人成骨肉瘤MG-63细胞雌激素相关基因的分离

目的：筛查17β雌二醇(17β-estradiol，E2)诱导人成骨肉瘤MG-63细胞株差异表达cDNA片段，寻找雌激素相关基因。方法：改良的cDNA代表性差异分析法(cDNA representational difference analysis,cDNA RDA)分离E2干预MG-63细胞株表达上调cDNA片段，经Southern和快速Nortthern杂交证实表达上调的cDNA片段来源后，将其克隆到pGEM-T easy载体，蓝白筛选后挑取阳性克隆进行测序和同源比较分析，最后选取其中部分克隆行Norern印迹杂交。结果：第4轮消减杂交得到5个E2诱导人成骨肉瘤MG-63细胞表达上调的差异cDNA条带，Southern和快速Northern杂交证明表达上调的cDNA片段来自E2干预的MG-63细胞；随机选25个克隆测序得到13个序列，7个与已知基因高度同源；其中2个克隆经Northern杂交证实E2干预后表达上调。结论：cDNA RDA能有效筛查差异表达基因，人成骨肉瘤MG-63细胞中某些基因受雌激素诱导表达上调，可能与绝经后骨质疏松的发病相关。     

mRNA差异显示技术在紫杉醇诱导的表达基因克隆中的应用

作者应用mRNA差异显示、DNA序列分析和Northern杂交技术，对紫杉醇处理人乳癌细胞诱导的表达基困进行cDNA克隆研究，12个克隆有明确的mRNA水平表达改变，其中6个cDNA克隆核旮酸序列与已知的cDNA序列有较高的同源性，其余6个尚无同源性基因。克隆C3P3与人腺苷基蛋氨酸合成酶基因序列同源性达99％，紫杉醇诱导该酶基因转录活动和基因产物活性增高。提示mRNA差异显示技术在筛选mRNA水平表达差异的基因cDNA克隆研究中是可行的和有效的。     

雄性激素不敏感综合征家系中可育与不育患者间的差异表达基因

目的利用抑制消减杂交方法筛选和鉴定某雄性激素不敏感综合征家系中1名可育患者与1名不育患者间的差异表达基因。方法分别以可育患者(MJ)和不育患者(ZGJ)的生殖器皮肤成纤维细胞(GSF)为实验方,构建正向和反向消减文库。通过菌落原位杂交、点杂交、Southern印迹法逐步筛选得到候选阳性克隆,利用Northern印迹法验证,并将获得的阳性克隆进行测序和同源性分析。结果构建了这两名患者GSF的正向和反向消减文库,筛选得到反向消减文库中2个Northern阳性克隆,以及两文库中11个无Northern杂交信号、可能代表低丰度转录本的候选克隆。测序和同源性分析显示2个Northern阳性克隆分别与自家趋化素(autotaxin-t)基因和钙结合蛋白S100A6基因高度同源。结论以上2个Northern阳性克隆以及11个无Northern杂交信号的克隆可能代表两患者GSF的差异表达基因,有助于阐明雄性激素不敏感综合征家系中患者表型多样性及育性保留的分子机制。     

人B淋巴细胞活化相关新基因的克隆

目的：分离新的与B细胞活化相关基因。方法：采用差异显示反转录PCR（DDRT－PCR）技术对人扁桃体活化和静止B细胞mRNA的差异表达进行分析。差异显示的片段经过Northern杂交验证后,作为探针进行人活化B细胞cDNA文库的筛选。结果：差异显示分析共获得明显的差异表达的标签序列(expressed sequence tag,EST)62条,其中主要在静止B细胞表达的有32条,在活化B细胞表达的有30条,经Northern 杂交验证,共获得阳性的片段25条,以在活化B细胞中高表达的EST30为探针,经3轮筛选人活化B细胞文库后获得1个新的全长为2048bp的cDNA克隆,该克隆含有1个630bp的开放读码框,其推断的氨基酸序列N端与酵母的动力蛋白KAR3部分同源,结论：克隆了1条可能与B细胞活化相关的新基因。     

缺血再灌可诱导新基因的克隆及其基本特性

目的 :发现并克隆缺血再灌可诱导基因。方法 :应用mRNA差异显示技术 ,在猪的心肌组织 ,分离缺血再灌可诱导基因的cDNA片段 ,随后筛选猪心脏cDNA文库。经克隆、测序、杂交后 ,分析克隆基因的基本特性。结果 :发现和分离到一个缺血再灌上调基因的cDNA片段 ,通过筛选cDNA文库获得一个编码 6 0 8个氨基酸开放式阅读框架的阳性克隆子。序列分析显示该克隆子的DNA和氨基酸序列与已知基因、蛋白质氨基酸均无同源性。Northern杂交分析显示该基因在缺血再灌猪心肌组织的表达明显增高 ,并且在正常猪的心、肝、肺、肾、脾、肠、脑和骨骼肌组织均可检测到其表达。Southern杂交分析显示该基因具有高度的进化保守性。结论 :克隆的基因为缺血再灌可诱导新基因 ,它在缺血再灌的应答中可能起着重要的作用。     

缺血再灌可诱导新基因的克隆及其基本特性

目的：发现并克隆缺血再灌可诱导基因,方法：应用mRNA差异显示技术,在猪的心肌组织,分离缺血再灌可诱导基因的cDNA片段,随后筛选狸心脏cDNA文库,经克隆,测序,杂交后,分析克隆基因的基本特性,结果：发现和分离到一个缺血再灌上调基因的cDNA片段,通过筛选cDNA文库获得一个编码608个氨基酸开放式阅读框架的阳性克隆子。序列分析显示该克隆子的DNA和氨基酸序列与已知基因,蛋白质氨基酸均无同源性,Northern杂交分析显示该基因在缺血再灌猪心肌组织的表达明显增高,并且在正常猪的心,肝,肺,肾,脾,肠,脑和骨骼肌组织均可检测到其表达,Southern杂交分析显示该基因具有高度的进化保守性,结论：克隆的基因为缺血再灌可诱导新基因,它在缺血再灌的应答中可能起着重要的作用。     

肾癌差异表达基因克隆的研究

目的 克隆并鉴定肾癌与正常肾之间差异表达的基因。方法 应用抑制性消减杂交技术构建人肾癌组织与正常肾组织差异表达的cDNA消减文库,并从中克隆鉴定出肾癌差异表达的基因。结果 构建成功了高消减效率的人肾癌cDNA消减文库,对其中5个克隆插入的cDNA片段进行测序后经Genbank检索表明,5个片段均为未知新序列,其中GYIZ-RCC18为3个拷贝,提示以上5个cDNA征段可能来自3个新基因。Northern杂交分析显示,GYIZ-RCC18在肾癌组织中有明显表达,而在正常肾组织中无表达,这证明GYIZ-RCC18是肾癌相关的新基因。结论 人肾癌cDNA消减文库的建立为进一步筛选,克隆肾癌特异性表达的新基因奠定了基础。     

全反式维甲酸诱导胶质瘤细胞侵袭相关基因的差异表达

目的 筛选全反式维甲酸诱导胶质瘤细胞系所致侵袭相关差异表达基因,为进一步研究胶质瘤的侵袭机制提供依据.方法通过运用cDNA微阵列技术比较10μmol/L全反式维甲酸处理前后胶质瘤SHG-44细胞(WHOⅣ级)的基因表达谱,鉴定与胶质瘤侵袭相关的差异表达基因.随机选择数个差异表达基因进行Northern杂交实验,以验证cDNA微阵列结果 的可靠性.结果 实验鉴定出42个差异表达基因,其中表达上调28个、下调14个.4个差异表达基因:CD151、G3BP、UGB和CSTB与胶质瘤的侵袭相关.部分差异表达基因的可靠性为Northern杂交实验所验证.结论 初步揭示全反式维甲酸能诱导胶质瘤细胞侵袭相关基因的差异表达,进一步开展对前述差异表达基因的研究有可能阐明胶质瘤侵袭的基因通路及机制.     

cDNA representational difference analysis of differentially expressed cDNA sequences in human nasopharyngeal carcinoma

ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓｅａｒｃｈｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｃｏｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｈｕｍａｎｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＮＰＣ）,ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｃａｎｄｉ...     

高密度脂蛋白诱导内皮细胞系差异表达基因的研究

目的：研究高密度脂蛋白（HDL）抗动脉粥样硬化（AS）的分子机理,克隆并分析血管内皮细胞在HDL作用下差异表达的已知和未知基因。方法：应用差异显示逆转录聚合酶链反应技术,分析人脐静脉内皮细胞系（ECV）304经高密度脂蛋白诱导后表达明显差异的cDNA。对差异基因进行序列测定和同源性比较,Northern印迹分析部分差异基因的表达情况。结果：HDL诱导ECV304细胞出现一些上调和下调表达的cDNA,差异表达明显的书籍基因有9个,其中上调表达的基因包括STE20样激酶、PBK1蛋白、转谷氨酰胺酶、肌球蛋白轻链、apobec-1结合蛋白、DAP蛋白;下调表达的基因有核糖体蛋白L7a（RPL7A）、线粒体外膜电压依赖性阴离子通道蛋白基因、甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶。差异表达明显的未知基因4个。Northern印迹证实,转谷氨酰胺酶基因表达上调50％,apobec-1结合蛋白基因表达上调70％。结论：HDL可诱导ECV304细胞转谷氨酰胺酶、apobec-1结合蛋白表达水平上调。这两个基因表达水平的升高可能与HDL抗动脉粥样硬化作用相关。     

果蝇吸入麻醉药麻醉作用相关基因的克隆

目的探索吸入麻醉药麻醉作用相关基因或信号传导途径.方法以野生型黑腹果蝇品系及对吸入麻醉药七氟醚敏感和耐药的黑腹果蝇品系为研究模型,通过反转录差异显示PCR方法筛选差异表达的基因片段,经Northem印迹杂交确定阳性基因片段,用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆阳性基因的全长cDNA并进行序列分析.结果在七氟醚诱导和未诱导的3个品系的果蝇中获得31条差异表达的基因片段;NortherTn印迹杂交确证3条为差异表达的阳性片段;RACE法克隆了2条全长cDNA,一条为1 000 bp的果蝇钙调蛋白基因(No.38),另一条为4 100 bp的功能未知基因(No.45),分别位于Chr.2 R49A-49B和Chr.3 L76B9.结论No.38和No.45基因可能参与吸入麻醉药麻醉作用中信号传导和细胞功能的调节,为开展吸入麻醉药作用的机理研究提供新的途径.     

用荧光差异显示法分离新的肝细胞癌相关基因

目的 :寻找新的肝细胞癌 (hepatocellularcarcinoma ,HCC)相关基因。方法 :应用荧光 差异显示 (fluorescentdifferentialdisplay)技术分析人HCC、配对非癌肝、胎肝、正常肝等组织之间的基因差异表达 ,差异表达cDNA片段 ,经测序后 ,再用RNA狭缝杂交对部分差异片段在上述 4种组织中的表达进行验证。结果 :共得到差异表达cDNA片段 110条。经狭缝杂交筛选 ,获得了 4条阳性片段 ,未知cDNA片段L2和与人醛缩酶B 99.5 %同源的cDNA片段L7在部分HCC中特异性低表达 ,未知cDNA片段LC2 7和与人Nip3基因 99.4%同源的cDNA片段LC2 0在部分HCC中特异性高表达。结论 :确认了 4条HCC相关基因。其中L2和人醛缩酶B基因可能为阻抑HCC发生、发展的基因 ,而人Nip3基因和LC2 7可能为促进HCC发生、发展的基因。L2和LC2 7为目前未知的新基因。     

IDENTIFICATION OF DIFFERENTIAL GENES IN OVARIAN CANCER USING REPRESENTATIONAL DIFFERENCE ANALYSIS OF cDNA

Objoctive To identify differential genes between normal ovarian epithelium tissue and ovarian epithelial cancer using representational difference analysis of cDNA （cDNA-RDA）. Methods cDNA-RDA was performed to identify the differentially expressed sequences between cDNAs from cancer tissue and cDNAs from normal ovarian tissue in the same patient who was in the early stage of ovarian serous cystadenocarcinoma. These differentially expressed fragments were cloned and analyzed, then sequenced and compared with known genes. Results Three differentially cxpressed cDNA fragments were isolated using cDNA from normal ovarian tissue as tester and cDNA from cancer tissue as driver amplicon by cDNA-RDA. DP Ⅲ- 1 and DP Ⅲ-2 cDNA clone showed significant homology to the cDNA of alpha actin gene; DPⅢ-3 cDNA clone showed significant homology to the cDNA oftransgelin gene. Conclusion cDNA-RDA can bc used to sensitively identify the differentially expressed genes in ovarian serous cystadenocarcinoma. Ovarian serous cystadenocarcinoma involves alteration of multiple genes.     

高、低正加速度耐力大鼠脑组织差异表达基因的分离

目的:分离高、低正加速度耐力大鼠脑组织差异表达的cDNA片段,以获得耐力相关基因.方法:雄性SD大鼠在离心机上处理后,选取耐受终点在高、低两个极端的动物,立即取全脑,分离mRNA.以高+Gz耐力大鼠脑组织mRNA为实验组,以低+Gz耐力大鼠脑组织mRNA为驱动组,采用抑制消减杂交技术分离高、低+Gz耐力大鼠脑组织中差异表达的cDNA片段混合物,然后将此混合物与pGEM-T easy载体连接,转化E.coli JM109感受态细胞.结果:初步获得了608个可能在高+Gz耐力大鼠脑组织中上调表达的cDNA片段.这些cDNA片段长度介于150～1 400 bp之间,集中于300～700 bp.结论:在高、低+Gz耐力大鼠脑组织中差异表达的cDNA片段所代表的基因为+Gz耐力相关基因,这些基因的上调表达可能与+Gz耐力的提高有关.     

胃癌相关基因EST片段的筛选与gcI基因克隆

目的：结合生物信息学手段和实验途径研究mRNA差异显示方法得到的胃癌相关差异表达基因片段的特性。方法：mRNA差异显示技术筛选出的9条胃癌相关基因EST片段,通过国际互联网基因组数据库资源,分别使用BLAST软件将所得到的序列与EST数据库和基因组数据库进行比对分析,获得胃癌表达基因片段的特征信息。应用5＇RACE方法延伸序列I,BioEdit软件对延伸的序列进行ORF分析,Northern印迹检测其在各种胃组织中的表达。结果：3条序列与已知基因序列同源,1条序列与CD98A的外显子同源,1条与SPTANl同源,1条与RPS24l司源;显示有3条序列与非编码区长散布核元件LINE区域匹配;3条为新的EST序列,其中1条获得eDNA全长序列,具有完整的读码框,编码120个氨基酸,命名为gcI,定位于染色体10q21—22。Northern验证gcI在胃癌组织中表达上调。结论：利用生物信息学方法对胃癌差异显示序列进行筛选,筛选出3条序列与已知基因同源;3条序列为新EST。对其中1条克隆全长序列,它可能参与了胃癌的发病过程。     

Identification of differentially expressed genes in anagen dermal papilla by suppression subtractive hybridization

Background We constructed a cDNA subtractive library of dermal papilla cells (DPCs) in anagen with suppression subtractive hybridization (SSH) technique and clone differentially expressed genes related to DPCs in anagen. Methods Total mRNA was isolated from DPCs of anagen and telogen follicles. Moreover, singlestrand (ss) and double-strand (ds) cDNAs were synthesized in turn using SMART PCR cDNA synthesis technology, ds cDNAs then were digested with Rsa I and divided into two groups, and ligated to the specific adaptor 1 and adaptor 2R, respectively. After cDNAs were hybridized with each other twice and underwent two rounds of nested PCR. PCR products were ligated with arms of T/A plasmid vectors to set up the subtractive library. Selected clones were demonstrated by reverse Northern blot and sequenced. The acquired sequence data were aligned against the Genbank nucleotide database. Results cDNA subtractive library of DPCs in anagen follicles was set up successfully with high subtractive efficiency, Thirty-five genes were identified in this study with 22 known functional genesand 13 unknown functional genes. Conclusions All results confirm the effectiveness and sensitivity of SSH in detecting differentially expressed genes from a small amount of clinical samples. Information about such alterations in gene expression could be useful for elucidating the genetic events in hair follicle growth regulation.