过表达人RI抑制人膀胱癌T24细胞的侵袭、转移及EMT发生

目的 检测过表达人核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因的质粒pIRES2-EGFP-RI对人膀胱癌T24细胞侵袭转移及上皮细胞间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)现象的影响.方法 将连有RI的质粒pIRES2-EGFP-RI稳定转染T24细胞后利用G418筛选出阳性克隆.根据转染的质粒不同分为3组:T24组(未转染组)、T24-0(转染pIRES2-EGFP质粒)和T24-RI组(转染pIRES2-EGFP-RI质粒).RT-PCR检测T24细胞中RI的mRNA 水平变化,细胞免疫荧光及Western blot检测RI蛋白的表达,利用HE染色观察其细胞形态的变化,Transwell方法检测细胞侵袭及转移能力的变化,Western blot检测侵袭转移及EMT相关蛋白Twist、MMP-9和Snail及E-cadherin的表达,构建移植瘤模型,利用HE染色观测肺组织切片癌细胞转移情况,组织免疫化学方法检测移植瘤中RI、Twist、Snail及E-cadherin 的表达.结果 T24-RI组人RI的mRNA水平及蛋白表达显著升高(P＜0.05);HE染色结果表明细胞铺展良好,核质比明显减小,细胞由间质形态向上皮形态转变;Transwell方法显示T24-RI组细胞的侵袭及转移能力较T24组、T24-0组明显下降;Western blot结果表明T24-RI组Twist、MMP-9和Snail较T24组、T24-0组显著降低(P＜0.01),E-cadherin较T24组、T24-0组显著升高(P ＜0.01);HE染色肺组织切片显示T24-RI组较其他两组癌细胞转移降低,组织免疫化学结果表明T24-RI组RI、E-cadherin蛋白明显升高,而Twist、Snail显著降低.结论 过表达人RI载体提高了RI蛋白的表达水平,并抑制了人膀胱癌T24细胞EMT的发生,从而抑制了膀胱癌T24细胞的侵袭、转移.     

过表达 TRPM8对膀胱癌 T24细胞增殖和侵袭的影响

目的：观察过表达TRPM8基因的质粒pcDNA3．1－TRPM8对人膀胱癌 T24细胞增殖和侵袭能力的影响。方法将连有 TRPM8的质粒 pcDNA3．1－TRPM8稳定转染 T24细胞后筛选出阳性克隆。根据转染的质粒不同分为3组： T24组（未转染）、T24－0组[转染 pcDNA3．1（＋）质粒]和 T24－TRPM8组（转染 pcDNA3．1－TRPM8质粒）。应用 RT －PCR 检测 TRPM8 mRNA 改变,MTT 法检测 T24细胞的增殖情况,Transwell 检测细胞侵袭转移能力。结果T24－TRPM8组 TRPM8的 mRNA 水平表达较其他两组升高（P ＜0．05）,MTT 和 Transwell 分别显示 T24－TRPM8组 T24细胞增殖和转移率较其他两组增加（P ＜0．05）。结论过表达 TRPM8可以促进 T24细胞增殖及侵袭能力,从而促进膀胱癌的进展,是潜在的膀胱癌治疗靶点。     

PLCε siRNA转染对膀胱癌细胞株T24侵袭能力的影响

目的:研究磷脂酶C-ε(Phospholipase C epsilon,PLCε)siRNA表达质粒的转染对人膀胱癌细胞系T24侵袭转移能力的影响.方法:分别将携有PLCε siRNA基因的真核表达质粒两对p11-PLCε和p12-PLCε载体体外转染T24细胞,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测PLCε mRNA的表达情况,应用Transwell小室侵袭试验、明胶酶谱分析分别研究转染前、后膀胱癌细胞侵袭转移能力的变化,并以空载质粒HK-A转染和未转染细胞为对照.结果:RT-PCR检测显示p11-PLCε,p12-PLCε转染成功后T24细胞PLCεmRNA表达明显比空质粒HK-A转染和未转染细胞减弱;p12-PLCε siRNA转染细胞穿透侵袭小室滤膜的数目(26.8±5.8)和p11-PLCεsiRNA转染细胞穿透侵袭小室滤膜的数目(25.8±6.2)明显少于未转染细胞(34.8±6.9)和HK-A转染细胞(33.8±5.7)(P＜0.01);明胶酶谱分析显示转染P11-PLCε、p12-PLCε均使细胞分泌MMP-2、MMP-9明显低于未转染细胞和HK-A转染细胞.结论:推测转染外源性PLCεsiRNA基因能下调PLCε基因的表达并能抑制膀胱癌细胞侵袭转移.     

转染Livin基因对膀胱癌细胞增殖的影响

目的 观察Livin基因对于膀胱癌细胞增殖的影响.方法 采用脂质体转染法将Livin基因转入膀胱癌T24细胞系,经G418筛选后获得稳定表达Livin的亚克隆细胞系T24/Livin+及仅转染载体的T24/pcD-NA3.1(+).应用蛋白印迹(Western blo)及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法来检测Livin在转染细胞中的表达;应用克隆形成试验检测细胞增殖活性.结果 成功建立了稳定表达Livin的亚克隆细胞系T24/Livin*及T24/pcDNA3.1(+).Western blot及KT-PCR法检测结果表明Livin在T24/livin+中表达阳性.而在T24与T24/pcDNA3.1(+)中表达阴性,Livin的袁达导致了膀胱癌细胞系更强的细胞增殖能力(P=8.41×10-s,P＜0.01).结论 Livin基因在膀胱癌T24细胞系中诱导细胞增殖,其表达与膀胱癌的发生、发展有关.     

肾癌KISS-1中E-cadherin与的表达及调控关系

 目的探讨KISS-1与E-cadherin在肾癌组织中的表达和相关性以及肾癌细胞中二者之间的调控关系。方法实时PCR 检测原发未转移肾癌和原发伴转移肾癌组织中KISS-1与E-cadherin的表达。KISS-1 表达载体转染肾癌Caki-1 细胞，Western blot 检测KISS-1 和E-cadherin 蛋白的表达。结果与原发未转移肾癌相比，原发伴转移肾癌组织中KISS-1与E-cadherin的表达均显著下调，二者呈显著正相关；转染后KISS-1 和E-cadherin 蛋白的表达均显著上调。结论KISS-1与E-cadherin与肾癌的侵袭转移相关，KISS-1 在肾癌细胞中能够上调E-cadherin的表达。     

转染Livin基因对膀胱癌细胞凋亡的影响

目的 探讨凋亡抑制基因Livin对膀胱癌细胞凋亡的影响.方法 采用脂质体转染法将Livin基因转入膀胱癌T24细胞系,经G418筛选后获得稳定表达Livin的亚克隆细胞系T24/Livin+及仅转染载体的T24/pcDNA3.1(+).用丝裂霉素C(MMC)分别作用于转染前后的膀胱癌细胞系,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测转染前后细胞生长抑制率,应用流式细胞仪(FCM)及吖啶橙(AO)染色检测细胞凋亡.结果 成功建立了稳定表达Livin的亚克隆细胞系T24/Livin+;经MMC作用24 h后,T24/pcDNA3.1(+)细胞与T24的细胞凋亡率分别为(21.4±2.3)%和(19.6±2.3)%,而T24/Livin+的细胞凋亡率则为(8.7±1.5)%,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 Livin基因提高了T24膀胱癌细胞的抗凋亡能力,特别是在膀胱癌化疗中显示出更强的抗凋亡能力.     

膀胱癌中YAP基因的表达以及靶向干扰YAP对膀胱癌细胞株的调节作用

目的 研究膀胱癌中YAP基因的表达以及靶向干扰YAP对膀胱癌细胞株的调节作用.方法 收集膀胱癌患者的膀胱癌组织和癌旁正常组织,检测YAP的表达量.培养膀胱癌T40细胞株,采用转染siRNA片段的方式靶向干扰YAP,而后检测细胞活力、细胞周期、迁移能力以及相关基因的mRNA含量.结果 膀胱癌组织中YAP的mRNA和蛋白含量均高于癌旁正常组织(P＜0.05).干扰YAP组细胞的MTT值以及G0/G1期比例、S期比例低于阴性对照组,G2/M期比较高于阴性对照组(P＜0.05).干扰YAP组的细胞迁移率低于阴性对照组(P＜0.05).干扰YAP组细胞的Bcl-2、Cyclin D1、MMP2和MMP9的mRNA含量均低于阴性对照组(P＜0.05).结论 膀胱癌组织中YAP基因的表达量升高,靶向干扰YAP基因可能是通过减少Bcl-2、Cy-clin D1、MMP2和MMP9的表达来抑制细胞的增殖和迁移.     

nm23-H1基因转染对膀胱癌T-24细胞转移能力及化疗敏感性的影响

目的 探讨nm23-H1基因对人膀胱癌T-24细胞侵袭转移能力及化疗敏感性的影响.方法 将nm23-H1真核表达质粒通过电击穿孔转染技术导入人膀胱癌细胞株T-24, G418筛选阳性克隆,免疫组织化学方法检测nm23-H1基因的表达情况.Transwell小室和冲刷实验观察转染前后细胞的侵袭、粘附、趋化运动能力的变化.MTT法检测T-24细胞转染前后对化疗药物敏感性的变化.结果 以电穿孔技术将nm23-H1基因转入T-24细胞后,获得稳定表达;免疫组织化学结果显示T-24细胞株在nm23-H1基因转染前后其表达水平有明显差异;转染后T-24细胞侵袭、粘附、趋化运动能力有明显的降低.转染后T-24细胞对顺铂(CDDP)明显增敏.结论 nm23-H1基因对人膀胱癌T-24细胞的侵袭转移能力具有显著抑制作用.nm23-H1基因能增强T24细胞对顺铂的化疗敏感性.     

hepaCAM基因对膀胱癌细胞体外生物学的影响

目的 研究野生型hepaCAM基因对人类膀胱癌T24细胞体外生物学影响.方法 脂质体法转染pEGFP-N2-hepaCAM质粒入T24细胞,激光共聚焦显微镜检测其蛋白定位;筛选稳定表达细胞株,Western blot检测蛋白表达.细胞黏附、基质胶侵袭实验及MTT实验研究该基因对细胞黏附力、活动力及增殖力的影响.结果 hepaCAM在单个细胞中分布在细胞核周边区域,相互连接细胞中主要分布于细胞间相互接触区域.获得稳定表达hepaCAM基因的T24细胞.体外黏附实验、基质胶侵袭实验证明实验组细胞黏附力及活动力明显高于空白组及阴性对照组(P＜0.01).MTT法检测转染hepaCAM基因细胞增殖力明显低于空白组及阴性对照组(P＜0.01).结论 hepaCAM基因可显著抑制人类膀胱癌T24细胞恶性行为,可能是通过增强细胞-基质间黏附及抑制细胞增殖力,从而对抗肿瘤细胞的浸润和转移.     

BIRC5基因沉默对人膀胱癌细胞系T24增殖抑制的研究

目的 探讨靶向抑制膀胱癌细胞系T24中BIRC5基因的表达后,该基因编码产物Survivin蛋白对膀胱癌增殖的影响.方法 将设计合成的靶向BIRC5序列的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染膀胱癌细胞系T24,应用RT-PCR技术和Western blot方法检测目的基因转录及表达水平.通过生长曲线来检测survivin基因沉默后细胞增殖的改变.结果 特异性siRNA转染后,survivin mRNA及蛋白水平均明显下降.与空白对照组相比较,转染组细胞增殖情况明显受到抑制,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 特异靶向survivin的siRNA能有效抑制survivin的表达,显著抑制细胞的增殖,为膀胱癌的临床治疗提供新方向.     

MTA1与KISS-1在胃癌中的表达及临床病理意义

目的:研究肿瘤转移相关基因1(MTA1)与肿瘤转移抑制基因KISS-1蛋白在胃癌的表达及临床意义。方法:采用免疫组化的方法检测20例胃正常组织和82例胃癌组织中MTA1和KISS-1的表达。结果:MTA1与KISS-1蛋白在胃癌组织中阳性表达率分别为52.44%和40.24%,在正常胃组织的阳性表达率分别为5.00%和90.00%;MTA1蛋白高表达与胃癌浸润深度、组织学分级、临床分期、淋巴结转移和远隔转移的发生比较差异有统计学意义(P<0.01);KISS-1蛋白低表达与胃癌浸润深度、临床分期、淋巴结转移和远隔转移的发生比较差异有统计学意义(P<0.05);胃癌组织中MTA1与KISS-1蛋白表达呈负相关(γs=-0.364,P<0.01)。结论:MTA1蛋白水平高表达和KISS-1蛋白水平低表达与胃癌的浸润、转移密切相关,可作为诊断胃癌患者转移、复发和判断预后的参考指标,有望成为胃癌基因治疗新的靶点。     

KISS-1和基质金属蛋白酶-9蛋白在胃癌中的表达及意义

目的探讨肿瘤转移抑制基因KISS-1及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)与胃癌侵袭、转移的关系,为研究胃癌的转移机制及临床治疗提供理论基础。方法采用免疫组织化学法检测36例胃癌组织及36例正常胃黏膜组织中KISS-1及MMP-9蛋白的表达情况,分析其与胃癌患者各临床病理指标的关系及二者表达的相关性;采用Western blot法检测不同侵袭能力胃癌细胞株BGC-823(高侵袭)和MKN-28(低侵袭)中KISS-1和MMP-9蛋白的表达。结果KISS-1蛋白在胃癌组织中的阳性表达率显著低于正常胃黏膜组织(P<0.05),并且其低表达与淋巴结转移密切相关(P<0.05);MMP-9蛋白在胃癌组织中的阳性表达率显著高于正常胃黏膜组织(P<0.05),并且其高表达与胃癌的浸润深度和淋巴结转移均密切相关(P<0.05);KISS-1与MMP-9蛋白的表达呈负相关(P<0.05)。KISS-1蛋白在高侵袭胃癌细胞株中的表达低于低侵袭细胞株,但差异无统计学意义(P>0.05);MMP-9蛋白在高侵袭胃癌细胞株中的表达高于低侵袭细胞株,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 KISS-1蛋白的低表达和MMP-9蛋白的高表达可能与胃癌的浸润、转移有关,二者有望成为判定胃癌侵袭和转移能力的指标。     

体外转染KISS-1基因对BGC-823细胞增殖能力的影响

目的观察KISS-1基因对人胃腺癌细胞株BGC-823增殖能力的影响,探讨KISS-1基因作为胃癌基因治疗靶点的可行性。方法利用脂质体介导在体外将KISS-1基因转染人胃腺癌BGC-823细胞,经G418筛选,建立稳定高表达KISS-1蛋白的细胞系,蛋白印迹(Western blotting)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法证实转染成功,四甲基偶氮唑盐比色(MTT)实验探讨KISS-1对胃癌细胞株BGC-823增殖能力的影响。结果 Western blotting和RT-PCR结果显示KISS-1蛋白和mRNA在转基因组的表达均高于转空质粒组和对照组(P<0.05);MTT检测结果显示转基因组细胞在转染48 h和72 h后细胞增殖能力与转空质粒组和对照组相比,细胞生长受到明显抑制(P<0.05)。结论 KISS-1基因可抑制人胃腺癌细胞株BGC-823细胞的增殖能力。     

肾癌中KISS-1通过NF-κB调控MMP-9的表达

目的探讨了NF-κB在KISS-1调控MMP-9的表达中的作用。方法设计并合成了KISS-1基因特异性的siRNA,转染肾癌Caki-1细胞,western blot检测KISS-1、NF-κB和MMP-9蛋白的表达。应用NF-κB抑制剂BAY11-7082处理KISS-1基因表达沉默的Caki-1细胞,western blot检测MMP-9蛋白的表达。结果在Caki-1细胞中,KISS-1基因表达沉默能够显著上调NF-κB蛋白的表达,并显著下调MMP-9蛋白的表达。而BAY 11-7082能够在KISS-1基因表达沉默的Caki-1细胞,显著上调MMP-9蛋白的表达。结论 KISS-1基因在肾癌细胞中能够通过NF-κB调控MMP-9的表达。     

MACC1、Snail和KISS-1蛋白在浸润性乳腺癌中的表达及其临床病理意义

目的 探讨结肠癌转移相关基因1（MACC1）和抑癌基因KISS-1在浸润性乳腺癌（IBC）中的蛋白表达及其与上皮间质转化相关因子Snail表达的关系和临床病理意义。方法 通过免疫组织化学法检测250例IBC（IBC组）和80例正常乳腺组织（对照组）中MACC1、KISS-1和Snail的表达情况,分析临床病理资料特征,评估对患者预后的影响。结果 在对照组中,MACC1、KISS-1和Snail的阳性表达率分别为7.5%、87.5%和5.0%;在IBC组中,MACC1、KISS-1和Snail阳性表达率分别为63.6%、38.0%和58.8%,两组之间差异均有统计学意义（P <0.05）。MACC1、KISS-1和Snail蛋白的表达在IBC患者的淋巴结转移与否、肿瘤组织的不同分化程度、不同临床分期、不同分型之间差异均有统计学意义（P <0.05）。MACC1和Snail蛋白阳性表达组患者总的生存时间低于其阴性表达组患者（P <0.001）;KISS-1表达阳性的患者其生存时间高于其阴性组患者（P <0.001）。Cox回归分析结果表明,MACC1、Snail蛋白的阳性表达和KISS-1的阴性表达是影响IBC患者术后生存时间的独立危险因素（P <0.05)。结论 MACC1、Snail和KISS-1的反常表达参与了IBC的浸润及转移过程,早期联合检测MACC1、Snail和KISS-1的表达对IBC的进展及预后判定均有重要意义。     

KISS-1、Cath-D及VEGF在乳腺癌组织中的表达及相关性

目的:研究KISS-1、Cath-D及VEGF在乳腺癌组织中的表达及其与乳腺癌临床病理学特征的关系,探讨三者在乳腺癌发病过程中是否具有相关性。方法:用免疫组织化学S-P法检测50例乳腺癌患者肿瘤组织和50例癌旁3cm外正常乳腺组织中KISS-1、Cath-D及VEGF的表达水平。结果:①KISS-1在乳腺癌组织中的表达显著低于在正常乳腺组织中的表达(P<0.01);Cath-D、VEGF在乳腺癌组织中的表达率显著高于在正常乳腺组织中的表达(P<0.01)。②KISS-1在有淋巴结转移乳腺癌中的表达显著低于无淋巴结转移乳腺癌(P<0.05);Cath-D及VEGF在有淋巴结转移乳腺癌中的表达显著高于无淋巴结转移乳腺癌(P<0.05)。③KISS-1与Cath-D及VEGF在乳腺癌组织中的表达均具有负相关性(P<0.05)。结论:KISS-1基因表达在抑制乳腺癌转移过程中起一定作用,KISS-1基因的失表达可能通过参与淋巴及血行转移促进乳腺癌的浸润转移。     

heparanase通过调控EMT促进人膀胱移行细胞癌细胞T24迁移及侵袭的作用研究

目的 探讨乙酰肝素酶（heparanase）是否通过上皮-间充质转化（EMT）影响膀胱移行细胞癌细胞的侵袭及迁移能力.方法 利用荧光定量PCR来检测人膀胱移行细胞癌细胞T24、EJ、MGH-U1以及BIU-87中heparanase的表达水平;设计并合成靶向heparanase的特异性shRNA,通过脂质体转染法转染heparanase表达最高的膀胱移行细胞癌细胞T24以构建稳定低表达heparanase细胞株,通过Western blot法检测和定量PCR来验证shRNA的干扰效率;通过transwell法检测干扰后细胞的迁移及侵袭能力,Western blot法检测EMT相关指标E-cadherin和N-cadherin以及其上游信号分子Snail和WNT-5a的变化.结果 heparanase-shRNA转染后,能够有效抑制T24细胞中heparanase的表达;Transwell法结果显示,heparanase干扰组细胞侵袭及迁移能力显著低于阴性对照组（P ＜0.001）.Western blot法检测结果发现,heparanase干扰组细胞的E-cadherin表达增加,N-cadherin的表达降低;此外,heparanase干扰组细胞的Snail以及WNT-5a表达较对照组显著下降.结论 运用RNA干扰技术能够有效沉默T24细胞的heparanase基因,并诱导其迁移侵袭能力的下降,其可能的机制是通过调节EMT的上游信号分子Snail、WNT-5a的表达来调控EMT,从而影响膀胱移行细胞癌细胞的迁移及侵袭.提示heparanases可能在膀胱移行癌T24细胞的发生发展中起重要作用,抑制heparanase的表达可能成为一种治疗膀胱移行细胞癌的新方法.     

Slug、ZEB1和KISS-1在胃腺癌中的表达及其临床意义

目的寻找能预测原发性胃腺癌（gastric adenocarcinoma,GAC）浸润、转移及预后的指标。方法采用免疫组织化学 ElivisionTM plus法检测261例GAC组织和80例正常胃黏膜组织中Slug、ZEB1和KISS-1蛋白的表达情况。结果在正常胃黏膜 组织中Slug、ZEB1和KISS-1蛋白的阳性表达率分别为2.5%,1.3%和87.5%;在GAC组织中阳性表达率分别为62.1%、29.1%和 45.2%,两组之间差异有统计学意义（P<0.05）。Slug在GAC组织中的阳性表达率与肿瘤组织的浸润深度、淋巴结转移及临床病 理分期均相关;ZEB1在GAC组织中的阳性表达率与分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移及临床病理分期高低均相关;KISS-1 在GAC组织中的阳性表达率与浸润深度、淋巴结转移与否及临床病理分期均有关。Slug的表达和ZEB1的表达呈正相关关系; KISS-1与Slug和ZEB1呈负相关关系。Kaplan-Meier生存分析表明Slug和ZEB1蛋白阳性表达组患者总的生存时间明显低于 其阴性组患者;KISS-1 阳性表达组患者总的生存时间明显高于其阴性组患者。COX多因素模型分析显示,Slug、ZEB1 和 KISS-1蛋白的阳性表达以pTNM分期是影响GAC患者预后的独立因素。结论Slug、ZEB1和KISS-1的异常表达参与了GAC 的发生,并与GAC的淋巴结转移、pTNM分期及预后等均有关;Slug、ZEB1和KISS-1联合检测对GAC的进展及预后判断有重 要意义。     

肿瘤转移相关基因1与抑制基因KISS-1在胰腺癌中的表达及意义

目的研究肿瘤转移相关基因1（metastasis associated 1,MTA1）与抑制基因KISS-1在胰腺癌中的表达,探讨其与病理指标的关系。方法应用免疫组化Envision二步法在36例胰腺癌组织、10例癌旁胰腺组织中检测MTA1与KISS-1蛋白的表达情况。结果 MTA1在胰腺癌组织中的阳性表达率为77.8%（28/36）,显著高于癌旁胰腺组织中的表达[20.0%（2/10）]（P〈0.01）;KISS-1在胰腺癌组织中的阳性表达率为38.9%（14/36）,明显低于癌旁胰腺组织的90.0%（9/10）（P〈0.01）。二者的表达均与患者年龄、性别及肿瘤部位无关（P〉0.05）,而与癌组织的分化程度、淋巴结转移及临床分期有关（P〈0.05）。胰腺癌组织中MTA1与KISS-1的表达呈负相关（r=-0.533,P〈0.01）。结论MTA1和KISS-1与胰腺癌的发生、侵袭以及转移有关,其有望成为胰腺癌诊治的重要生物学指标。