磷脂酶Cγ1在大肠癌细胞中的信号转导机制

目的研究磷脂酶Cγ1(PLCγ1)在大肠癌细胞中的信号转导机制。方法采用凝胶迁移率变动分析(EMSA),免疫细胞化学,酶谱分析及RT-PCR等技术,分析了大肠癌细胞LoVo中,PLCγ1在表皮生长因子(EGF)刺激下对相关信号分子核因子-KappaB(NF-κB)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和组织金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP-2)的活性与表达的影响。结果与对照组相比,EGF处理组胞核阳性率显著增高,从26.91%±2.84%升高至40.83%±4.36%,而2.5μmol/LU73122处理组中胞核的阳性率则降低至12.20%±1.89%。同时,EGF刺激前若以2.5μmol/LU73122预处理,胞核阳性的细胞与只用EGF处理组相比也显著减少,从40.83%±4.36%降至18.21%±1.34%。EMSA结果显示,EGF处理细胞后可以增强NF-κB的活性,而U73122则可部分抑制其活性。RT-PCR结果表明,EGF处理细胞后,PLCγ1和NF-κB对于MMP-2与TIMP-2在mRNA水平的表达无显著影响。酶谱分析结果同时表明EGF处理细胞后,PLCγ1和NF-κB对于MMP-2酶原的表达及激活也无显著影响。结论在大肠癌细胞LoVo中,EGF可作为PLCγ1的上游刺激物,NF-κB作为其下游分子参与PLCγ1作用的发挥,而MMP-2、TIMP-2则不参与PLCγ1信号通路。     

HA表位标记的人Axud1基因的构建及在肺腺癌SPC-A1细胞中的表达

构建在哺乳动物细胞中表达的血凝素HA表位标记的人Axud1融合蛋白表达载体。RT PCR从人外周血淋巴细胞中扩增Axud1全长cDNA ,用含HA序列的特异引物PCR扩增HA Axud1,经BamHⅠ、XbaⅠ酶切后插入到经BamHⅠ、XbaⅠ酶切的真核表达载体pcDNA3 .1( ) 中 ,重组质粒PCR、酶切和测序鉴定正确 ,最后将该质粒转染入肺腺癌SPC A1细胞中 ,Westernblot检测HA Axud1融合蛋白的表达。结果显示 ,筛选的G418抗性克隆SPC A1细胞中均有HA Axud1融合蛋白的表达 ,为进一步研究Axud1蛋白在肿瘤细胞中的功能提供了一个重要工具     

内皮活化相关新基因EOLA1的亚细胞定位及组织表达

目的研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)基因的亚细胞定位和组织表达特性,为对其进行进一步的功能研究打下基础。方法构建EOLA1-EGFP(绿色荧光蛋白)融合蛋白表达质粒,转染内皮细胞后瞬时表达,在激光共聚焦显微镜下观察EOLA1蛋白的亚细胞定位;通过人多组织Northern杂交研究EOLA1基因的组织表达。结果EOLA1蛋白在正常人各组织中呈选择性表达,在人的心脏、骨骼肌、肾脏、肝脏和胎盘组织中有较强的表达,在结肠、脾脏和小肠中有较弱的表达,而在脑、胸腺、肺和外周白细胞中无表达;EOLA1蛋白主要定位于细胞浆,少量表达于细胞核。结论EOLA1属胞内蛋白,可能在细胞内信号转导中起着作用。     

HIV—1多表位膜蛋白在E.coli中的表达及在血清检测中的应用

目的：获得具有较多保守抗原表位的ＨＩＶ－１膜重组抗原，提高ＨＩＶ筛选ＥＬＩＳＡ试剂的质量。方法：利用分子克隆与ＰＣＲ方法，获得了新的ＨＩＶ－１膜重组抗原的基因克隆，编码ｇｐ１２０Ｃ端亲水区３７个氨基酸残基（ｅｎｖ４８２～５１８）以及ｇｐ４１膜外部分的１２８个氨基酸残基（ｅｎｖ５４８～６７５）。将该基因克隆到ｐＧＥＭＥＸ－１载体上融合表达，表达蛋白经纯化后，以１μｇ／ｍｌ的浓度包被ＥＬＩＳＡ板，用来     

信号转导机制在大鼠脑损伤后血脑屏障损害中的作用

为探讨信号转导系统在脑损伤后血脑屏障损害中的作用，取雄性SD大鼠75只，随机分为正常对照组、假手术组、脑损伤组、毛喉素组和H7组，用荧光显微镜定性观察、分光光度计定量检测伊文蓝渗出。结果显示，脑损伤后伊文蓝明显渗出，毛喉素组和H7组渗出明显减少，提示毛喉素和H7能阻止血脑屏障开放，可望为血脑屏障保护提供新的治疗途径。     

乙型肝炎病毒e抗原在肝细胞内作用蛋白AK026018亚细胞定位的研究

目的：确定肝细胞内乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)作用蛋白AK026018的亚细胞定位，初步研究该蛋白的生物学功能。方法：应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术，从HepG2细胞中扩增编码AK026018蛋白的全基因，构建真核表达载体pEGFP-AK，转染HepG2、293T细胞系，在激光共聚焦荧光显微镜下与转染空载体pEGFP-N1的细胞比较观察。结果：经限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定构建的重组表达载体正确。通过激光共聚焦荧光显微镜观察，转染了重组栽体pEGFP-AK的细胞绿色荧光信号较集中分布于胞浆中。而空载体pEGFP-N1转染的细胞绿色荧光信号在整个细胞中均匀分布。结论：成功分离了AK026018全基因序列并构建了真核表达载体，该基因表达产物亚细胞定位于细胞浆中。     

DNA甲基转移酶1在子宫颈癌组织和细胞中的表达及意义

目的 研究DNA甲基转移酶1(DNMT1)在宫颈癌组织和宫颈癌细胞系中的表达情况,分析其表达率与宫颈癌临床病理因素之间的关系,并探讨其在官颈癌发生发展过程中的作用.方法 采用免疫组化SP法检测DNMT1蛋白在3株宫颈癌细胞系(SHa、Hela、C33A细胞系)及89例宫颈癌组织、20例宫颈上皮内瘤变(CIN)、20例正常宫颈上皮组织石蜡标本中的阳性细胞表达率,并分析其与宫颈癌临床病理因素之间的关系;用RT-FCR方法检测DNIVlT1mRNA在3株宫颈癌细胞系及35例宫颈癌组织、24例CIN、20例正常宫颈组织新鲜标本中的表达情况.结果 DNMT1蛋白在3株宫颈癌细胞中均有表达,而在对照组(人子宫内膜间质细胞)中无表达,在宫颈癌组织中的阳性表达率为71. 9%,高于CIN组织(35.0%,P<0.05)和正常宫颈组织(10.0%,P<0.05);DNMT1蛋白的异常表达与宫颈癌组织的分化程度有关(P<0.05),与年龄、肿瘤病理型别、有无淋巴结转移和临床分期无明显关系.DNMT1mRNA在3株宫颈癌细胞中均有表达,对照组细胞中无表达,在宫颈癌组织中的阳性表达率为85.7%,高于CIN组织(强33.3%,P<0.05)和正常宫颈组织(5.0%,P<0.05).结论 DNMT1 mRNA和蛋白在宫颈癌组织和细胞中的阳性表达率均高于正常宫颈组织,有可能作为宫颈癌早期诊断的标志物.     

荧光显微成像技术在光敏剂亚细胞定位及损伤研究中的应用

一、光动力学疗法的基本原理及光敏剂亚细胞定位研究的重要意义光动力疗法(photodynamictherapy,PDT)是指静脉或局部给予光敏剂,应用可见光或近红外光照射后吸收光子能量,在有氧状态下传递能量,产生对细胞有毒性的物质如单线态氧和其他氧自由基犤1犦。这些物质能和细胞内成分发生反应而造成细胞损伤。激发态单态氧寿命极短,在细胞内扩散不超过10～20nm。因此,靶细胞光动力损伤主要位点和光敏剂的亚细胞分布紧密相关犤2犦。研究发现由于细胞光敏损伤位点不同,其损伤特点及后果也不同犤3犦。一般认为,光动力作用引起细胞内线粒体损伤使靶细…     

新基因TIG-310的原核表达、细胞和亚细胞定位及其在Ty21a免疫中的表达变化研究

目的：研究Ty21α免疫相关新基因(Ty21α immunization—associated gene，TIG—310)的原核表达、细胞和亚细胞定位及其在Ty21α免疫中的变化规律。方法：采用PCR技术，扩增TIG—310可能的编码区，将其克隆至pQE30载体，在M15菌株中进行诱导表达；采用原位杂交技术对TIG—310基因的表达产物在肠黏膜组织进行细胞定位；将其亚克隆至绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—N1，通过电击传染导入L细胞，确定其亚细胞定位；通过RT—PCR研究其在Ty21α免疫中的变化规律。结果与结论：TIG—310的编码区在原核表达系统中获得包涵体表达；原位杂交结果显示该基因表达在肠黎膜的上皮细胞中；与绿色荧光蛋白融合表达的实验结果表明，该蛋白定位于整个细胞内。该基因在正常的BALB／c小鼠的胃肠黏膜高表达，在Ty21α第一次灌胃免疫后表达量显著增高，随着免疫次数的增加，TIG—310的表达量逐渐恢复正常。     

Cyelin D1基因蛋白在乳腺癌中的表达

目的 探讨Cyelin D1基因在乳腺癌中的表达和意义。方法 应用ABC免疫组化法检测14例癌旁组织及49例乳腺癌中Cyclin D1蛋白的表达。结果 Cyclin D1在乳腺癌中有较高表达,过表达翠49％(24／49);在14例癌旁乳腺组织中无过表达;乳腺癌的临床病理特征无明显相关性。结论 Cyclin D1基因过表达是乳腺癌发生发展过程中的重要事件。     

实时定量PCR阵列技术在规模化检测基因表达中的应用

实时定量PCR阵列技术（RQ-PCR-array）以实时定量PCR（RQ-PCR）技术为核心并结合阵列（array）技术,能够比较可靠、准确地检测信号转导、疾病相关通路等过程相关的基因表达图谱,在规模化检测基因表达方面具有高通量的显著优势,已广泛应用于基础研究和临床。如能够结合多重PCR技术,有可能进一步达到超高通量基因表达检测水平。本文对该技术在规模化检测基因表达中的研究进展进行综述。     

低氧诱导因子-1结构、活性调节及其靶基因的研究进展

低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)是由低氧等诱导细胞产生的一种转录因子。通过调控近50种靶基因，引起细胞对低氧发生一系列适应性反应，以实现其主要调节氧稳态的功能，说明其在低氧信号转导过程中起关键作用，具有重要的生理学和病理生理学意义。本文综述了HIF-1的结构、活性调节及其靶基因等方面的研究进展。     

报告基因显像监测基因治疗研究进展

为评价基因治疗,需要随时对治疗基因的定位和表达进行监测。放射性核素报告基因技术是检测基因表达的最好方法。用基因融合、双顺反子、双启动子及双向转录等重组技术,构建表达报告基因的腺病毒载体,导入靶细胞或组织内,然后注射与报告基因偶合的核素标记的探针,进行PET、SPECT或γ-照相,可无创伤地、重复地定量显示报告基因表达。目前,用于基因治疗的报告基因和报告探针系统有:HSV1-tk(单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因)和碘、氟同位素标记的尿嘧啶、鸟嘌呤的衍生物;突变的多巴胺D2R(多巴胺2型受体)基因和(18F-FESP(18F-氟乙基螺环哌丁苯);SSTr2(生长抑素2型受体基因)和生长抑素类似物等。其中,部分已用于临床试验治疗。     

鞘氨醇激酶调节细胞凋亡的研究进展

鞘磷脂衍生物神经酰胺(Cer)、鞘氨醇(Sp)及1-磷酸鞘氨醇(SIP)在调控细胞增殖、存活及凋亡中发挥着重要作用。鞘氨醇激酶(SPK1)是调控细胞内Cer、Sp、SIP代谢平衡的关键酶。SPK1磷酸化Sp生成SIP，SIP通过细胞内和细胞外作用机制调节细胞生长和凋亡。SPK1参与细胞因子的信号传递。高表达SPK1抑制半胱天冬酶的裂解并上调Bcl-2基因的表达。本文综述了SPK的结构、调控及对细胞凋亡的调节作用。     

单纯疱疹病毒1-胸苷激酶报告基因显像研究进展

放射性核素报告基因显像技术作为监测基因治疗表达的一种有效手段,是目前研究的热点。报告基因系统主要有三类,其中酶的报告基因系统中的单纯疱疹病毒1-胸苷激酶由于其良好的理化特性,适合作为报告基因而对其进行了深入、广泛的研究,它的两类底物是嘌呤核苷衍生物和无环鸟苷衍生物,目前已经用不同放射性核素进行标记而达到显像目的。     

RNA干涉抑制NIH3T3细胞中外源PC-1基因表达

目的：获得能有效抑制PC—1基因表达的RNAi靶标，用RNAi技术研究PC-1基因表达在前列腺癌中的作用。方法：用DNA重组技术构建了可表达短发夹RNA的重组质粒，将重组质粒与表达PC-1-EGFP融合蛋白的质粒共转染NIH3T3细胞，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达差异，从5个候选靶标中初筛出最合适的RNAi靶标，再通过RT—PCR和Western印迹从mRNA水平和蛋白质水平检测该RNAi靶标抑制PC-1基因表达的效果。结果：利用RNA干涉有效靶点抑制了NIH3T3细胞中外源PC-I基因表达。结论：这一策略适合大量筛选：RNAi有效靶标序列，其结果为研究RNAi技术降低PC-1基因的表达对前列腺癌细胞的影响奠定了基础。     

外源性WAF1-S基因表达对喉癌细胞生长的作用

目的 探索WA1F-S基因在喉癌细胞内表达的作用,为喉癌的基因治疗提供理论依据。方法 采用亚克隆技术,构建WAF1-S真核表达载体pcDNA3-WAF1-S。利用lipofectamine介导,将外源野生型WAF1-S基因导入喉癌细胞系Hep-2,筛选阳性克隆,采用打点杂交技术观察WAF1-S基因mRNA在喉癌细胞中的表达,用Western blot及激光共聚焦方法定量分析WAF1-S基因的蛋白表达产物,MTT及流式细胞仪检测Hep-2细胞的生长状态。同时以空载体质粒pcDNA3为对照,分析WAF1基因对喉癌细胞生长的影响。结果 打点杂交证实转染WAF1-S基因的Hep-2细胞有外源WAF1-S基因的表达,外源基因WAF1-S在Hep-2细胞系中的表达能抑制Hep-2细胞系的生长。转染后喉癌细胞中WAF1-S的蛋白表达明显高于对照组。流式细胞仪计数证实WAF1-S能诱导喉癌细胞系Hep-2发生凋亡并导致其发生G1期阻滞。结论 导入外源野生型WAF1-S基因可抑制喉癌细胞生长。     

白细胞介素1在多效生长因子对Schlafen2基因负性调控中的作用

目的:在多效生长因子(pleiotrophin,Ptn)基因稳定沉默的小鼠胚胎成纤维细胞Ptn-siRNA B/MEF241中,研究白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)在多效生长因子对Schlafen2(Slfn2)基因负性调控中发挥的作用. 方法:本研究用Ptn-siRNA B/MEF241细胞的培养液培养对照NC细胞不同时间,通过Northern杂交检测NC细胞中Slfn2表达水平变化;应用RT-PCR和Western印迹检测外源性PTN因子(终浓度50 ng/μl)作用对Ptn沉默细胞内IL-1表达水平的影响;分别使用重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)和IL-1α中和抗体阻断IL-1的作用通路,检测Ptn稳定沉默细胞中Slfn2基因表达变化.结果:Ptn沉默细胞培养液可以诱导对照细胞Slfn2表达;外源性PTN能抑制沉默细胞中IL-1α和IL-1f6的表达;IL-1受体拮抗剂(rhIL-1ra) 和IL-1α中和抗体可抑制Ptn沉默细胞中Slfn2表达.结论:Ptn可能部分通过分泌性的细胞因子间接调控Slfn2基因表达,并且鉴定出在此调控过程中IL-1家族是其中一种非常重要的调控因子.     

人源抗HIV—1整合酶单链抗体基因的构建及表达

获得人源抗ＨＩＶ－１整合酶单链抗体基因并在大肠杆菌及细胞中进行表达。方法：从人的抗ＨＩＶ－１整合酶的Ｆａｂ抗体基因片段中通过ＰＣＲ扩出此抗体的重链可变区和轻链可变区基因,经一弹性连接肽连接构建成人源抗ＨＩＶ－１整合酶的单链抗体基因。