经VEGF165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物的构建与临床应用

目的构建经血管内皮生长因子165(VEGF165)转染的人成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,并对其在促进深度烧伤患者创面愈合过程中的作用进行评价。方法将30例深Ⅱ度或Ⅲ度烧伤患者随机分为2组,每组15例。移植转染有VEGF165成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物组为实验组,单纯脱细胞异种真皮替代物移植组为对照组。采用分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至经传代培养的人成纤维细胞,再将转染后的人成纤维细胞接种于猪脱细胞真皮表面得到成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物;而后将此替代物与自体薄皮片移植于深度烧伤患者切痂后创面,对创面愈合情况进行观察并与单纯脱细胞真皮移植组进行比较。结果构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165可成功转染人成纤维细胞,经转染的人成纤维细胞可顺利接种于脱细胞真皮形成成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,替代物移植后实验组患者皮片成活率(90.25±5.39)%,对照组患者皮片成活率(83.98±3.63)%,两者有显著性差异(t=3.737,P<0.01)。实验组新生的毛细血管数量要明显多于对照组。结论经VEGF165转染的人成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物具有显著的促进深度烧伤患者创面愈合的作用。     

c-FOS在VEGF 165基因治疗大鼠脑梗死中的表达

目的：观察c-FOS蛋白在血管内皮生长因子165(VEGF 165)基因治疗大鼠脑梗死中的表达情况，为。临床脑梗死的治疗提供分子学依据。方法：将Wistar大鼠制成永久性大脑中动脉闭塞模型，7d后断头取脑，用免疫组化的方法显示脑中c-FOS的表达情况。结果：正常组和假手术组大鼠各脑区无c-FOS表达，梗死组、空载质粒组及基因组均有表达，以基因组最显著。结论：脑缺血及VEGF 165基因均可诱导c-FOS的表达。     

重组人MBL在CHO细胞中的表达及检测

[目的]在CHO-K1细胞中表达重组MBL并进行检测。[方法]构建真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mbl，用阳离子转染试剂Transfast转染CHO-K1细胞，G418筛选稳定转染的细胞。应用RT-PCR、ELISA及免疫荧光检测重组MBL的表达。[结果]RT-PCR从稳定转染pcDNA3.1（＋）-mbl的CHO-K1细胞中检测到mbl基因的表达，夹心ELISA并未从转染细胞上清中检测到重组MBL，免疫荧光表明稳定转染pcDNA3．1（＋）-mbl的CHO-K1细胞能够在胞浆中表达重组人MBL。[结论]成功构建真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mbl并转染CHO-K1细胞，转染的细胞能够表达重组人MBL。     

血管内皮生长因子(VEGF165)真核表达载体的构建与鉴定

目的　构建人VEGF16 5腺病毒表达载体 ,探讨应用血管内皮生长因子 (VEGF)基因治疗脑梗死的可行性。方法　采用分子克隆技术 ,以质粒hVEGF16 5·SR为模板 ,扩增hVEGF16 5成熟cDNA。经穿梭质粒PShuttle克隆到腺病毒质粒上 ,构成Adeno VEGF16 5腺病毒重组质粒 ,经酶切及测序鉴定正确后 ,包装成为重组Adeno VEGF16 5腺病毒 ,并进行电镜观察及滴度测定。用免疫印迹及免疫组化方法检测VEGF蛋白的表达。结果　经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功 ,电镜显示包装细胞中有病毒存在 ,包装的病毒滴度为 8× 10 1 0 pfu ml,免疫印迹及免疫组化检测有VEGF16 5蛋白的表达 ,而对照未见VEGF16 5转录和表达。结论　构建的VEGF16 5腺病毒表达载体可在体外表达 ,VEGF基因有可能用于治疗脑梗塞     

膀胱移行细胞癌VEGF的表达及其意义

目的:探讨VEGF在膀胱移行细胞癌(BTCC)中的表达及其与BTCC生物学行为的关系。方法用流式细胞技术(FCM)对40例BTCC和20例正常膀胱黏膜细胞组织标本进行VEGF阳性细胞检测。结果BTCC组织中VEGF阳性细胞比率为(34.50±15.57)%,在正常膀胱黏膜组织中的VEGF阳性细胞比率为(13.30±6.23)%,两者比较差异有统计学意义(P<0.01);临床分期Tis~T1为(27.07±10.76)%,T2~T4为(48.29±13.77)%,病理分级Ⅰ级为(22.4±38.15)%,Ⅱ级为(35.01±9.95)%,Ⅲ级为(53.09±12.39)%;随着分期分级的增加,VEGF的表达率也逐步增加,差异有统计学意义(P<0.01)。结论VEGF定量分析可作为BTCC的生物学行为评估方法之一。     

BMP-2基因转染对hBMSC增殖、分化及VEGF表达的影响

实验表明，Ad-BMP-2转染hBMSC后，外源基因可高效导入细胞（转染效率接近100％）。BMP-2免疫组化和原位杂交染色结果阳性，Western Blot检测证实转染的hBMSC表达基因产物且分泌到外周环境中，从mRNA水平和蛋白水平证实了细胞转染后可以高表达外源性hBMP-2基因。但转移进去的基因表达产物能否起到我们预期的功能呢？我们采用流式细胞仪和ALP活性测定，分析BMP-2基因转染对细胞增殖、分化的影响；通过VEGF（血管内皮生长因子）cDNA探针原位杂交染色，图像分析系统计数平均染色灰度值确定细胞中VEGF的相对含量，观察BMP-2基因导入对细胞VEGF表达的影响。以此来判定转染后表达的BMP-2的生物学活性及诱导成骨的作用，为进一步采用BMP-2基因治疗的组织工程骨修复骨缺损奠定基础。     

PTEN与VEGF在乳腺癌中的表达及其意义

目的探讨抑癌基因PTEN蛋白在人乳腺癌中的表达情况及其与VEGF表达的相关性。方法应用免疫组织化学染色S—P法。检测44例乳腺癌组织和10例乳腺纤维瘤石蜡切片中PTEN蛋白、VEGF蛋白的表达情况，比较PTEN蛋白表达与VEGF蛋白表达的相关性及二者与临床病理指标的关系。结果PTEN蛋白表达定位于细胞质，乳腺癌组织PTEN蛋白表达阴性者占47．7％（21／44），表达阳性者占52．3％（23／44）。PTEN在乳腺癌腋淋巴结是否转移（P〈0．01）或ER状态（P〈0．05）组间比较有统计学意义。PTEN与VEGF蛋白表达呈副相关，但差异不显著（rH=-0．236P=0．122）。结论PTEN对乳腺癌预后判定有一定价值，乳腺癌患者PTEN蛋白低表达与预后不良有关。VEGF可能是PTEN的主要下游基因，二者对乳腺癌发生发展起重要作用。     

Heregulin和VEGF在结肠癌组织中的表达及临床意义研究

探讨Heregulin和VEGF在结肠癌组织中的表达及临床意义。采用免疫组化法检测结肠癌和正常对照者的组织标本中的Heregulin和VEGF的表达,并分析二者的表达与结肠癌之间的相关性。结肠癌组中Heregulin和VEGF的阳性表达率分别为88.0%和80.0%,正常组中Heregulin和VEGF的阳性表达率分别为0%和16%,差异具有统计学意义(P0.05)。Heregulin和VEGF的表达与结肠癌的发生和发展密切相关,为进一步研究结肠癌提供了参考价值。     

外源性表达 VEGF165b 对人膀胱癌裸鼠移植瘤生长影响的研究

目的：建立人膀胱癌 T24细胞裸鼠移植瘤模型,探讨外源性表达 VEGF165b 对其生长的影响及其机制。方法分别移植未转染和转染 VEGF165b 表达载体的人膀胱癌 T24细胞到裸鼠膀胱内,28 d 使处死动物,称量肿瘤重量,测定肿瘤体积。Western blot 法检测肿瘤 VEGF165b、p-VEGFR2、AKT、p-AKT 蛋白表达。结果转染 pcD-NA-VEGF165b 组肿瘤重量和体积与未转染组和转染 pcDNA3．0组相比明显降低（P ＜0．05）,而未转染组和转染pcDNA3．0组比较无统计学差异（P ＞0．05）。Western blot 结果显示,转染 pcDNA-VEGF165b 组与未转染组和转染pcDNA3．0组比较,VEGF165b 表达增高,p-VEGFR2、p-AKT 表达降低,而未转染组和转染 pcDNA3．0组间无明显差异。结论外源性表达 VEGF165b 可通过抑制 VEGFR2信号通路传导而明显抑制人膀胱癌裸鼠移植瘤生长。     

VEGF165基因重组腺病毒载体的构建及其促血管形成作用

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）基因的腺病毒表达载体（Ad—VEGF165）,并观察其感染QBI．293A靶细胞后目的基因的表达及促进血管形成的作用。方法以含有VEGF165基因片段的pSV-K3-VEGF165质粒为模板,PCR扩增获得的VEGF165目的片段（XhoI、EcoRV）亚克隆至GFP标记的pAdTrack—CMV载体中构建重组转移质粒pAdTrack．CMV．VEGF165,行PCR、双酶切和DNA测序鉴定。将测序正确的pAdTrack—CMV．VEGFl65质粒经PmeI线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy．1共转化BJ5183细菌,获得同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1．pAdTrack-CMV．VEGF165（pAd．VEGF165）,再经PacI线性化后用脂质体转染QBI．293A包装细胞,通过多轮扩增和氯化铯密度梯度离心纯化获得Ad．VEGFl65重组腺病毒。RT．PCR和ELISA检测腺病毒介导的外源性VEGFl65基因在QB｜．293A细胞中的转录和表达。将孵育8d的生长状态良好的鸡胚随机分成Ad空载体腺病毒组、Ad—VEGFI65重组腺病毒组、NS组。采用鸡胚尿囊膜（CAM）法检测VEGF165重组腺病毒促进尿囊膜血管形成活性。结果PCR、双酶切和测序鉴定结果证实成功构建了pAdTrack．CMV—VEGF165重组转移质粒,并获得了高滴度的Ad．VEGF165重组腺病毒,其病毒效价可达2×10^10pfu／mL。Ad-VEGFl65感染后,QBI．293A细胞中的VEGF165含量较QBI．293A细胞对照组和Ad空病毒感染组均明显升高（P〈0．05）。Ad-VEGF165组与Ad．空载体组和NS组比较,CAM三级分支血管生长更旺盛,毛细血管更丰富（P〈0．05）。结论成功获得了携带人VEGF165基因的腺病毒表达载体,具有明显的促CAM血管形成活性,为进一步开展VEGF165基因修饰干细胞的应用研究奠定了实验基础。     

Molecular magnetic resonance probe targeting VEGF165: preparation and in vitro and in vivo evaluation

A new method for imaging the tumor human vascular endothelial growth factor 165 (VEGF 165) is presented. A magnetic resonance imaging (MRI) probe was prepared by crosslinking ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO) nanoparticles to the aptamer for tumor vascular endothelial growth factor 165 (VEGF165‐aptamer). The molecular probe was evaluated for its in vitro and in vivo activities toward VEGF165. Enzyme‐linked immunosorbent assay showed that the VEGF165‐aptamer–USPIO nanoparticles conjugate specifically binds to VEGF165 in vitro. A cell proliferation test showed that VEGF165‐aptamer–USPIO seems to block the proliferation of human umbilical vein endothelial cells induced by free VEGF165, suggesting that VEGF165 is an effective target of this molecular probe. In xenograft mice carrying liver cancer that expresses VEGF165, T₂‐weighted imaging of the tumor displayed marked negative enhancement 3 h after the intravenous administration of VEGF165‐aptamer–USPIO. The enhancement disappeared 6 h after administration of the probe. These results suggest the targeted imaging effect of VEGF165‐aptamer–USPIO probe in vivo for VEGF165‐expressing tumors. This is the first report of a targeted MRI molecular probe based on USPIO and VEGF165‐aptamer. Copyright © 2014 John Wiley & Sons, Ltd.     

肾母细胞瘤组织中VEGF和PTEN的表达

目的 :探讨肾母细胞瘤组织中VEGF、PTEN的表达。方法 :应用免疫组化SP法进行研究 ,抗人VEGF多克隆抗体和抗人PTEN多克隆抗体分别用于检测 43例肾母细胞瘤手术切除标本和 11例瘤旁肾组织中VEGF与PTEN的表达情况。结果 :VEGF在肾母细胞瘤组织中的表达明显高于正常瘤旁肾组织 (P <0 .0 5 )。PTEN在肾母细胞瘤组织中的表达明显低于正常瘤旁肾组织 (P <0 .0 5 )。VECF、PTEN的表达与性别、年龄和病理学分型无关 (P >0 .0 5 ) ,而与临床分期明显相关 (P <0 .0 5 )。结论 :肾母细胞瘤组织中VEGF、PTEN的表达与肿瘤侵袭转移和发展有关 ,可被认为是肾母细胞侵袭性的标志物。     

脑出血后血肿周围血管内皮生长因子的表达

目的 该研究旨在建立大鼠脑出血的动物模型的基础上观察VEGF在出血灶周脑组织中的细胞定位和动态表达.从而探讨VEGF的表达在脑出血后继发性脑组织损伤及修复中的作用.方法 应用脑内立体定向仪,采用二步法自体血注入制备大鼠脑出血模型.Wistar大鼠48只,随机分为脑出血组和对照组,分别于6h、24h、2d、3d、5d、7d后处死,免疫组织化学染色显示脑内VEGF表达变化;显微镜下计数脑内VEGF表达阳性的细胞.结果 脑出血组VEGF表达阳性细胞数随时间逐渐增多,随着出血时间延长,表达VEGF的内皮细胞数量逐渐增多,存在较多微血管和血管样结构.结论 脑出血灶周VEGF的表达增加,7d达高峰,但主要在血管内皮细胞表达,提示VEGF可诱导新生血管的生成,对脑出血后继发性缺血性损伤起修复作用.     

转化生长因子-β1及VEGF在肝纤维化中的表达

目的:观察肝组织TGF-β1及VEGF在肝纤维化形成过程中的作用及意义。方法:采用免疫组织化学方法检测36例慢性病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化TGF-β1及VEGF的表达。结果:随着慢性病毒性肝炎、肝纤维化及肝硬化的形成,TGF-β1及VEGF表达逐渐增强(P<0.01)。结论:肝组织中TGF-β1及VEGF的表达与肝纤维化及肝硬化的形成密切相关,可作为诊断和治疗早期肝纤维化的重要指征。