平肝熄风汤对脑出血大鼠海马细胞色素C氧化酶活性和细胞凋亡影响的同步研究

背景细胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase,CCO)是线粒体呼吸链中的终端酶,在细胞的有氧代谢及氧化磷酸化产能过程中起关键作用,近来发现线粒体能量生成与细胞凋亡关系极为密切,其CCO活性改变与脑缺血缺氧后神经元损伤密切相关.目的从神经元线粒体能量代谢和细胞凋亡的角度探讨中药复方平肝熄风汤对脑出血神经元损伤的保护作用机制.设计以实验动物为研究对象,随机对照的实验研究.单位湘雅医院中西医结合研究所和远程医学中心.材料实验于2003-11-02/11-09在中西医结合研究所动物实验室(省重点实验室)完成,选择健康雄性SD大鼠80只,由卫生部湘雅医学院实验动物中心提供.方法采用Ⅶ型胶原酶诱导大鼠脑出血模型,以组织化学方法结合灰度值半定量测定CCO活性,采用Tunel法检测细胞凋亡.主要观察指标①脑出血大鼠术侧海马CA1区CCO活性.②脑出血大鼠术侧细胞凋亡.结果造模12 h,脑出血大鼠海马CA1区CCO活性52.12±3.75较假手术组26.98±6 32明显降低(P＜0.01),凋亡细胞[(13.56±1.72)个/视野]较假手术组[(4.32±1.04)个/视野]明显增多(P＜0.01),随后均呈进行性加重.用平肝熄风汤治疗后可维持其CCO活性,减少细胞凋亡.结论脑出血神经元损伤与神经元CCO活性降低及细胞凋亡有关.平肝熄风汤能维持线粒体关键酶CCO活性,改善细胞有氧代谢,减少细胞凋亡,可能为平肝熄风汤对脑出血继发性神经元损伤保护机制之一.     

神经生长因子对创伤性脑损伤大鼠学习记忆功能的保护作用

目的：探讨脑室灌注神经生长因子对创伤性脑损伤大鼠脑海马、隔区细胞凋亡和学习与记忆功能的影响。方法：实验于2003-03／12在南通大学基础医学院神经生物学研究室完成。24只成年sD大鼠随机分成损伤给药组和损伤对照组，每组12只，采用Feenev法制备大鼠脑损伤模型，损伤给药组和损伤对照组于创伤后即时及第2和第4天从侧脑室分别灌注5μL神经生长因子和人工脑脊液，各组的一半动物于伤后第5天取脑切片，行Nissl染色、末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法进行细胞凋亡检测，并用尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶组化染色及乙酰胆碱转移酶免疫组化染色观察海马、隔区一氧化氮合酶和乙酰胆碱转移酶阳性细胞的变化。另一半动物于伤后30d时行避暗回避试验和跳台试验，分别记录两组大鼠探索次数、滞留时间以及跳台试验的主动和总回避阳性率。结果：各组大鼠均进入结果分析。与损伤对照组(11．33&;#177;1．97)比较，损伤给药组损伤侧时海马凋亡细胞(0．83&;#177;0．75)减少(t=16．9590，P&;lt;0．05)，脑隔区未观察到凋亡细胞，脑海马及隔区一氧化氮合酶阳性细胞(分别为80．83&;#177;3．19和50．50&;#177;3．62)数量较损伤对照组(分别为126．00&;#177;3．37和58．25&;#177;5．38)明显减少(t=23．860，2．927；P均&;lt;0．05)，脑隔区乙酰胆碱转移酶阳性神经元(63．50&;#177;1．06)较损伤对照组(53．83&;#177;1．87)丢失不明显(t=3．73l，P&;lt;0．05)；损伤给药组避暗回避试验探索次数(2．67&;#177;1．22)较损伤对照组(11．50&;#177;2．07)减少(t=12．562，P&;lt;0．05)、滞留时间[(95．67&;#177;14．92)s]较损伤对照组[(14．83&;#177;7．86)s]延长(t=13．790，P&;lt;0．05)，跳台试验主动回避阳性率(76．42％)较损伤对照组(13．9l％)增高(r=40．601，P&;lt;0．05)。结论：对创伤性脑损伤大鼠脑室灌注神经生长因子治疗后，损伤大鼠脑隔区细胞凋亡明显减少，隔区乙酰胆碱转移酶免疫组化染色推测凋亡的细胞可能是胆碱能神经元。给创伤性脑损伤大鼠脑室灌注神经生长因子后减少了脑海马区细胞凋亡，从而对与学习记忆相关的脑隔区及海马神经元起到保护作用。     

幼鼠持续惊厥状态脑损伤时托吡酯的神经保护作用

目的：研究托吡酯对惊厥性脑损伤是否具有保护作用。方法：制作毛果芸香碱惊厥持续状态动物模型，给予托毗酯干预，检测海马区神经元坏死、凋亡、凋亡蛋白表达和胶质细胞增生变化情况。结果：毛果芸香碱惊厥持续状态模型鼠病理损伤特点为神经元坏死、细胞凋亡、凋亡蛋白表达增多，胶质细胞增生。托吡酯可减少海马区细胞坏死：CA3区坏死细胞百分比由(72．1&;#177;13．4)％降至(20．6&;#177;7．2)％(P&;lt;0．05)；CA1区由(67．1&;#177;9．3)％降至(18．3&;#177;4．8)％(P&;lt;0．05)；减少细胞凋亡：CA1区单位面积凋亡细胞数由9．4&;#177;6．1降至1．7&;#177;0．8(P&;lt;0．05)；减少凋亡蛋白表达：单位面积caspase-3阳性面积由1．49&;#177;0．25降至0．71&;#177;0．12(P&;lt;0．05)；缓解胶质细胞增生：单位面积胶质细胞数由47．3&;#177;3．6降至19．5&;#177;3．9(P&;lt;0．05)。结论：托吡酯对幼鼠惊厥性神经变性，可减少神经的死亡和凋亡，缓解胶质细胞增生。     

睡眠剥夺引起大鼠海马神经元凋亡及相关基因表达的变化

背景：睡眠剥夺是否引起细胞变性，其信号传导是否与某些基因调控有关。目的：探讨睡眠剥夺引起的神经元凋亡与相关基因表达的变化。设计：随机对照实验研究。地点和材料：实验地点：郑州大学医学院生理学实验室。成年健康SD大鼠，雌雄不限，体质量(200&;#177;20)g，由河南省实验动物中心提供。干预：采用TUNEL染色观察了快眼动睡眠剥夺大鼠海马神经元形态学变化，应用原位杂交检测了快眼动睡眠剥夺大鼠海马bcl-2．bax mRNA表达。主要观察指标：睡眠剥夺大鼠海马神经元形态学变化；海马bcl-2和bax mRNA表达。结果：快眼动睡眠剥夺大鼠海马CA1，CA3区神经元阳性凋亡细胞数增多，异相睡眠剥夺组海马CA1～CA4区细胞凋亡率分别为(6．60&;#177;2．24)％，(1．69&;#177;0．45)％，(6．87&;#177;1．32)％，(1．74&;#177;0．98)％。CA1，CA3区细胞凋亡率和CA2，CA4区相比较差异有显著性意义(t=5．26～6．95，P&;lt;0．05)。bc1-2mRNA阳性信号表达积分值较强，四个区之间差异无显著性意义，bax mRNA表达增强[CA1为(211．12&;#177;59．85)；CA3为(205．56&;#177;56．99)]与CA2和CA4区[(123．42&;#177;22．80)。(124．21&;#177;20．47)]比较差异有显著性意义(t=3．20～4．36．P&;lt;0．05)。结论：睡眠剥夺可引起大鼠海马神经元凋亡，与凋亡相关的bc1-2。bax mRNA基因表达的变化可能涉及神经元的凋亡机制。     

糖尿病大鼠椎间盘组织中戊糖甙素与细胞凋亡的关系

背景：细胞凋亡可能是引起椎间盘细胞减少的一个主要因素。但是关于诱导椎间盘细胞凋亡的生物学因素还不清楚。目的：通过观察糖尿病大鼠椎间盘细胞凋亡情况，探讨可能与凋亡有关的因素。设计：随机对照的实验研究。地点和对象：实验地点在上海九院实验动物中心和上海第二医科大学生物物理教研室完成。36只雄性SD大鼠(4月龄)，购自中科院上海实验动物中心，平均体质量244go按随机数字表法分为2组，每组18只。千顶措施：处理组用腹腔单次注射链脲佐菌素溶液(streptozotocin，STZ，40mg／kg)造成糖尿病。正常对照组，仅给予等量的柠檬酸缓冲液。72h后测定大鼠的血糖，血糖在16．0mmol／L以上者确定为糖尿病。分别在第1，3，4个月时每组各取6只大鼠处死，取其腰椎间盘组织，进行测定。主要观察指标：用流式细胞术检测椎间盘细胞凋亡情况。用高效液相层析法测定椎间盘组织中戊糖甙素含量变化。结果：处理组大鼠在注射STZ溶液后，血糖水平均高于16．0mmol／L[(23．71&;#177;2．69)mmol／L]。在不同时期，糖尿病大鼠组椎间盘细胞凋亡率(％)分别是18．52&;#177;4．81，18．74&;#177;5．13，19．41&;#177;5．22，明显高于同期对照组4．59&;#177;2．24，9．38&;#177;2．37，10．78&;#177;3．86(P&;lt;0．05)，糖尿病大鼠椎间盘组织中戊糖甙素含量(nmol／g)分别是33．53&;#177;5．88，37．03&;#177;12．77，36．53&;#177;11．95，明显高于同期对照组13．87&;#177;3．30，13．60&;#177;2．56，15．33&;#177;4．04(P&;lt;0．05)。椎间盘组织中戊糖甙素含量与椎间盘细胞凋亡率之间呈正相关性(r=0．857-0．970，P&;lt;0．05)。结论：糖尿病大鼠椎间盘细胞凋亡明显增加。戊糖甙素等糖基化终末产物可能是促进椎间盘细胞凋亡的因素之一。     

肢体移植大鼠应用FK506对细胞凋亡及其预后的影响

目的：采用大鼠异体肢体移植模型观察同种异体肢体移植急性排斥反应中的细胞凋亡，并探讨FK506对移植肢体细胞凋亡及预后的影响。方法：实验于2003—11／2004—05在哈尔滨医科大学附属第一医院实验动物中心实验室完成、供体为Wistar大鼠，受体为SD大鼠，行大鼠异体肢体移植，对照组不给予任何免疫抑制剂，实验组注射FK506 1mg／(k&;#183;d)，苏木精-伊红(HE)染色进行移植组织排斥反应的病理分级，原位末端标记(TUNEL)法检测移植组织细胞的凋亡情况，计算凋亡指数。结果：对照组移植肢体术后(343&;#177;0．79)d开始出现皮下水肿、皮色变红，平均存活时间为(7．41&;#177;1.72)d．实验组未见明显排斥反应。两组间皮肤组织排斥反应病理分级术后3、5．7d对照组分别为(1．14&;#177;0．38)，(2.28&;#177;0.48)和（2.86&;#177;0.38)级、实验组为[0．42&;#177;0．53)，(0.57&;#177;0．53)和(0.86&;#177;0.38)级(P&;lt;0．01)。发生凋亡的细胞主要是皮下组织内浸润的淋巴细胞，两组间凋亡指数术后3d对照组为(8．85&;#177;2．58)个、实验组为(4．60&;#177;2．42)个(P&;lt;0．05)，术后5，7d对照组为(13．63&;#177;3.12)和(17.59&;#177;4.91)个、实验组为(5．52&;#177;2．46)和(7．35&;#177;2．38)个(P&;lt;0．01)。结论：细胞凋亡是同种异体肢体移植急性排斥反应中组织损伤的重要机制，FK506能明显减少移植肢体细胞凋亡的发生，延长移植肢体存活时间，FK506对移植肢体的保护作用可能是通过抑制移植物细胞的凋亡来实现的。     

挑筋法诱导佐剂型关节炎大鼠滑膜细胞凋亡的实验研究

目的：实验研究挑筋法对佐剂型关节炎大鼠滑膜细胞凋亡影响。方法：将40只SD大鼠随机分为正常组、模型组、药物组、挑筋组，每组10只，实验中建立佐剂型关节炎模型，运用TUNEL法检测挑筋法对大鼠滑膜细胞凋亡的影响。结果：致炎后模型组大鼠后踝关节红、肿，大鼠跛行，体质量下降，跖围与体质量分别为(25．48&;#177;2．16)mm，(123．4&;#177;12.8)g，经挑筋疗法治疗后大鼠后踝关节红、肿消失，跖围、体质量分别为(22．15&;#177;1．17)mm，(132．5&;#177;14．2)g，与模型组比较差异有显著性意义(P&;lt;0．001)。运用TUNEL检测各组滑胞细胞凋亡发现挑筋组和药物组出现明显的细胞凋亡，两者凋亡率分别为(43．81&;#177;3．84)％，(51．58&;#177;9．73)％，两者差异有显著性意义(P&;lt;0．05)，药物组细胞凋亡率高于挑筋组。结论：挑筋法诱导佐剂型关节炎大鼠滑膜细胞凋亡，故可能通过抑制和减少滑膜细胞的过度增生治疗炎性疾病。     

胰岛素对大鼠脑缺血再灌注时神经元凋亡及其相应基因的调控

目的 观察胰岛素（insulin,RI)对缺血再灌注损伤后细胞凋亡及其相应基因的调控作用。评估RI对脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法 将健康wistar大鼠56只，随机分为对照组、缺血再灌注盐水组(NS)、缺血再灌注胰岛素组(RI)。采用pulsinelli4血管阻塞模型，观察RI、NS在4．24，48h海马CA1区存活神经元数目，TUNEL阳性细胞数目，Bcl-2蛋白的表达，以观察比较缺血再灌注阶段细胞凋亡的变化。结果 再灌注NS组CA1区神经元数目(36&;#177;6)个／mm^2较再灌注RI组(88&;#177;9)个／mm^2少(t=3．34，P&;lt;0．01)。再灌注后CA1区细胞凋亡数：4h时再灌注NS组(12&;#177;3)个／mm^2高于再灌注RI(8&;#177;1)个／mm^2和假手术组(2&;#177;1)个／mm^2：组间比较，F=127．66，P&;lt;0．001。Bcl-2对海马CA1细胞凋亡评估4h时。再灌注NS组43．0&;#177;9．8,高于再灌注RI组24．0&;#177;5．4和假手术组2．7&;#177;0．8。结论 全脑缺血再灌注时急用RI可减轻脑缺血再灌注神经元凋亡,对脑缺血再灌注损伤引起的神经元延迟性坏死有保护作用。     

移植神经生长因子和脑衍生神经生长因子基因修饰的嗅鞘细胞对脊髓损伤后细胞凋亡的影响

目的：探讨大鼠脊髓损伤后神经生长因子和脑衍生神经生长因子基因修饰的嗅神经鞘细胞移植对脊髓损伤后细胞凋亡及促进神经功能恢复的作用。方法：实验于2003—09／2004—04在广东医学院实验动物中心完成，SD大鼠48只，雌雄不限，体质量240～260g。随机分为3组：基因修饰组，嗅鞘细胞移植组，脊髓损伤组，每组16只。均首先行大鼠脊髓损伤造模。基因修饰组和嗅鞘细胞移植组分别移植神经生长因子、脑衍生神经生长因子修饰的嗅鞘细胞和单纯嗅鞘细胞，脊髓损伤组不做治疗。移植后12周，采用免疫组织化学法和原位末端标记法对损伤区的脊髓组织切片进行细胞凋亡的检测，主要观察bcl-2(细胞凋亡抑制基因)，bax和fas(细胞凋亡诱导基因)阳性表达的情况评估经基因修饰和未经基因修饰的单纯嗅鞘细胞对脊髓神经凋亡的抑制及诱导作用。结果：48只大鼠均进入结果分析。①原位末端标记法检测结果：基因修饰组细胞凋亡数低于嗅鞘细胞移植组，脊髓损伤组最高。②免疫组织化学结果：Bcl-2蛋白表达的顺序为基因修饰组&;gt;嗅鞘细胞移植组&;gt;脊髓损伤组(20．79&;#177;6．40，13．54&;#177;3．66，9．34&;#177;2．12，P&;lt;0．05）；Fas，Bax蛋白表达的顺序均为脊髓损伤组&;gt;嗅鞘细胞移植组&;gt;基因修饰组【(24．98&;#177;4．32，40．48&;#177;2．05)，(18．92&;#177;4．74，25．54&;#177;3．82)，(11．78&;#177;3．81，16．87&;#177;3．30)，(P&;lt;0．05)】。结论：单纯移植嗅鞘细胞其存活时间与分泌有限。神经生长因子和脑衍生神经生长因子是神经营养因子的主要成员，用神经生长因子和脑衍生神经生长因子基因修饰嗅鞘细胞后可提高嗅鞘细胞的生存时间和提高分泌神经营养因子功能，移植后具有抑神经细胞凋亡的作用。     

椎管内局部灌注丹参注射液对急性脊髓损伤的保护

背景：脊髓损伤后的继发性损伤期大量细胞以凋亡的方式死亡。目的：探讨中药丹参注射液局部灌注对急性脊髓损伤后脊髓细胞坏死‘和调亡的影响。设计：随机对照实验。单位：陨阳医学院附属人民医院临床医学试验中心。对象：4～5个月龄的一级中国白兔44只，雌雄不限，体质量2．0～2．5kg。材料：选择实验于2002-06／2003-07在郧阳医学院附属人民医院临床医学试验中心完成。随机分成2组，丹参组和对照组，每组22只。两组动物均以改良Allen法造成兔不完全性脊髓损伤的模型。丹参组术后按0．3mL／(k只&;#183;d)的总量分4次(每6h1次)从硬膜下导管推人丹参注射液，对照组推入等量生理盐水。注射至损伤后8，24，72h分别处死动物，进行病理、组织形态学观察，过氧化物歧化酶和丙二醛检测，凋亡抑制基因B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)阳性细胞数检测。主要观察指标：脊髓损伤区细胞凋亡指数和细胞凋亡率。结果：44只兔均进入结果分析。①细胞凋亡结果：丹参组的凋亡指数明显少于对照组(13．10&;#177;1．38，20．39&;#177;2．96，t=4．101，P&;lt;O．01)：细胞凋亡率明显低于对照组[(9．67&;#177;1．09)％，(14．68&;#177;2．81)％，t：4．072，P&;lt;0．01]；Bcl-2的表达高于对照组[(19．12&;#177;4．74)个／mm^2，(13．37&;#177;3．68)个／mm2，t=2．347，P&;lt;0．0l]。②氧化物歧化酶含量：丹参组高于对照组[(136．20&;#177;13．64)NU／mL，(101．70&;#177;15．24)NU／mL．t=4．132。P&;lt;0．01]。③丙二醛含量：丹参组低于对照组[(1．27&;#177;0．22)nmol／mL，(2．54&;#177;0．69)nmol／mL，t=4．309，P&;lt;0.01]。④神经元和神经纤维变性及坏死：丹参组轻于对照组。结论：丹参局部灌注后，减少了脊髓损伤局部的细胞凋亡，抑制和减轻了急性脊髓损伤后细胞坏死。     

胶质细胞源性神经营养因子对脑出血大鼠神经功能的保护作用

目的：研究胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic faetor，GDNF)对脑出血大鼠的保护作用，探讨其发生机制。方法：克隆胚胎鼠的GDNF基因，构建pCDNA3-GDNF-GFP质粒，注射于大鼠脑出血部位。选用成年SD大鼠制备脑出血模型，共分9组，每组20只，假手术Ⅰ组，脑出血Ⅰ组，干预Ⅰ组观察大鼠行为学、脑组织含水量、Na^+，K^+离子浓度的变化；假手术Ⅱ组，脑出血Ⅱ组，干预Ⅱ组观察血脑屏障的改变；假手术Ⅲ组，脑出血Ⅲ组。干预Ⅲ组观察组织形态学和GDNF。阳性细胞的表达。结果：出血组和干预组相比，神经缺损评分在出血后24h为8．53&;#177;1．44和8．34&;#177;1．28(P&;gt;0．05)，72h，7d，14d为7．58&;#177;1．08，5．46&;#177;0．74，3．06&;#177;0．43和4．21&;#177;0．76，3．25&;#177;0．52，1．92&;#177;0．26(P&;lt;0．01)。72h，7d时脑组织含水量为(84．26&;#177;0．64)％，(80．38&;#177;0．86)％和(78．26&;#177;0．42)％，(77．51&;#177;0．33)％(P&;lt;0．01)。72h，7d时Na^+，K^+离子浓度两组比较，差异有显著性意义(P&;lt;0．01)。干预组坏死体积较出血组减小，GDNF阳性细胞表达明显增加(P&;lt;0．01)。结论：GDNF能改善出血大鼠行为学，减轻脑水肿，促进神经功能恢复，增加脑组织抗损伤能力，有一定的治疗意义。     

肿瘤坏死因子-α在大鼠脑缺血再灌注中的表达及对神经细胞凋亡的影响

目的：观察大鼠脑缺血再灌注损伤后肿瘤坏死因子-α(tumor necmsis factor-alpha，TNF-α)表达及细胞凋亡情况，探讨TNF-α在脑缺血再灌注损伤中的作用。方法：采用大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，分为3组：脑缺血再灌注组大鼠大脑中动脉阻塞2h，再灌注2，6，12，24，48，72，96h、假手术组及永久缺血组，分别测定TNF-α表达(用免疫组织化学法)及细胞凋亡数(原位凋亡检测试剂盒)。结果：脑缺血再灌注组TNF-α表达水平[6h：(15．0&;#177;3．21)个／mm^2，12h：(47．0&;#177;0．87)个／mm^2，24h：(49．0&;#177;10．3)个／mm^2，48h：(44．8&;#177;6．9)个／mm^2，96h:(37．9&;#177;6.4)个／mm^2、细胞凋亡数[2h：(33．3&;#177;0．8)个／mm^2，6h:(56．6&;#177;1．6)个／mm^2，12h:(72．3&;#177;4.2)个／mm^2．24h：(86．6&;#177;5．5)个／mm^2，48h：(96．8&;#177;0．9)个／mm^2]明显高于假手术组(P&;lt;0.01)及永久缺血组(P&;lt;0.05)；且TNF-α表达与细胞凋亡数关系密切(r=0．567．P&;lt;0，01)。结论：大鼠脑缺血再灌注损伤后TNF-α在神经元迟发性坏死中起着重要作用。     

川芎嗪对急性癫痫大鼠弓状核神经元损伤的保护作用

目的：研究川芎嗪对急性癫痫大鼠弓状核神经元损伤中的保护作用。方法：30只SD大鼠按随机数字表法随机分为对照组、癫痫组和治疗组，采用光、电镜技术和形态计量方法对弓状核神经元进行形态定量研究。结果：①3组间神经元胞体的面积分数、面数密度、神经元胞体和胞核的等效直径无显著性变化。②对照组、癫痫组和治疗组大鼠弓状核暗神经元细胞器体积分数比较：线粒体[(5．82&;#177;0．91)，(3．22&;#177;0.66)，(5．88&;#177;0.43)％](F=6．89，P&;lt;0．05)、粗面内质网[3．66&;#177;0.35)，(5．72&;#177;0.79)，(3．84&;#177;0.36)％](F=25．28，P&;lt;0．05)和溶酶体[(1．82&;#177;0．53)，(3．68&;#177;0.72)，(2．28&;#177;0.49)％](F=24．64，P&;lt;0．05)的体积分数差异有显著性意义。经SNK检验显示，癫痫组线粒体体积分数下降(q=9．96，P&;lt;0．05)，粗面内质网(q=10．72，P&;lt;0．05)和溶酶体(q=7．15，P&;lt;0．05)的体积分数增加，其余未见明显差异(q≤3．08，P&;lt;0.05)。③治疗组和对照组间暗细胞各细胞器的体积分数和面数密度差异无显著性意义(F≤3．54，P&;gt;0．05)。结论：川芎嗪对癫痫脑损伤具有保护作用。     

促红细胞生成素对全脑缺血再灌注后神经细胞凋亡和诱导型一氧化氮合酶蛋白的影响

目的：观察促红细胞生成素(EPO)对短暂性全脑缺血再灌注后海马CA1区iNOS蛋白表达的影响，探讨其对缺血脑组织保护的可能机制。方法：应用四动脉血流阻断法制作大鼠短暂性全脑缺血再灌注模型；于再灌注开始时经腹腔注射EPO(3000U／kg)；48h灌注取脑。苏木精一伊红染色和TUNEL法染色观察海马CA1区神经细胞坏死和凋亡。应用免疫组织化学方法检测iNOS蛋白的表达。结果：短暂性全脑缺血15min再灌注后48h，苏木精一伊红染色海马CA1区存活神经元细胞数正常组(211．28&;#177;7．95)个／视野，假手术组为(209．28&;#177;11．34)个／视野，EPO治疗组海马CA1区存活神经元细胞数为(170．28&;#177;8．12)个／视野，缺血组为(146．84&;#177;8．35)个／视野。EPO治疗组与缺血组比较差异有显著性意义(P&;lt;0．01)。TUNEL法凋亡细胞测定，正常组无阳性细胞，假手术组阳性细胞(152．48&;#177;18．52)个／视野，EPO治疗组有(1797．51&;#177;151．35)个／视野，缺血组有(2250．41&;#177;180．06)个／视野，两者比较差异有显著性意义(P&;lt;0．01)。iNOS蛋白的表达测定，正常组无阳性细胞，假手术组海马CA1区阳性细胞区灰度值为5．36&;#177;1．54，EPO治疗组为31．80&;#177;6．42，缺血组为49．46&;#177;8．96。EPO治疗组与缺血组比较，两者差异有显著性意义(P&;lt;0．01)。结论：EPO可减少大鼠短暂性全脑缺血再灌注后神经元的死亡和凋亡，抑制iNOS蛋白的表达。     

胶质细胞源性神经营养因子对脊髓前角运动神经元的保护作用

目的：证实胶质源性神经营养因子(glial cell line—derived neurotrophic factor，GDNF)对脊髓前角运动神经元有保护作用。方法：切断SD大鼠一侧坐骨神经建立脊髓前角运动神经元损伤模型，借助单盲端硅胶管系统在损伤神经局部给予GDNF，术后不同时间分别取L5脊髓切片，利用酶组织化学染色方法显示胆碱酯酶和酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)活性并进行图像分析。结果：坐骨神经切断后第4，9，16及21d，对照组和GDNF组胆碱酯酶活性分别为21．53&;#177;1．54和23．67&;#177;1．08(P&;lt;0．05)，19．82&;#177;1．35和22．87&;#177;1．04(P&;lt;0．01)．22．55&;#177;1．20和25．25&;#177;1．13(P&;lt;0．01)，25．52&;#177;1．43和28．92&;#177;1．37(P&;lt;0．01)：对照组和GDNF组ACP活性(平均灰度)分别为37．49&;#177;1．39和35．40&;#177;1．18(P&;lt;0．05)，40．94&;#177;1．38和38．43&;#177;1．31(P&;lt;0．05)，22．55&;#177;1．20和25．25&;#177;1．13(P&;lt;0．05)．37．15&;#177;1．52和34．68&;#177;1．43(P&;lt;0．05)结论：GDNF对损伤的脊髓前角运动神经元有保护作用。     

针刺诱导脑缺血耐受的实验研究

目的：探讨预先针刺是否能诱导脑缺血耐受而具有脑保护作用及对神经元凋亡的影响。方法：实验在黑龙江中医药大学神经解剖教研室进行。取40只Wistar大鼠随机分为正常对照组、假手术组、脑缺血组、针刺预处理组各10只。针刺预处理组脑缺血前给予针刺，采用“4-动脉阻断”方法建立大鼠全脑缺血模型。神经元内氏体亚甲兰特殊染色法观察大鼠脑缺血后海马CA1区神经元内氏体变化；原位细胞凋亡检测法(TUNEL染色)及电镜观察脑缺血后大脑皮质、海马CA1区神经元凋亡情况。结果：脑缺血组皮质、海马CAl区可见大量棕色TUNEL染色阳性细胞核，皮质为(65．36&;#177;10．18)个／视野，海马CA1区(58．34&;#177;9．64)个／视野，针刺预处理组阳性细胞核皮质(10．63&;#177;5．39)个／视野，海马CAt区为(12．16&;#177;5．69)个／视野，较脑缺血组明显减少(q=6．55，8．73，P&;lt;0．05)，内氏体染色阳性细胞数脑缺血组皮质为(16．16&;#177;8．31)个／视野，海马CA1区(21.66&;#177;9．39)个／视野，针刺预处理组阳性细胞核皮质(55．36&;#177;12．19)个／视野，海马CAl区为(79．36&;#177;10．69)个／视野，较脑缺血组明显增多(q=7．65，9．23，P&;lt;0、05)。结论：针刺预处理可以诱导脑缺血耐受，减轻缺血后神经元损伤，抑制神经元凋亡可能是预先针刺发挥脑保护作用的一种途径。     

缺血缺氧及再灌注后海马神经元损伤的时间窗特性

目的：探讨缺血缺氧及再灌注损伤后大鼠海马神经元在伤后不同时间的凋亡及死亡特性，阐明神经元损伤发生的时间窗特征。方法：实验于2004—05／06在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所进行。体外培养胚胎大鼠海马神经元，模拟临床缺血过程致神经元缺氧损伤，采用Annexin V联合PI标记和流式细胞检测技术观察伤后不同时间点的凋亡与死亡情况。结果：海马神经元缺氧损伤后，其细胞损伤的形式为凋亡和坏死同时存在；模拟缺血15，30min，1．0，1．5，2．0，2．5和3．0h，其坏死率分别为(1．37&;#177;0．12)％，(3．71&;#177;0．34)％，(16．47&;#177;1．27)％，(18．73&;#177;2．02)％，(19．77&;#177;2．32)％，(22．13&;#177;2．12)％和(28．78&;#177;2．69)％，相互间差异有显著性意义(P&;lt;0．05)，各时间点的凋亡率分别为(6．23&;#177;1．67)％，(6．56&;#177;2．38)％，(6．73&;#177;2．42)％，(6．95&;#177;1．89)％，(7．16&;#177;2．82)％，(6．93&;#177;2．56)％和(7．23&;#177;2．89)％，凋亡率无明显变化(P&;gt;0．05)。各时间点再恢复糖和氧供应后至24h，海马神经元存活率进一步明显下降，坏死率进一步增多，各时间点神经元坏死率分别为(6．98&;#177;1．23)％，(8．46&;#177;1．37)％，(17．68&;#177;2．97)％，(20．79&;#177;3．16)％，(21．67&;#177;3．05)％，(35．53&;#177;3．33)％和(50．22&;#177;4．19)％，差异亦有显著性意义(P&;lt;0．05)；凋亡率亦逐渐增多，模拟缺血15，30min，1．0，1．5和2．0h时间点的再灌注24h，其神经元凋亡率分别为(11．89&;#177;2．06)％，(14．92&;#177;2．64)％，(28．67&;#177;3．05)％，(44．67&;#177;3．78)％和(61．67&;#177;4．89)％，差异有显著性意义(P&;lt;0．05)，但模拟缺血2．5h和3．0h时间点再灌注24h的神经元凋亡率为(27．76&;#177;3．15)％和(12．67&;#177;2．27)％，其凋亡率反而显示明显下降。结论：凋亡是延迟性神经元死亡的重要通路，脑缺血缺氧的干预治疗时间窗可以提前至2h内。     

三磷酸腺苷保护脊髓损伤神经元的细胞活力

目的：观察核苷酸类神经营养因子三磷酸腺苷对大鼠脊髓神经元损伤后细胞活力的影响。方法：取新生Wistar大鼠20只，切取脊髓，剪碎组织成糜状进行神经细胞培养。将培养的神经细胞分为3组，①无损伤对照组。继续完全培养液培养。②损伤组，培养第7天神经元用微量移液器塑料滴头行机械性划痕损伤后完全培养液培养。③三磷酸腺苷组，培养第7天神经元划痕损伤后加人终浓度为1．0mmol／L的三磷酸腺苷培养液培养。倒置相差显微镜观察细胞生长及不同时期细胞形态变化，各组于处理后10min，1，12，24和48h，细胞损伤程度，以乳酸脱氢酶法检测(乳酸脱氢酶渗漏量比值越大，说明细胞损伤越重)。检测各组细胞活性采用四甲基偶氮唑盐比色法(四甲基偶氮唑盐代谢率吸光度越高，说明细胞活性越高)。结果：①各组细胞损伤程度评估：以培养液中乳酸脱氢酶含量表示。伤后1，12，24和48h，损伤组和三磷酸腺苷组较对照组明显增加(P&;lt;0．05)；损伤24和48h，三磷酸腺苷组低于损伤组(17．94&;#177;0．82．23．05&;#177;1．04；18．52&;#177;1．12，24．88&;#177;1．16；P&;lt;0．05)。②体外培养的各组大鼠损伤神经元的变化：以四甲基偶氮唑盐代谢率表示。伤后1，12,24和48h，损伤组和三磷酸腺苷组明显低于对照组(P&;lt;0．05)，损伤24和48h，三磷酸腺苷组高于损伤组(0．24&;#177;0．03，0．18&;#177;0．04：0．27&;#177;0．03，0．15&;#177;0．05：P&;lt;0．05)。结论：细胞外三磷酸腺苷可以减轻机械性损伤后的脊髓神经元的损伤程度，增强细胞活力，对受损伤的神经元有一定的保护作用。     

次声作用引起大鼠海马细胞凋亡对学习记忆功能的影响

目的：次声是频率小于20Hz的声波，较广泛地存在于自然和社会环境中。脑是对次声作用较为敏感的器官。观察8Hz 90dB次声对大鼠海马CA1区细胞凋亡及Fas蛋白表达的影响，探讨相关机制。方法：将56只SD大鼠随机分为7个组，即对照组、次声作用7，14，21，28，35，42d组，每组8只。通过免疫组织化学方法观察海马CA1区各层Fas蛋白表达状态；通过TUNEL染色观察各层细胞凋亡情况。结果：CA1区各层Fas蛋白阳性表达7d组(12．83&;#177;2．18，32，5&;#177;3．21，2．73&;#177;1．25)均较对照组显著降低(P均&;lt;0．05)，14d组(74．03&;#177;9．27，80．58&;#177;14．33，22．87&;#177;3，34)。Fas蛋白阳性表达较7d组明显升高(P均&;lt;0．05)；21d(42．07&;#177;9．46，40．84&;#177;8．61)和28d（50．62&;#177;9.34，51．38&;#177;10．87)组分子层及多形层Fas蛋白阳性表达较14d组明显降低(P均&;lt;0，05)；21d组细胞层(7．13&;#177;2．28)Fas蛋白阳性表达较对照组明显降低(P&;lt;0．05)，28d组细胞层(38．16&;#177;3．42)Fas蛋白阳性表达较对照组明显升高(P均&;lt;0．05)；35d(30．12&;#177;9．37，34.89&;#177;14．5，18．47&;#177;5．26)、42d组(19．25&;#177;4．31。35．52&;#177;8．7,20．46&;#177;1．15)3层Fas蛋白阳性表达均显著下降(P均&;lt;0．05)，且与对照组无显著差异(P&;gt;0.05)。14d组各层均可见明显细胞凋亡，以多形层和分子层为著；21d组偶见细胞凋亡；其余各组均未见明显细胞凋亡。结论：8Hz 90dB次声作用后，大鼠海马CA1区Fas蛋白阳性表达1周受到抑制，14d左右Fas蛋白阳性表达代偿性增强，40d左右恢复到正常水平。次声作用后Fas蛋白高表达与细胞凋亡有密切关系。次声作用引起的海马细胞凋亡可能在次声引起的学习记忆功能障碍中起重要作用。     

实验性大鼠急性脑缺血细胞凋亡与相关蛋白表达的关系

目的：研究大鼠脑缺血再灌注后细胞凋亡及p53，Bcl-2蛋白家族表达的变化，并探讨它们在细胞凋亡中的作用。方法：实验在华北煤炭医学院形态实验室完成。54只大鼠用随机数字表法随机分成3组：脑缺血组(42只)、假手术组(6只)和正常组(6只)。脑缺血组又分为7组：即缺血2h再灌注1，3，6，12，24，48和72h组(n=6)。采用线栓法制作局灶性脑缺血再灌注模型，用TUNEL法检测细胞凋亡的变化，用免疫组化法检测p53，Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。结果：①缺血2h再灌注1h皮质区可见凋亡细胞[(7．83&;#177;1．72)个／高倍视野]，24～48h达高峰[(43．33&;#177;5．20)个／高倍视野，(48．50&;#177;6．25)个／高倍视野]，72h开始下降[(26．67&;#177;3．56)个／高倍视野](P&;lt;0．05，P&;lt;0．01)；缺血2h再灌注1h皮质区可见p53蛋白阳性细胞[(14．35&;#177;1．92)个／高倍视野]，24h达高峰[(48．00&;#177;6．42)个／高倍视野]，48h后开始下降[(31．00&;#177;6．60)个／高倍视野](P&;lt;0．05，P&;lt;0．01)；缺血2h再灌注1h皮质区可见Bcl-2蛋白阳性细胞[(28．62&;#177;6．80)个／高倍视野]，3h达高峰[(56．50&;#177;7．87)个／高倍视野]，6h后开始下降[(45．00&;#177;6．63)个／高倍视野](P&;lt;0．01)；缺血2h再灌注1h皮质区可见Bax蛋白阳性细胞[(45．83&;#177;4．07)个／高倍视野]，24h达高峰[(61．00&;#177;8．88)个／高倍视野]，48h开始逐渐下降[(45．83&;#177;6．49)个／高倍视野](P&;lt;0．05，P&;lt;0．01)。②缺血再灌注后不同时间点细胞凋亡数与p53及Bax蛋白的阳性表达数呈正相关(r=0．843，P&;lt;0．001；r=0．840，P&;lt;0．001)，与Bcl-2蛋白的阳性表达数呈负相关(r=-0．387，P&;lt;0．05)。结论：大鼠脑缺血再灌注后，缺血周边区发生明显的细胞凋亡，同时伴有p53及Bax蛋白表达增加及Bcl-2表达降低，p53及Bax蛋白表达对细胞凋亡起促进作用，而Bcl-2蛋白表达则对细胞凋亡起抑制作用。