人精子蛋白SP22在睾丸、精子中的分布与定位

目的：以原核表达的人精子蛋白SP22制备其兔多克隆抗体,研究人精子蛋白SP22在人睾丸和精子中的分布与定位。方法：在E.Coli中诱导表达SP22基因,以纯化出的重组人精子蛋白htSP22为抗原制备兔抗人SP22多克隆抗体,运用免疫组织化学分析SP22在人睾丸和精子中的分布与定位。结果：表达出了分子量约22000的重组htSP22蛋白,制备获得了能特异性识别睾丸、精子中天然SP22蛋白的兔抗人SP22多克隆抗体。免疫组织及细胞化学证明SP22存在于曲细精管中各类生精细胞及精子头部表面。结论：制备的抗体具有特异性,SP22存在于睾丸曲细精管中各类生精细胞及精子头部表面。     

重组人精囊蛋白1片段的原核表达及其对精子活率的影响

目的通过对人精囊蛋白1(semenogelin I,SEMGI)第165~281位氨基酸序列片段(△SEMGI)的原核表达、纯化与鉴定,分析不同质量浓度下的该片段对精子活率影响。方法通过PCR扩增△SEMGI片段目的基因,与p MAL-c2x-tev载体重组;重组质粒转化ROSETTAⅡ后IPTG诱导表达,目的蛋白经过Amylose层析柱、Ni柱、分子筛纯化、免疫印迹法和蛋白质谱分析鉴定。最终,在4个不同蛋白质量浓度下孵育并分析其对人精子活率的影响。结果蛋白质谱分析证实△SEMGI蛋白片段重组成功,其在不同质量浓度下对精子活率均有抑制作用(P0.05)。结论重组精囊蛋白1的C端片段具有抑制精子活率功能,为进一步研究蛋白结构提供基础。     

人精子结合蛋白HBRP的抗体制备及定位

目的制备人类新的精子结合蛋白HBRP的单克隆抗体,确定其在精子的定位及其与精子功能相关的作用。方法分别利用PCR、Western blot、动物免疫、血清纯化等方法得到HBRP单克隆抗体,用ELISA方法检测抗体滴度;利用间接免疫荧光方法观察HBRP在精子的定位。结果经纯化鉴定获得HBRP融合表达蛋白;首次获得HBRP单克隆抗体;应用制备的单克隆抗体,确定HBRP主要结合在精子尾部的中段和主段。结论 HBRP结合在人成熟精子尾部的中段和主段,提示其参与精子运动功能的调控。     

Kinase-Glo激酶发光法体外测定蛋白激酶A活性

目的:建立一种简便、无害的体外测定PKA激酶活性的非放射性核素方法。方法:采用RT-PCR方法从HEK293细胞的总RNA中扩增PKAα的cDNA,并将PKAα的cDNA克隆至pGEX-6p-1载体中。经纯化后的体外表达蛋白用免疫印迹(Western blot)法进行鉴定。最后采用非放射性核素法Kinase-Glo激酶发光检测试剂盒测定表达蛋白GST-PKAα的活性。结果:经过优化诱导条件,我们成功地纯化得到了GST-PKAα的融合蛋白。用非放射性核素法Kinase-Glo激酶发光检测试剂盒测定纯化蛋白GST-PKAα活性。我们还用PKA特异性抑制剂H-89进一步确定了表达蛋白GST-PKAα的活性,并且测定了其IC50值为(35.2±3.97)nmol/L,与报道值一致。结论:Kinase-Glo激酶发光检测法测定PKA激酶活性,操作简便、对人体无害。此方法能有效应用于临床前PKA激酶抑制剂的高通量筛选、PKA激酶新作用靶点的发现以及靶向蛋白PKA磷酸化位点的研究。     

重组人卵透明带蛋白及其多克隆抗体对精子-透明带结合的影响

为了探讨毕赤酵母表达的重组人卵透明带ZP3蛋白(recombinant human zona pellucida-3 protein,rhZP3)及其多克隆抗体对小鼠和人精卵结合的影响,采用不同浓度的rhZP3以及空白培养液分别处理小鼠精子,然后再与小鼠卵子进行结合实验,观察经过不同处理的精子对透明带黏附及体外受精率的影响;用rhZP3以及空白培养液分别处理人精子,然后再与人卵子进行结合实验,观察经过不同处理的精子对透明带黏附的影响;用抗rhZP3抗体与阴性血清分别处理小鼠和人卵子,再与精子进行结合实验,观察多克隆抗体对精子粘附以及小鼠体外受精率的影响。实验结果表明,rhZP3和抗rhZP3多克隆抗体既能抑制人的体外精卵结合,也能抑制小鼠体外精卵结合,提示rhZP3具有天然透明带的特性,有发展成避孕疫苗和作为检测透明带抗体检测试剂的可能。     

兔抗人精子顶体精子溶菌酶样蛋白1结合蛋白(SAS1B)多克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备兔抗人精子顶体精子溶菌酶样蛋白1结合蛋白(SAS1B)多克隆抗体.方法 构建pET-22b-SAS1 B-His质粒,转化E.coli.BL21(DE3)细胞,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导SAS1B重组蛋白表达.用层析纯化后的蛋白免疫日本大耳白兔制备SAS1B多克隆抗体.ELISA检测SAS...     

微波局部照射小鼠睾丸对精子染色体的影响

精细胞是男性遗传物质代代相传的唯一联系，了解微波辐射对生精细胞遗传物质的影响，将有益于微波的应用和防护。本实验应用２４５０ＭＨ：微波局部照射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠睾丸，在睾九内温度达４１±０．５℃后维持１５分钟。对动物分别照射１或３次，于东次照射后二个月观察精子单倍染色体。结果显示，精子染色体的改变主要为非整倍体的增加，但和对照间无显著性差异（Ｐ＞０．０５）．该结果说明，一定剂量的微波照射，对生殖细胞的遗传物质无显著的远后效应。     

人类睾丸精子和附睾精子的顶体蛋白酶活性

目的：探讨人类睾丸精子和附睾精子的顶体蛋白酶活性。方法：应用明胶薄层试验、穿卵试验和透射电镜观察顶体蛋白酶活性及其影响。结果：未经洗涤的睾丸精子和附睾精子不出现明显的晕轮，洗涤后则显示出顶体蛋白酶活性。附睾精子组的平均晕轮直径显著高于睾丸精子组（Ｐ＜００１）。附睾精子能与去透明带地鼠卵受精。老化和畸形的附睾精子降低或丢失酶活性。结论：睾丸精子已初步发育具功能活性的顶体蛋白酶，进入附睾顶体蛋白酶逐渐发育至功能成熟，而曲细精管和附睾管内液体存在着抑制酶活性的物质     

人IL-18结合蛋白A在CHO细胞中表达的研究

目的 克隆人IL－18结合蛋白A（hIL-18BPa)的cDNA，构建真核表达载体及其在CHO细胞中的表达。方法 采用RT－PCR，自人白血病血细胞株Jurkat中获得hIL-18BPa的cDNA。将其克隆至T-vector中，经测序确证后，将该基因定向插入真核表达载体pcDNA3．1中。以脂质体介导法，将其转染CHO细胞，用G418筛选抗性克隆，ELISA法测定其生物学活性。结果 获得的IL-18BPa的cDNA序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。将hIL-18BPa插入载体pcDNA3．1后，成功地构建稳定表达的载体。转染CHO细胞2后，获得可稳定表达hIL-18BPa的基因工程细胞株。经纯化后，证明具有良好的生物学活性。结论 成功地克隆hIL-18BPa基因，并实现了在CHO细胞中的稳定表达，为研究其生物学活性奠定了基础。     

微波局部照射小鼠睾丸对睾丸,附睾及精子的形态影响

微波作为环境污染物，其对人类的危害已逐渐受到人们的重视，尤其生殖细胞，不但对微波第三，而且在人类遗传学占有独特的。本实验应用２４５０ＭＨＺ微波局部照射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠睾丸，于照后不同时间观察睾丸附睾和精子的形态学改变，结果表明，微波可引起各级生精细胞以浊肿为主的病理学改变，并存在不均一性，持久性，不同的细胞具有不同的敏感性等特点，精子的形态学改变表现为大头畸形增多（Ｐ＜０．０５－０．０１），超微结     

人甲状腺癌组织中蛋白激酶C和蛋白激酶A活性变化的实验研究

本研究测定了8例恶性甲状腙癌病人和7例良性甲状腺瘤病人手术切除的肿瘤组织中蛋白激酶C（PKC)和蛋白激酶A（PKA）的活性变化，结果显示：恶性甲状腺癌组织中胞膜和胞浆PKC括性分剐比良性甲状腺瘤组织中胞膜和胞浆PKC恬性高14倍和23倍；恶性性甲状腺癌组织中PKA活性比良性甲状腺瘤组织中PKA恬性高2.6倍：恶性性甲状腺癌组织中PKC：PKA比值为4.2良性甲状腺瘤组织中PKC：PKA比值为4.2良性甲状腺瘤组织中PKC：PKA比值为0.53。PKC:PKA比值为0．53．PKC和PKA的激活是甲状腺癌细胞恶性增殖的原因之一，PKC和PKA都参予甲状腺癌细胞增殖过程的细胞内信息传递．而其中PKC的作用似乎更为重要。     

吗啡长时程作用对小鼠脑组织蛋白激酶A及C活性的影响

本文通过复制小鼠吗啡耐受依赖模型，观察了吗啡长时程作用对小鼠脑组织ＰＫＡ及ＰＫＣ活性的影响。结果发现：（１）吗啡耐受依赖小鼠纹状体、海马、大脑皮层神经细胞胞浆ＰＫＡ活性显著升高，而小脑胞浆及以上各部位膜相ＰＫＡ活性变化不明显；（２）不同脑组织中ＰＫＣ活性变化不同，吗啡耐受依赖小鼠大脑皮层及小脑胞浆ＰＫＣ活性明显升高，在纹状体胞浆则显著下降，但纹状体膜相ＰＫＣ活性却显著增加，海马及小脑膜相ＰＫＣ活性则明显降低；（３）纳洛酮可拮抗吗啡引起的上述变化。结果提示：一些脑组织胞浆ＰＫＡ活性的升高、ＰＫＣ活性的变化以及可能存在的ＰＫＣ于胞浆和膜相之间的移位可能是吗啡耐受依赖的重要生化基础，且此变化可能由阿片受体所介导。     

藻酸双酯钠抑制蛋白激酶C活性

大鼠肝脏经匀浆、硫酸铵盐析和DEAE-纤维素柱层析,得到部分纯化的蛋白激酶C。将此酶制剂在体外与藻酸双酯钠孵育,藻酸双酯钠对蛋白激酶C活性呈剂量依赖性的抑制作用。     

原癌蛋白Pim-1激酶-GST融合蛋白的纯化及其激酶活性的分析

在大肠杆菌中成功表达了人原癌蛋白Pim 1激酶 GST融合蛋白 ,并对其激酶活性进行了分析。结果 :Pim 1 GST融合蛋白具有激酶活性 ,体外能使人工底物组蛋白H1发生磷酸化。其激酶活性发挥的适宜条件为pH7 5 ,10mmol/LMgCl2 的反应体系。过高的离子浓度和过高或过低的pH值均抑制其激酶活性的发挥。     

尾加压素Ⅱ促进大鼠心肌胶原蛋白表达及乳鼠心肌成纤维细胞的增殖

目的探讨尾加压素Ⅱ(UⅡ)对大鼠心肌纤维化的影响。方法腹主动脉缩窄术建立慢性压力超负荷大鼠心力衰竭模型,大鼠分为假手术组、造模4、8和12周组。利用Western blot分析心肌组织中UⅡ、G蛋白偶联受体(GPR14)、胶原Ⅰ(col-Ⅰ)、Ⅲ(col-Ⅲ)及蛋白激酶A(PKA)的表达。体外培养乳鼠成纤维细胞,分为对照组、UⅡ处理组、UⅡ+KT5720处理组及UII+SB-611812组。镜下观察及CKK-8法检测细胞增殖。结果模型组大鼠心肌组织中UⅡ、GPR14、col-Ⅰ、col-Ⅲ蛋白及PKA的表达显著增加,且呈时间依赖性。UⅡ促进乳鼠成纤维细胞(CFs)的增殖(P0.05),而KT5720、SB-611812可抑制UⅡ对乳鼠成纤维细胞的促增殖作用。结论 UⅡ及其受体系统促进大鼠心肌纤维化的发生发展。     

低脂饮食和有氧运动干预对高脂大鼠脂肪组织蛋白激酶B表达的影响

目的 :观察低脂饮食和有氧运动对高脂大鼠脂肪组织中蛋白激酶B(PKB)表达的影响。方法 :选取雄性Wistar大鼠 4 0只 ,随机分为正常对照组 ( 10只 )和模型组 ( 30只 )。模型组大鼠给予高脂喂养 ,4周后 ,再随机分为 3组 :胰岛素抵抗组 ,继续高脂饮食 ;低脂饮食组 ,给予低脂饮食 ;有氧运动组 ,继续高脂饮食 +有氧运动。干预 6周后 ,蛋白印迹法检测大鼠脂肪组织中胰岛素刺激PKB表达的含量变化。结果 :低脂饮食组和有氧运动组大鼠空腹血糖 (FBG)、甘油三酯 (TG)、胆固醇 (TC)、内脏脂肪及胰岛素抵抗指数 (HOMA IR)下降 ,胰岛素敏感指数 (ISI)显著升高。而PKB蛋白表达分别增加了 16 .1%和 19.2 %(P <0 .0 1)。结论 :低脂饮食和有氧运动能改善胰岛素抵抗 ,可能与增加脂肪组织中PKB蛋白表达有关。     

去甲肾上腺素影响单核细胞抗原提呈的机制

１０＾－１３～１０＾－９ｍｏｌ／Ｌ的去甲肾上腺素体外作用时能促进人外周血单核细胞的抗原提呈功能（ＡＰＦ）。ＰＫＣ激活剂ＰＭＡ和抑制剂４ａ－ＰＤＤ分别能加强和抑制ＮＥ对Ｍｏｎ的ＡＰＦ的促进作用；异搏定能抑制ＮＥ的这种作用，而ＰＫＡ的抑制剂ＰＫＩ对ＮＥ的这种作用无。结果提示ＮＥ促进ＭｏｎＡＰＦ的机制可能涉及到Ｃａ＾２＋和ＰＫＣ，而与ＰＫＡ无关。     

Genetic Evidence for a Role for Protein Kinase A in the Maintenance of Sleep and Thalamocortical Oscillations

Study Objectives:

Genetic manipulation of cAMP-dependent protein kinase A (PKA) in Drosophila has implicated an important role for PKA in sleep/wake state regulation. Here, we characterize the role of this signaling pathway in the regulation of sleep using electroencephalographic (EEG) and electromyographic (EMG) recordings in R(AB) transgenic mice that express a dominant negative form of the regulatory subunit of PKA in neurons within cortex and hippocampus. Previous studies have revealed that these mutant mice have reduced PKA activity that results in the impairment of hippocampus-dependent long-term memory and long-lasting forms of hippocampal synaptic plasticity.

Design:

PKA assays, in situ hybridization, immunoblots, and sleep studies were performed in R(AB) transgenic mice and wild-type control mice.

Measurements and Results:

We have found that R(AB) transgenic mice have reduced PKA activity within cortex and reduced Ser845 phosphorylation of the glutamate receptor subunit GluR1. R(AB) transgenic mice exhibit non-rapid eye movement (NREM) sleep fragmentation and increased amounts of rapid eye movement (REM) sleep relative to wild-type mice. Further, R(AB) transgenic mice have more delta power but less sigma power during NREM sleep relative to wild-type mice. After sleep deprivation, the amounts of NREM and REM sleep were comparable between wild-type and R(AB) transgenic mice. However, the homeostatic rebound of sigma power in R(AB) transgenic mice was reduced.

Conclusions:

Alterations in cortical synaptic receptors, impairments in sleep continuity, and alterations in sleep oscillations in R(AB) mice imply that PKA is involved not only in synaptic plasticity and memory storage but also in the regulation of sleep/wake states.

Citation:

Hellman K; Hernandez P; Park A; Abel T. Genetic evidence for a role for protein kinase a in the maintenance of sleep and thalamocortical oscillations. SLEEP 2010;33(1):19-28.     

机械牵张对大鼠心室肌蛋白激酶B磷酸化及心钠素分泌的影响

目的:研究机械牵张对大鼠心肌蛋白激酶B(Akt)活化和心钠素(ANF)分泌的影响。方法:采用Langendorff方法灌流大鼠心脏,膨胀球囊持续牵张左心室,从左心室游离心肌,提取胞浆蛋白,用Western blot检测磷酸化Akt、总Akt水平;收集冠脉流出液,用放射免疫分析法检测冠脉流出液中ANF含量。结果:持续牵张不影响灌流心脏的心率和冠脉流出量。但经过20min持续牵张,牵张组心脏灌流液中ANF含量(209.89±65.45pg/ml)较对照组(108.84±25.18pg/ml)明显增高(P<0.01);牵张组大鼠左心室心肌组织磷酸化Akt水平(0.76±0.03)明显高于对照组(0.32±0.02),而总Akt水平与对照组相比无显著性差异。结论:机械牵张可引起心脏心钠素的分泌增加,其机制可能与胞内Akt信号通路的激活有关。