免疫磁珠法分选人脑胶质瘤干细胞及其培养和鉴定

背景与目的:脑胶质瘤治疗效果一直不理想,这与胶质瘤细胞无限增殖能力和侵袭性生长有关,本研究旨在从人脑胶质瘤组织和细胞株中分离脑胶质瘤干细胞、进行体外培养并对其干细胞特性加以鉴定。方法:采用以CD133为标志的免疫磁珠法从人脑胶质瘤组织和细胞株中分离脑胶质瘤干细胞并进行体外培养,通过免疫荧光技术检测干细胞标志物CD133、Nestin,诱导分化后检查分化细胞标志物MAP2、GFAP、MBP以及电镜超微结构观察和移植SCID鼠致瘤实验,对其干细胞特性加以鉴定。结果:新鲜人脑胶质瘤组织和胶质瘤细胞株中存在一小部分CD133 的胶质瘤细胞,能表达干细胞的标志物CD133和Nestin,符合干细胞的超微结构特点,体外培养能连续传代;诱导分化后能产生MAP2、GFAP、MBP染色阳性的细胞;移植SCID鼠后能形成与亲本肿瘤表型一致的移植瘤。结论:新鲜人脑胶质瘤组织和胶质瘤细胞株中存在的一小部分CD133 胶质瘤细胞具有干细胞的属性,就是胶质瘤中的肿瘤干细胞,即胶质瘤干细胞。     

髓母细胞瘤中脑肿瘤干细胞的分离培养及鉴定

背景与目的:长期以来,脑肿瘤等实体肿瘤中是否存在肿瘤干细胞一直存在争论,最近已经有报道从胶质瘤和髓母细胞瘤等脑肿瘤及其它系统实体肿瘤中成功分离出肿瘤干细胞。本研究旨在利用简化的无血清培养基和悬浮培养方法,从人髓母细胞瘤中分离培养脑肿瘤干细胞,观察其在体外的增殖、分化,鉴定其特异性标志物CD133和Nestin的表达,验证肿瘤组织切片中CD133阳性细胞的存在,为脑肿瘤干细胞的进一步研究打下基础。方法:术中取11例患者髓母细胞瘤组织,分离成单细胞悬液,接种于含表皮生长因子、成纤维生长因子以及B27添加剂的无血清培养基中悬浮培养,以分离其中的脑肿瘤干细胞;对其增殖形成的脑肿瘤干细胞球连续传代培养;并进行单克隆形成实验,以确定原代肿瘤组织中肿瘤干细胞的百分率,观察脑肿瘤干细胞球的形成过程。然后,将脑肿瘤干细胞球接种于含血清培养基,观察脑肿瘤干细胞的分化现象。最后,利用免疫荧光法检测脑肿瘤干细胞特异性标志物CD133和Nestin在脑肿瘤干细胞球中的表达;利用免疫组化法检测组织切片中CD133阳性细胞的分布,并计算CD133阳性细胞百分率。结果:本组11例髓母细胞瘤中均仅有少数肿瘤细胞能够在无血清培养基中存活并悬浮生长、增殖形成克隆性脑肿瘤干细胞球,传代后脑肿瘤干细胞仍保持很强的自我更新和增殖能力。单克隆形成实验表明原代肿瘤细胞中具有单克隆形成能力的肿瘤干细胞百分率为(31.18±6.18)%。在含血清培养基中脑肿瘤干细胞发生贴壁分化,产生具有多种细胞形态的分化细胞。脑肿瘤干细胞表达神经干细胞的特异性标志物CD133和Nestin;肿瘤组织切片中CD133阳性细胞呈巢状或散在分布,占全部肿瘤细胞的(33.06±8.57)%。结论:人髓母细胞瘤组织中存在一定量的具有自我更新和增殖能力、表达CD133和Nestin的脑肿瘤干细胞,并能在体外将其分离、培养和诱导分化。     

胶质瘤干细胞的分离、培养及初步鉴定

目的:探讨人脑胶质瘤干细胞的培养和分离方法。方法:取9例脑胶质瘤患者的手术标本进行处理,采用B27培养基进行培养,碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子刺激细胞扩增;应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果:9例标本中共有7例成功培养出肿瘤细胞球,培养条件下呈悬浮状态生长,形成肿瘤细胞球,免疫细胞化学检测显示肿瘤球细胞表达胶质瘤干细胞的标志物CD133和Nestin,诱导分化后的肿瘤球细胞可以表达成熟神经细胞的标志物GFAP和TU-20。结论:体外的培养条件下,可以从胶质瘤组织中培养出胶质瘤干细胞,为胶质瘤的深入研究奠定基础。     

人脑胶质瘤组织中分离与培养肿瘤干细胞

目的 从胶质瘤组织中培养、分离肿瘤干细胞,并初步探讨其生物学特性。方法采集8例人脑胶质瘤手术标本,剪碎、胰酶消化,滤网过滤收集细胞。淋巴细胞分离液除去其中的红细胞,用含EGF、LIF和bFGF的无血清培养液培养,形成细胞球体后经免疫磁珠分离获取CD133^＋细胞,用有限稀释法继续在上述无血清培养基中培养得到肿瘤细胞球后连续传代培养。取第5代肿瘤干细胞,用含10％FBS培养液诱导分化。分化前后用Nestin、MAP2、GFAP免疫细胞化学染色检测肿瘤干细胞及其分化细胞的相应标志物。结果在1例间变性星形细胞、室管膜细胞混合瘤中克隆到了CD133^＋细胞,这些细胞在体外培养时,能稳定维持于球形生长状态（3个月,14代）,在适合的环境中随时能自我更新和增殖,并分化成MAP2^＋的瘤性神经元和GFAP^＋的瘤性胶质细胞,而CD133^-细胞则无此特性。结论在胶质瘤组织中有肿瘤干细胞存在,这些细胞在体外能长期培养和传代,可为进一步研究胶质瘤的细胞生物学和分子生物学特征开拓新途径。     

Tet-off/Tet-on基因工程鼠中脑肿瘤干细胞的克隆与鉴定*

目的:从Tet-off/Tet-on 转基因脑肿瘤小鼠模型中分离鉴定脑肿瘤干细胞,为进一步研究其是否起源于神经干细胞奠定基础。方法:从出现临床症状的转基因小鼠天幕区肉眼可见的肿瘤组织中取材,一部分做冰冻切片;另一部分制成单细胞悬液,培养于含生长因子的无血清培养基和含血清培养基。在光镜下观察常规病理,用相差显微镜和电镜分别观察细胞形态及其超微结构,用流式细胞仪检测Hoechst33342 阴性的SP细胞,以及其染色体倍体和细胞周期,免疫荧光染色检测细胞球体及其分化细胞中的神经巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、glialfibrillaryacidicprotein（GFAP）表达情况。结果:肿瘤位置均位于小脑天幕上下约2～3mm的松果体区域内,常规病理诊断为髓母细胞瘤。肿瘤细胞在无血清培养条件下,呈悬浮的球状生长,在含血清培养条件下贴壁分化成瘤性胶质细胞、神经元。电镜见到了核质比高、细胞器不发达、具干细胞特征的细胞。流式细胞仪检测肿瘤细胞球中的SP（sidepopulation）细胞为17.27% ,异倍体细胞为26.77% 。免疫荧光染色发现细胞球中大部分细胞表达干细胞标志物Nestin,少数细胞表达分化标志物GFAP和NSE 。与之相反,贴壁细胞大部分表达分化标志物微管相关蛋白2（MAP2）或胶质纤维酸性蛋白（GFAP）,同时共表达干细胞标志物Nestin。结论:Tet-off/Tet-on 转基因小鼠脑肿瘤组织中存在具有自我更新和多向分化潜能的脑肿瘤干细胞。      

SHG-44胶质瘤干细胞球的表型特点及其移植瘤病理特征

目的 研究SHG-44胶质瘤干细胞球的分子表型、致瘤能力及其移植瘤的病理学特征.方法 应用神经干细胞培养基(NSCM)培养SHG-44胶质瘤细胞株,获取其胶质瘤干细胞球,纯化培养后行细胞免疫(ICC)荧光染色检测CD133、兔抗人巢蛋白(nestin)、A2B5、小鼠抗人波形蛋白(vimentin)、血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR-2)和IDH R132H的表达;含血清培养基诱导其分化,ICC检测CD133、nestin、vimentin、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、β-Ⅲ tubulin和半乳糖神经鞘氨醇酶(GalC)的表达情况;建立SHG-44胶质瘤干细胞球原位移植瘤模型,免疫组织化学检测CD133、nestin、VEGFR-2、GFAP、S-100和CD34的表达;比较SHG-44细胞原位模型和SHG-44干细胞球移植瘤的病理学特征.结果 应用神经干细胞培养法能成功获取SHG-44胶质瘤干细胞球.第10代SHG-44胶质瘤干细胞球和SHG-44胶质瘤细胞的CD133阳性细胞比例分别为(71.63±5.92)％和(1.95±1.45)％.SHG-44胶质瘤干细胞球的nestin、vimentin、VEGFR-2和A2B5阳性细胞比例分别为(84.06±7.58)％、(29.11 ±3.44)％、(64.44±3.69)％和(14.08 ±2.19)％.SHG-44胶质瘤干细胞球中可见IDH R132H突变的细胞群.含血清培养基诱导分化后,CD133、nestin、vimentin、GFAP、β-Ⅲ tubulin和GalC阳性细胞比例分别为(1.89±1.27)％、(6.67±2.75)％、(93.75±2.95)％、(91.33±4.75)％、(82.36±4.02)％和(8.92±3.19)％.原位移植瘤组织中GFAP、S-100和VEGFR-2蛋白表达呈阳性,CD133和nestin蛋白表达呈阴性.极少量特异抗人CD34阳性细胞围绕成管状.SHG-44胶质瘤干细胞球颅内原位移植瘤局部浸润能力高于SHG-44胶质瘤细胞颅内原位移植瘤.结论 神经干细胞培养法可成功从SHG-44胶质瘤细胞株中获取胶质瘤干细胞,属于CD133+ A2B5-亚群,高表达VEGFR-2,具备自我更新及多向分化能力,可参与血管拟态的形成.     

人脑胶质瘤组织培养的干细胞样细胞具有体外高侵袭能力

目的:分离培养人脑胶质瘤干细胞样细胞(glioma stem-like cell,GSLC),研究其体外侵袭力。方法:选取中国医科大学第一医院神经外科2008年10月至2009年1月间住院患者手术切除的脑胶质瘤组织8例,以无血清成球培养法培养胶质瘤细胞球;免疫细胞化学实验检测其CD133的表达;荧光免疫显微镜观察其分化后胶质细胞标志物GFAP和神经元标志物TU-20的表达;matrigel侵袭实验检测其侵袭力,并与原代脑胶质瘤细胞进行比较。结果:成功分离培养出人脑胶质瘤细胞球细胞,该细胞表达干细胞标志物CD133;能自我更新与增殖;诱导分化后,GFAP和TU-20均为阳性表达,提示其为GSLC。胶质瘤细胞球细胞侵袭细胞数显著多于原代胶质瘤细胞[(261.23±87.20)vs(116.08±63.88)个,P<0.01];此外,胶质瘤细胞球细胞穿过matrigel胶后可再次聚集成球状生长。结论:成功分离培养人脑胶质瘤组织中的GSLC,其体外具有较高的侵袭力,可能参与脑胶质瘤的侵袭和转移。     

应用长春新碱分离与鉴定U87细胞系中的胶质瘤干细胞

背景与目的:研究表明,肿瘤干细胞具有化疗抵抗性.本研究拟利用肿瘤干细胞对化疗药物耐受的特性,在培养基中添加长春新碱的方法从人胶质瘤细胞系U87中分离鉴定肿瘤干细胞.方法:U87细胞于含血清培养基中贴壁后,换用含有5 ng/ml长春新碱的神经干细胞培养基培养,获得第一代肿瘤细胞球后,将单细胞接种于神经干细胞培养基中,获得第二代肿瘤细胞球.免疫荧光检测巢蛋白(nestin)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulin Ⅲ)、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)在第二代肿瘤细胞球及其分化细胞中的表达.结果:成功地获得了第一代肿瘤细胞球以及来源于单细胞的第二代肿瘤细胞球;细胞间紧密相贴,表面较光滑;神经干细胞标志物nestin在第二代肿瘤细胞球中呈阳性表达;第二代肿瘤细胞球分化细胞中可检测到nestin、GFAP、β-tubulin Ⅲ、MBP的表达.结论:U87细胞系中存在具有自我更新及多向分化能力的胶质瘤干细胞,采用神经干细胞培养基中添加长春新碱的方法能简单有效地从胶质瘤细胞系中分离培养出胶质瘤干细胞.     

miR-218对胶质母细胞瘤细胞成熟分化的影响

  目的  观察miR-218对胶质母细胞瘤细胞系成熟分化的影响。  方法  通过质粒转染和G418筛选建立稳定过表达miR-218的SNB-19亚细胞系及对照亚细胞系。利用qRT-PCR及Western blot检测稳定细胞系中miR-218、CD133及Nestin表达水平。用GFAP免疫细胞化学染色评价其成熟分化水平,通过免疫荧光观察转染miR-218表达质粒后CD133及Nestin阳性细胞的分布情况。  结果  过表达miR-218的亚细胞系中miR-218、CD133及Nestin表达水平分别是对照细胞的26.23倍、17.9%及54.2%,过表达miR-218细胞的GFAP阳性标记指数为（96.0±3.81）%显著高于对照细胞（49.6±5.13）%（t=16.24,P < 0.01）。免疫荧光显示CD133及Nestin的下调特异性发生于成功转染miR-218表达质粒的细胞。  结论  miR-218可通过促进胶质瘤干细胞的成熟分化显著下调CD133及Nestin的表达水平,该作用可能是miR-218抑制胶质瘤细胞增殖的重要机制之一。      

人脑胶质瘤干细胞SHG-44s的克隆及初步鉴定

目的:探讨人脑胶质瘤体外细胞系中存在肿瘤干细胞的可能性.方法:将SHG44细胞系和SHG44-9细胞株,分别应用含血清培养基(DMEM 10?S)和无血清培养基(DMEM/F12,添加bFGF、LIF和EGF)培养.用CD133免疫磁珠分离干细胞、Hoechst33342和NESTIN流式细胞仪、Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色检测肿瘤干细胞及其分化细胞.结果:CD133磁珠分离得到的干细胞的比例:在血清组SHG44和SHG44-9分别为0.021%和0.035%:无血清组分别为1.2%和2.3%.而Hoechst33342和CD133标记后流式细胞仪检测干细胞比例:血清组中SHG44、SHG44-9分别为1.5%、0.37%;无血清组分别为16.4%和29.1%.并且这些细胞能够增殖和分化成神经元和胶质细胞.而Nestin标记后SHG44、SHG44-9中分别有51.05%、77.53%阳性细胞.结论:体外长期传代培养的人脑胶质瘤细胞系中存在肿瘤干细胞SHG44s,CD133磁珠和Hoechst33342流式细胞仪分离和检测胶质瘤干细胞是行之有效的方法,而Nestin 细胞是干细胞分化后的祖细胞或前体细胞,不能作为分离和检测干细胞特异性标记物使用.     

Pharmacogénétique des fluoropyrimidines. La méthylènetétrahydrofolate réductase

Résumé: Lefficacité optimale des fluoropyrimidines nécessite des concentrations élevées en 5-10 méthylènetétrahydrofolate (CH₂FH₄), contrôlées par la méthylènetétrahydrofolate réductase (MTHFR) qui convertit irréversiblement le CH₂FH₄ en 5-méthyltétrahydrofolate (CH₃FH₄). Les polymorphismes 677CT et 1298AC du gène MTHFR sont associés à une baisse dactivité de lenzyme. Les tumeurs «MTHFR mutées» devraient donc être plus sensibles aux fluoropyrimidines que les tumeurs «MTHFR sauvages». Les études expérimentales et cliniques publiées à ce jour tendent à montrer une plus grande sensibilité au 5-FU (associé ou non à lacide folinique) dans les tumeurs MTHFR mutées par rapport aux tumeurs sauvages. Ces résultats montrent la nécessité de poursuivre ces recherches afin de confirmer limpact de ces polymorphismes sur lefficacité des fluoropyrimidines.     

Oncogénétique et psycho-oncologie, une collaboration recommandée...

Résumé: La possibilité depuis 1994, de connaître la probabilité individuelle de développer certains cancers a permis de proposer de nouvelles modalités de prévention, de traitements et contribué au développement actuel de loncogénétique. Une meilleure connaissance des répercussions psychologiques tant pour les patients que pour les apparentés est désormais possible et limplication des psycho-oncologues dans ce cadre de la réalisation des tests prédictifs, recommandée. La mission de «messager» qui incombe au «cas-index» doit faire lobjet dune attention particulière. La complexité de linformation et la dimension paradoxale que peut avoir parfois la communication à propos des choix, rend difficile lévaluation de la qualité du consentement. La situation particulièrement délicate dune aide à la décision à légard de la chirurgie prophylactique, exige une collaboration étroite des généticiens et des psycho-oncologues.Les soins de support en oncologie     

The role of papillomaviruses in human cancers

This review comprehensively evaluates the influence of gene-gene, gene-environment and multiple interactions on the risk of colorectal cancer (CRC). Methods of studying these interactions and their limitations have been discussed herein. There is a need to develop biomarkers of exposure and of risk that are sensitive, specific, present in the pathway of the disease, and that have been clinically tested for routine use. The influence of inherited variation (polymorphism) in several genes has been discussed in this review; however, due to study limitations and confounders, it is difficult to conclude which ones are associated with the highest risk (either individually or in combination with environmental factors) to CRC. The majority of the sporadic cancer is believed to be due to modification of mutation risk by other genetic and/or environmental factors. Micronutrient deficiency may explain the association between low consumption of fruit/vegetables and CRC in human studies. Mitochondrial modulation by dietary factors influences the balance between cell renewal and death critical in colon mucosal homeostasis. Both genetic and epigenetic interactions are intricately dependent on each other, and collectively influence the process of colorectal tumorigenesis. The genetic and environmental interactions present a good prospect and a challenge for prevention strategies for CRC because they support the view that this highly prevalent cancer is preventable.     

裘法祖教授生平

Prof.Fazu Qiu,member of the Chinese Communist Party,surgery professor of Tongji Hospital,departed in Tongji Hospital,Wuhan,China,at fourteen to nine a.m,June 14,2008,after a disease.He turns 94 this year.He was the senior academician of the Academia Sinica,the illustrious medical scientist of China,and the Honorary Director of Tongji Medical College,as well as Huazhong University of Science & Technology.     

Antifungal combination therapy in localized candidosis

A mouse model of localized candidosis in air-filled subcutaneous cysts imitating thrush has been developed. We have now tested various antifungal combinations in this animal model. Flucytosine (5-FC) + amphotericin B (Amph B) showed the highest efficacy, a clear additive or even synergistic effect was seen. The combination of 5-FC + imidazole or triazole derivative was less efficacious, an additive effect was rare. The combination of 5-FC + Amph B was also tested against Candida albicans strains showing various degrees of 5-FC-resistance. A significant reduction in 5-FC-resistant mutants was seen after the treatment with the combination.     

Les génériques en cancérologie: à molécule identique, médicaments identiques? Les biosimilaires, des super-génériques?

Résumé: Les biosimilaires vont bientôt voir leur apparition en Europe. Comment un laboratoire peut-il aborder le développement de son dossier dAMM? Quelles sont les bases légales et les recommandations officielles? Comment la similarité et/ou le caractère générique peuvent-ils être démontrés? Les règles sont-elles identiques à celles des produits chimiques conventionnels pour lesquels, notamment en cancérologie, il existe des médicaments génériques? Comment faire pour que la sécurité et lefficacité des médicaments biosimilaires soient assurées pour les patients?     

Dermatomycosis in Dogs

During the routine examination of dogs for cutaneous lesions, 205 dogs were screened for fungi other than dermatophytes. Twenty-two dogs (10.8%) revealed the presence of non-dermatophytic fungi suspicious for representing the etiologic agents of the skin lesions. The fungi isolated were Alternaria sp. (2.9%), Penicillium sp. (2.4%), Aspergillus fumigatus (2.0%), Mucor sp. (1.5%), Cladosporium sp. (1.5%) and Fusarium sp. (0.5%). No dermatophyte was isolated in association with these fungi. The incidence of these infections was found to be greater in warm and humid climate.     

PSA-Test zur Früherkennung des Prostatakarzinoms

Zusammenfassung Prostatakrebs ist hierzulande seit einigen Jahren die häufigste Krebserkrankung bei Männern. Da über die Ätiologie wenig gesichertes Wissen vorliegt und daher kaum Möglichkeiten zur primären Prävention bestehen, konzentrieren sich die Anstrengungen auf die Suche nach wirksamen Verfahren zur sekundären Prävention. Hierbei gilt die Verwendung des PSA-Tests zur Früherkennung des Prostatakarzinoms als derzeit aussichtsreichstes Verfahren. Bevor ein neues Früherkennungsverfahren zur breiten Anwendung empfohlen oder in das gesetzliche Früherkennungsprogramm aufgenommen wird, muss jedoch seine Wirksamkeit in hierfür geeigneten wissenschaftlichen Untersuchungen nachgewiesen werden. Bis jetzt gibt es bereits eine ganze Reihe epidemiologischer Studien zur Effektivität des PSA-Screenings, doch konnte ein Wirksamkeitsnachweis bisher nicht erbracht werden. Zwei große randomisierte Studien in Europa und den USA lassen für die Jahre 2005–08 erste Ergebnisse erwarten. Da epidemiologische Arbeiten belegen, dass durch PSA-Screening eine nicht unerhebliche Überdiagnostik und Übertherapie eintritt, d. h. Schaden angerichtet werden kann, ist das Ergebnis der genannten randomisierten Studien vor weitergehenden Entscheidungen unbedingt abzuwarten. Bis dahin sollte von der Anwendung des PSA-Tests zur Prostatakrebsfrüherkennung unmissverständlich abgeraten werden. Da für den Test bereits ausgiebig Werbung betrieben wurde, kommt einer gründlichen ärztlichen Aufklärung von an dem Test interessierten Personen eine Schlüsselrolle zu.     

Cancer immunotherapy

Unprecedented progress has seen made in the last decade in the field of cancer immunotherapy. The recent approval of nivolumab （Opdivo）, the first anti-programmed cell death-1 （PD-1） antibody, for metastatic melanoma in Japan, marked a milestone in the rapidly advancing field of cancer immunotherapy. Nivolumab together with ipilimumab （Yervoy）, the anti-cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 （CTLA-4） antibody, are the first 2 drugs in the class of ＂immune checkpoint inhibitors＂ that have delivered impressive responses in patients with metastatic melanoma and renal cell cancer （RCC） as well as a variety of solid tumors.