法分离培养LSCs,培养传代后用流式细胞仪检测细胞的相关抗原。将第4次传代的HBMSCs分成2组：实验组细胞与第2次传代的LSCs共培养于Transwell培养板,加入条件培养基;对照组不加任何诱导剂,以原HBMSCs培养基培养。培养10d,在相差显微镜下进行形态学观察。结果实验组共同培养72h后,贴壁HBMSCs部分呈椭圆形、圆形改变。在体外微环境中诱导10d后大部分细胞呈多边形、圆形、椭圆形,少部分细胞呈梭形。实验组P63弱阳性（7.16±0.56）%,对照组P63阴性（0.74±0.49）%。结论在体外特殊的微环境下,HBMSCs可被其诱导分化为LSCs细胞。