吡格列酮对高糖高胰岛素诱导的心肌成纤维细胞增殖的影响

目的利用体外培养的乳鼠心肌成纤维细胞,观察噻唑烷二酮(TZD)类药物吡格列酮对高浓度葡萄糖与高浓度胰岛素共同诱导的心肌成纤维细胞增殖的影响,进一步推测TZD类药物对糖尿病并发心肌肥厚的可能作用机制。方法以培养的乳鼠心肌成纤维细胞为模型分组给药后。利用结晶紫染色法测定细胞的数量;利用[3H]thym id ine标记法测定细胞DNA的合成;利用流式细胞仪分析细胞周期。结果吡格列酮可以抑制高糖高胰岛素诱导的心肌成纤维细胞数量、DNA合成及S+G2+M期细胞的百分比增加,并呈一定的剂量依赖性。结论吡格列酮能有效抑制高糖高胰岛素诱导的心肌成纤维细胞的增殖,这种作用可能是通过作用于PPARγ来实现的。     

胰岛素在培养的乳鼠心肌成纤维细胞对纤维连接蛋白、层粘连蛋白和转化生长因子β1表达的影响

目的 :研究胰岛素对心肌成纤维细胞胞外基质纤维连接蛋白 (fibronectin ,FN)、层粘连蛋白 (lami nin ,LN)及细胞因子转化生长因子 β1(TGFβ1)表达的影响 ,探讨其在心肌肥厚中的作用。方法 :乳鼠心肌成纤维细胞的培养并鉴定 ;用Streptavidin Peroxi dase (SP)染色方法 ,比较胰岛素实验组和对照组乳鼠心肌成纤维细胞FN、LN及TGFβ1的表达。结果 :培养的细胞经形态学观察和波形蛋白 (vimentin)SP染色 ,证实为心肌成纤维细胞 ;10 -8mol·L-1胰岛素实验组细胞膜上FN和细胞浆内TGFβ1的表达明显强于对照组 (P <0 .0 1) ;LN在培养的心肌成纤维细胞上基本不表达。结论 :在体外 ,胰岛素具有促进心肌成纤维细胞胞外基质FN堆积的作用 ,可能参与了心肌肥厚的发生和发展 ,其机制可能与胰岛素促进心肌成纤维细胞TGFβ1的合成与分泌有关。     

苦参碱对心肌成纤维细胞增殖、胶原代谢及转化生长因子-β1蛋白表达的影响

目的探讨苦参碱对醛固酮诱导的新生大鼠心肌成纤维细胞增殖、胶原代谢的影响,并探讨转化生长因子-β1（TGF-β1）信号转导通路在苦参碱抗心肌纤维化中的作用机制。方法体外差速贴壁法分离纯化培养心肌成纤维细胞,试验分为对照组、醛固酮（1.0×10-7mol/L）组和醛固酮＋不同浓度（0.125,0.25,0.5mmol/L）苦参碱组5组。作用24h后,倒置显微镜观察细胞生长状态;四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测心肌成纤维细胞增殖;流式细胞分析仪分析细胞周期;分光光度法检测细胞上清羟脯氨酸含量;细胞免疫荧光染色及流式细胞仪检测TGF-β1蛋白表达。结果与对照组比较,醛固酮可显著提高心肌成纤维细胞MTT-OD值,使S期细胞比率增加,G0/G1期细胞比率下降;羟脯氨酸含量、TGF-β1的蛋白表达均显著高于对照组（P〈0.01）。苦参碱干预24h后,MTT-OD值、S期的细胞百分比、羟脯氨酸含量、TGF-β1的蛋白表达均显著低于醛固酮组（P〈0.01）,且苦参碱的效应呈浓度依赖性。结论苦参碱可抑制醛固酮诱导的心肌成纤维细胞增殖及胶原合成,其抗纤维化作用可能与直接下调TGF-β1蛋白表达有关。     

巨噬细胞极化对心肌成纤维细胞活化的影响

目的 观察巨噬细胞极化上清对心肌成纤维细胞活化的影响。方法 提取SD大鼠的骨髓细胞和心肌成 纤维细胞。利用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）处理骨髓细胞后,加入刺激因子：M0（无刺激因子）、M1（100 μg/L脂 多糖+10 μg/L干扰素-γ）、M2（20 μg/L白细胞介素-4）诱导巨噬细胞极化。将极化后的不同型别巨噬细胞及其培养 上清分别与心肌成纤维细胞共培养,分别设空白对照组、M0组、M1组和M2组,通过细胞免疫荧光检测心肌成纤维细 胞中纤维化蛋白的表达水平;实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测巨噬细胞和成纤维细胞特征分子的表达; Western blot检测纤维化相关蛋白及转化生长因子β受体（TGFβR）、血小板衍生生长因子受体（PDGFRs）信号通路活 化情况。结果 经M-CSF及相应刺激因子诱导,成功获得M1和M2型巨噬细胞。细胞共培养结果显示,与M0组相 比,M1组上清培养的心肌成纤维细胞中胶原蛋白1（Col1a1）和Col3a1的mRNA水平以及平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表 达水平显著降低（P＜0.05）,而M2组上清培养的心肌成纤维细胞中Col1a1和Col3a1的mRNA水平以及α-SMA、结缔 组织生长因子（CCN2）表达水平显著升高（P＜0.05）。M1组上清培养的心肌成纤维细胞中PDGFRβ蛋白磷酸化水平 显著低于 M0 组（P＜0.01）,而 M2 组上清培养的心肌成纤维细胞中 PDGFRβ 蛋白磷酸化水平显著高于 M0 组（P＜ 0.05）。结论 M1型巨噬细胞上清能够抑制心肌成纤维细胞活化,而M2型巨噬细胞上清能够激活心肌成纤维细胞。 M1型巨噬细胞抑制纤维化的作用可能与抑制PDGFRβ通路的活化有关。     

洛伐他汀对醛固酮诱导大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响

目的:探讨洛伐他汀对醛固酮诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响及其作用机制。方法:采用胰酶消化法分离培养SpragueDawley大鼠心肌成纤维细胞,以3H胸腺嘧啶核苷(3HTdR)掺入法、四氮唑蓝比色法和流式细胞仪观察洛伐他汀对醛固酮诱导心肌成纤维细胞增殖的DNA合成、细胞数目和细胞周期的影响。结果:(1)0.1,1,10μmol·L-1浓度的洛伐他汀抑制醛固酮诱导的心肌成纤维细胞3HTdR掺入率和A490值,其中1,10μmol·L-1组的3HTdR掺入率[(1292±s152),(1030±163)counts·min-1]和A490值[(0.287±0.008),(0.231±0.007)]显著低于对照组、0.1和0.01μmol·L-1组(P<0.01);(2)洛伐他汀可增加G0/G1期细胞百分率,降低S期细胞百分率、增殖指数和DNA含量;(3)甲羟戊酸可逆转洛伐他汀的上述作用。结论:洛伐他汀可抑制醛固酮诱导的心肌成纤维细胞增殖及DNA合成,阻止其由G1期进入S期,其机制可能与甲羟戊酸代谢途径有关。     

紫杉醇对血管外膜成纤维细胞增殖和迁移的影响

目的观察紫杉醇对血管外膜成纤维细胞(AF)增殖、表型转化和迁移的影响。方法选取雄性SD大鼠,用贴壁法培养胸主动脉外膜AF,用免疫荧光法检测AF增殖细胞核抗原(PCNA),用流式细胞仪检测细胞周期,用Transwell法测定细胞迁移能力。结果 10 nmol.L-1紫杉醇对成纤维细胞存活率较空白组无明显差异,表明其对成纤维细胞无明显杀伤作用。与空白组比较,9 nmol.L-1紫杉醇可显著增加G0/G1期AF细胞百分比(P<0.05),降低G2/M及S期细胞百分比(P<0.05),并显著降低AF细胞PCNA表达,抑制其迁移能力(P<0.01)。结论低浓度紫杉醇在不影响成纤维细胞生存活力的情况下,能显著抑制细胞增殖和迁移能力。     

丹酚酸B对转化生长因子β_1诱导心肌成纤维细胞增殖的影响

目的:探讨丹酚酸B对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导心肌成纤维细胞增殖的影响。方法:培养原代心肌成纤维细胞;采用波形蛋白、肌动蛋白及纤维连接蛋白免疫组化染色鉴定心肌成纤维细胞,计算阳性细胞率;加入TGF-β1,使其终质量浓度为5、10、20、40 ng/ml,以MTT法测定细胞增殖活性;加入丹酚酸B 100μl,使其终浓度为10、30、100μmol/L,1 h后加100μl TGF-β1,使其终质量浓度为20 ng/ml,以MTT法测定细胞增殖活性。结果:倒置显微镜下观察细胞呈梭形,排列较紧密,有的重叠交叉生长;免疫组化染色鉴定该细胞为心肌成纤维细胞,纯度>99%;10⁴0 ng/ml的TGF-β1均可显著诱导心肌成纤维细胞增殖,1040 ng/ml的TGF-β1均可显著诱导心肌成纤维细胞增殖,10¹00μmol/L的丹酚酸B均可显著抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖。结论:丹酚酸B对TGF-β1诱导心肌成纤维细胞增殖具有抑制作用。     

瓜蒌薤白半夏汤对心肌纤维化中整合素β1的抑制作用

目的研究整合素β1和纤维连接蛋白在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心肌纤维化中的作用,探讨瓜蒌薤白半夏汤(GXB)抗心肌纤维化的作用机制。方法 采用胰酶消化法培养乳鼠心肌成纤维细胞,建立AngⅡ诱导心肌纤维化模型。实验分为空白对照组,AngⅡ组,5%、10%、15%GXB含药血清组和缬沙坦含药血清组。空白对照组心肌成纤维细胞以空白对照组大鼠血清温育,其余各组均以AngⅡ1×10-6mmol/L刺激24h后,再分别以空白对照组大鼠血清、5%GXB含药血清、10%GXB含药血清、15%GXB含药血清、缬沙坦含药血清温育24h。RT-PCR法检测GXB对整合素β1mRNA表达水平的影响;ELISA检测培养上清液中纤维连接蛋白的量;MTT法检测心肌成纤维细胞增殖。结果与空白对照组比较,AngⅡ1×10-6mmol/L作用心肌成纤维细胞24h,整合素β1mRNA表达水平及纤维连接蛋白的量明显上调(P0.01),心肌成纤维细胞增殖指数明显升高(P0.01);经GXB含药血清干预后,与AngⅡ组比较,整合素β1mRNA的表达水平明显下降(P0.01),纤维连接蛋白的量减少(P0.05),心肌成纤维细胞增殖指数明显降低(P0.01)。结论瓜蒌薤白半夏汤能够抑制AngⅡ诱导心肌纤维化,其作用机制可能与下调纤维连接蛋白/整合素β1表达有关。     

Apelin-13促血管平滑肌细胞增殖作用研究

目的研究G蛋白偶联受体APJ的内源性配体Ape-lin-13对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)生长增殖影响及其与细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的关系,发现Apelin-APJ新功能。方法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,噻唑蓝比色法(MTT)观察VSMC增殖;流式细胞仪分析细胞周期;Western blot检测cyclinD1的表达。结果Apelin-13能促进血管平滑肌细胞增殖,降低G0/G1期细胞百分比,升高S+G2+M期细胞百分比,并可剂量依赖性刺激细胞cyclin D1的表达增加。结论Apelin-13能通过推动细胞周期由G0/G1期进入S期而促进血管平滑肌细胞增殖,其作用机制与促进cyclin D1表达增高有关。     

小檗碱及同系物抑制心肌肥厚和心室重构的药理作用

综述近年小檗碱及同系物抑制心肌肥厚、心室重构的病理演变过程及机制。小檗碱及其同系物延缓或逆转了心肌肥厚和心脏重塑的主要作用机制：通过抑制胶原合成和血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖;降低心肌耗氧量,抑制心肌细胞凋亡;拮抗胰岛素抵抗,降低血糖血脂,抑制氧化应激-糖基化作用;抑制多种内源性血管活性物质生成和释放;抑制神经内分泌的激活及多种基因之间的相互作用,改善了心肌梗死后的心室重构等5个环节。     

辛伐他汀对内皮素-1诱导氧活性物质介导心肌细胞肥大的抑制作用

目的　探讨辛伐他汀对内皮素 1 (endothelin 1 ,ET 1 )诱导的氧活性物质 (reactiveoxygenspecies,ROS)产生和心肌细胞肥大的抑制作用。方法　用原代培养的新生大鼠心肌细胞进行实验。细胞内荧光信号用荧光倒置显微镜检测。细胞内ROS水平用ROS敏感的荧光探针 2 ,7 dichlorofluo rescindictate(DCF DA)来反应 ,细胞内RNA含量用RNA敏感的荧光探针碘化丙啶 (propidiumiodide ,PI)来测定。用考马斯亮蓝法测定细胞内总蛋白含量。用图像分析软件 (Leica图像分析软件 )测细胞表面积。结果　①ET 1浓度依赖性地使心肌细胞内DCF DA的荧光信号增加和心肌细胞肥大。过氧化氢酶 (catalase ,CAT ,0 2U·L- 1 )抑制ET 1 (1× 1 0 - 8mol·L- 1 )诱导的心肌细胞内DCF DA的荧光信号的增加和心肌细胞肥大。②辛伐他汀对ET 1诱导的心肌细胞内DCF DA的荧光信号增强和心肌细胞肥大产生剂量依赖性的抑制作用。结论　ET 1能够使心肌细胞产生ROS和ROS依赖的心肌细胞肥大 ,辛伐他汀能抑制ET 1诱导的ROS依赖的心肌细胞肥大。     

吡那地尔、美托洛尔、谷氨酰胺、胰岛素单独及联合使用对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的抗凋亡作用及机制

目的研究吡那地尔(pinacidil,Pin)、美托洛尔(metoprolol,Met)、谷氨酰胺(glutamine,Glu)、胰岛素(insu-lin,Ins)4药联用对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)所致H9c2心肌细胞损伤的抗凋亡保护作用并探讨其作用机制。方法将培养的H9c2心肌细胞随机分为7组,即①正常对照(Con)组;②缺氧/复氧(H/R)组;③吡那地尔(Pin)组;④美托洛尔(Met)组;⑤谷氨酰胺(Glu)组;⑥胰岛素(Ins)组;⑦吡那地尔、美托洛尔、谷氨酰胺和胰岛素4药联用(PMGI)组。细胞经药物处理建立H/R损伤模型,并测定各组H9c2心肌细胞的存活率;收集培养液测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性;流式细胞仪检测心肌细胞凋亡百分率;罗丹明123(Rhodamine123,Rh123)荧光探针标记线粒体,检测荧光强度以反映心肌细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)变化。结果对于H/R损伤的H9c2心肌细胞,吡那地尔、美托洛尔、谷氨酰胺与胰岛素4药联用组与药物单用组或H/R组相比能明显提高细胞存活率,保护其细胞膜,减少LDH渗漏;减少细胞凋亡率;提高△Ψm。结论吡那地尔、美托洛尔、谷氨酰胺和胰岛素4药联用后,通过不同途径保护心肌细胞,达到协同抗凋亡作用。     

外源性雌激素对人牙周膜干细胞骨分化能力影响的实验研究

目的：检测外源性雌激素对人牙周膜干细胞( PDLSCs )骨分化能力的影响。方法将体外培养的PDLSCs加入无酚红成骨诱导培养液和不同浓度的17β-E2[分为E10-7、E10-8、E10-9组和对照组(成骨诱导培养液+无水乙醇(0.01%)]-雌二醇[分为E10-7、E10-8、E10-9组、ICI组(成骨诱导培养液+ICI182780)、E10-7+ICI组(成骨诱导培养液+1×10-717β-E2+1×10-7ICI182780)],观察各组细胞形态、测定其增值水平、碱性磷酸酶(ALP)活性、Ⅰ型胶原合成能力。结果添加外源性雌激素后,细胞增殖加快,生长密集,呈螺旋状排列。 PDLSCs的增殖发生变化,与对照组相比,第3、5天雌激素干扰组细胞增殖受到抑制( P <0.05),此后雌激素干扰组细胞增殖高于对照组( P <0.05),在不同药物浓度组间,E10-7组对细胞增殖影响最为明显,其细胞增殖水平高于E10-8、E10-9组( P <0.05)。 ALP表达显示动态变化,自第3天开始,各组ALP表达均升高,而雌激素干扰组ALP表达量高于对照组( P <0.05),在不同药物浓度组间E10-7组ALP表达增加高于E10-8、E10-9组( P <0.05),与ICI组、E10-7+ICI组比较,差异无统计学意义( P >0.05);PDLSCsⅠ型胶原合成表达与对照组相比有增加趋势,且与药物浓度有剂量依赖关系。结论雌激素对PDLSCs成骨分化过程有促进作用,该作用与雌激素浓度密切相关。     

MaFGF对顺铂所致海马神经元损害保护作用的体外实验研究

目的探讨改构体酸性成纤维细胞生长因子(MaF-GF)对体外培养的海马神经元顺铂(DDP)损伤的保护作用。方法取新生SD乳鼠海马神经元进行原代培养,采用高分子量神经丝蛋白多克隆抗体(NF-H)进行免疫细胞化学染色鉴定。原代细胞接种于96孔培养板:①培养7 d后加入一系列浓度的DDP,继续培养24 h,采用四唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率;②以DDP建立损伤模型,并在加DDP同时加入一系列浓度的MaFGF,观察MaFGF对海马神经元的保护作用。结果①DDP对体外培养神经元活力具有明显的抑制作用,随着DDP浓度的增加,细胞活力降低;②浓度为5.2～10.4μg.L-1的MaFGF能使DDP损伤的神经元活力明显提高;③MaFGF+DDP组和DDP组比较,各生化和酶学指标差异均有统计学意义(P<0.01),MaFGF+DDP组中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)活性升高,丙二醇(MDA)、一氧化氮(NO)水平降低。结论MaFGF对DDP损伤的海马神经细胞具有一定的保护作用。     

Effects of tanshinone VI on the hypertrophy of cardiac myocytes and fibrosis of cardiac fibroblasts of neonatal rats

The possible effects of tanshinone VI (tsh), a diterpene from the root of Tan-Shen (Salvia miltiorrhiza, Bunge (Labiatae)) on hypertrophy and fibrosis in cultured neonatal rat cardiac myocytes and fibroblasts were examined. Tsh had no significant effect on protein synthesis, which was evaluated by [3H]-leucine incorporation into the acid insoluble fraction in the cells, in the absence of stimulatory factors in cardiac myocytes. The amount of protein produced in cardiac myocytes was increased by 10(-8) M endothelin-1 (ET-1), 10(-6) M phenylephrine (PE), or 10(-8) M insulin-like growth factor-1 (IGF-1), suggesting that hypertrophy of cardiac myocytes in vitro was induced by these factors. The ET-1-, PE-, or IGF-1-induced increase in protein synthesis was attenuated by treatment with 10(-5) M tsh. Treatment with 10(-5) M tsh significantly decreased the synthesis of collagen by cardiac fibroblasts, which was evaluated by [3H]-proline incorpolation into acid-insoluble fraction of the fiblobrasts, in the absence of stimulatory factors for the production. Fetal bovine serum (FBS) or IGF-1 increased collagen synthesis in a concentration-dependent manner. The increase at 5% FBS or 10(-8) M IGF-1 was inhibited by 10(-5) M tsh. Fibroblast-conditioned medium (FB-CM) increased protein synthesis in cardiac myocytes in a concentration-dependent manner (10; - 100 %). Tsh attenuated the FB-CM-induced increase in protein synthesis by cardiac myocytes. These results show that tsh may attenuate the humoral factor-induced hypertrophy of cardiac myocytes and fibrosis of cardiac fibroblasts. The findings suggest that tsh may improve the development of cardiac remodeling under pathophysiological conditions. Abbreviations. ANP:atrial natriuretic peptide DMEM:Dulbecco-modified Eagle's medium ET-1:endothelin-1 FB-CM:fibroblast-conditioned medium FBS:fetal bovine serum IGF-1:insulin-like growth factor-1 PE:phenylephrine tsh:tanshinone VI     

埃他卡林对异丙肾上腺素诱导心肌细胞肥大的影响

目的在原代培养的新生大鼠心肌细胞上观察埃他卡林(iptakalim,IPT)对异丙肾上腺素诱导心肌细胞肥大的影响。方法采用SD大鼠乳鼠原代心肌细胞培养法,Lowry法测定心肌细胞总蛋白含量;激光共聚焦显微镜观察心肌细胞内游离Ca2+浓度。结果①剂量为1×10-5mol.L-1的异丙肾上腺素(isoprenaline,ISO)能有效地诱导心肌细胞肥大;②IPT能剂量依赖性抑制ISO诱导心肌细胞总蛋白含量和心肌细胞游离Ca2+浓度增加。结论IPT能明显抑制ISO诱导的心肌细胞总蛋白含量的增加,其机制可能与抑制Ca2+内流有关。     

Simvastatin disrupts cytoskeleton and decreases cardiac fibroblast adhesion, migration and viability

Statins reduce the isoprenoids farnesyl and geranylgeranyl pyrophosphate, essential intermediates, which control a diversity of cellular events such as cytoskeleton integrity, adhesion, migration and viability. Cardiac fibroblasts are the major non-myocyte cell constituent in the normal heart, and play a key role in the maintenance of extracellular matrix. The effects of simvastatin on cardiac fibroblast processes previously mentioned remain unknown. Our aims were to investigate the effects of simvastatin on cytoskeleton structure and focal adhesion complex assembly and their relationships with cell adhesion, migration and viability in cultured cardiac fibroblasts. To this end, cells were treated with simvastatin for 24 h and changes in actin cytoskeleton, levels of vimentin and paxillin as well as their subcellular localization were analyzed by Western blot and immunocytochemistry, respectively. Cell adhesion to plastic or collagen coated dishes, migration in Transwell chambers, and cell viability were analyzed after simvastatin treatment. Our results show that simvastatin disrupts actin cytoskeleton and focal adhesion complex evaluated by phalloidin stain and immunocytochemistry for paxillin and vinculin. All these effects occurred by a cholesterol synthesis-independent mechanism. Simvastatin decreased cell adhesion, migration and viability in a concentration-dependent manner. Finally, simvastatin decreased angiotensin II-induced phospho-paxillin levels and cell adhesion. We concluded that simvastatin disrupts cytoskeleton integrity and focal adhesion complex assembly in cultured cardiac fibroblasts by a cholesterol-independent mechanism and consequently decreases cell migration, adhesion and viability.     

Long term regulation of cardiac L-type calcium channel by small G proteins

Calcium ions are crucial elements of excitation-contraction coupling in cardiac myocytes. The intracellular Ca(2+ ) concentration changes continously during the cardiac cycle, but the Ca(2+ ) entering to the cell serves as an intracellular second messenger, as well. The Ca(2+ ) as a second messenger influences the activity of many intracellular signalling pathways and regulates gene expression. In cardiac myocytes the major pathway for Ca(2+ ) entry into cells is L-type calcium channel (LTCC). The precise control of LTCC function is essential for maintaining the calcium homeostasis of cardiac myocytes. Dysregulation of LTCC may result in different diseases like cardiac hypertrophy, arrhytmias, heart failure. The physiological and pathological structural changes in the heart are induced in part by small G proteins. These proteins are involved in wide spectrum of cell biological functions including protein transport, regulation of cell proliferation, migration, apoptosis, and cytoskeletal rearrangement. Understanding the crosstalk between small G proteins and LTCC may help to understand the pathomechanism of different cardiac diseases and to develop a new generation of genetically-encoded Ca(2+ ) channel inhibitors.