沙门菌变性高效液相色谱法鉴定和分型研究

[目的]建立PCR与变性高效液相色谱(DHPLC)相结合的方法,对沙门菌进行鉴定和分型。[方法]针对16S rRNA基因或16S-23S之间序列保守区设计3对引物S1、S2和S3,PCR扩增产物或杂交产物用变性高效液相色谱仪鉴定。[结果]柱温50℃时,引物S1产物在不同血清型沙门菌显示为特异DHPLC图谱;柱温61.4℃时,引物S2杂交产物在不同血清型沙门菌显示为特异DHPLC图谱;引物S3可用于沙门菌的特异鉴定,但不能区分血清型;同一血清型内各菌株基因高度保守。[结论]PCR-DHPLC方法适用于不同血清型沙门菌的分型,但不适于同一血清型内的菌株分型。     

沙门菌分子分型方法研究进展

沙门菌引起的食源性疾病是危害人类健康的重大隐患,被列为首选控制的食源性致病菌^〔1〕。沙门菌属型别复杂,传统的分型方法大多是通过表型鉴定,如依据菌体表面脂多糖、鞭毛抗原分别携带的O、H抗原等,包括生化反应、耐药性、血清学、噬菌体分型等方法,直接体现了菌株的不同来源、不同致病性或表观特征差异,但是这些分型方法存在分型率低、重复性差、操作繁琐,以及分辨能力不强等缺点,存在较大的局限性。     

舟山市2018—2020年肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌 PFGE分子分型特征分析

目的 了解舟山市肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型特征,为聚集性暴发事件溯源追踪提供依据。方法 用Pulse Net网络实验室标准方法对肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌进行PFGE分子分型,并进行聚类分析。结果 舟山市2018—2020年分离到106株肠炎沙门菌和60株鼠伤寒沙门菌,性别比1.1∶1和0.9∶1,集中于每年6～8月(78.3%和80.0%),主要以0～5岁年龄组居多(37.7%和66.7%)。106株肠炎沙门菌分12种带型,菌株间条带相似度84.0%～100.0%;优势带型为P1、P6和P7。60株鼠伤寒沙门菌分53种带型,菌株间条带相似度56.0%～100.0%;各带型包含1～4株菌,B1为优势带型。结论 舟山市肠炎沙门菌PFGE分子分型有明显优势带型,遗传同源性较高;鼠伤寒沙门菌PFGE分子型别众多,条带分散,呈遗传多样性。     

大连市伤寒沙门菌扩增片段长度多态性分型

目的 运用扩增片段长度多态性(AFLP)技术分析辽宁省大连市2000~2006年伤寒沙门菌分离株的多态性及遗传关系。方法 采用PstI/Mse I型内切酶,选择9种引物组合对30株不同来源的菌株进行AFLP分子分型。结果 30株不同来源的伤寒沙门菌分为29个AFLP基因型,呈现丰富的多态性。结论 AFLP技术是一种兼具有效性和效率性,适用于伤寒沙门菌分子流行病学研究。     

河北省2005—2007年沙门菌主动监测及基因分型结果

目的通过对各类食品中沙门菌的主动监测并对其进行溯源研究，掌握河北省食品中沙门菌的污染情况，为从根本上控制由沙门菌引起的食源性疾病提供科学依据。方法依据中华人民共和国国家标准食品卫生检验方法GB4789．4—2003及全国食品污染物监测致病菌检测方法，2005—2007年在全省9个监测点采样并检测了七大类（生肉、熟肉、乳制品、面米食品、非发酵豆制品冰产品和蔬菜）共2058件样品。并对从各类样品中分离出的排在前5位的7个血清型沙门菌应用脉冲场凝胶电泳方法进行基因分型．。结果沙门菌总阳性率7．00％。生肉的污染情况最为严重，阳性率14．60％，其次是水产品阳性率为7．14％，熟肉制品、蔬菜、非发酵豆制品阳，性率分别为4．46％、0．82％和0．49％，乳制品和面米食品未检出。沙门菌的检出率在河北省的不同地区存在差异性（χ^2=48．97，P〈0．01）。2005、2006、2007年检出率分别为20．98％、4．41％、2．42％，呈逐年下降趋势。共分离出沙门菌144株，在河北省排在前5位的血清型是山夫登堡、鸭和德比沙门菌、阿贡纳、猪霍乱、肠炎和伊鲁木，占分离株的58．33％。PFGE基因分型，型别较多，各菌株间亲缘关系较远，在同种沙门菌间相似性系数最小值为4．4％，但也有同源菌株存在。结论河北省食品中沙门菌污染严重，生肉阳性率非常高，是重要的危险食品。沙门菌血清型别多，较分散。食品中污染的主要沙门菌均未显示流行趋势。     

沙门菌检测方法的循证确定

目的将循证医学的研究方法应用于卫生检验，寻找沙门菌快速检测的最佳方案。方法通过检索多个数据库，全面查找沙门菌检测方法的文献，并对找到的文献进行评估和筛选，找到符合要求的文献确定检测方法。结果从5256篇检索到的文献中，共找到相关Ⅱ级文献4篇，Ⅲ级综述文献1篇用于确定沙门菌快速检测的最佳方案。结论在沙门菌的快速检测中，宜采用以139-141为引物的PCR检测法。     

PCR快速检测甲型副伤寒沙门菌鞭毛抗原H-a研究

目的研究快速、特异、灵敏的检测甲型副伤寒沙门菌鞭毛特异相H-a的PCR法.方法选择甲型副伤寒沙门菌鞭毛抗原H-a基因的特异引物进行PCR扩增,检测甲型副伤寒沙门菌标准菌株和我省不同地区上送的57株甲型副伤寒沙门菌以及非甲型副伤寒沙门菌的其它菌株;将甲型副伤寒沙门菌标准菌株按10-1～10-9稀释后扩增比较PCR的检测灵敏度.结果所有甲型副伤寒沙门菌均在329bp处出现甲型副伤寒沙门菌鞭毛抗原基因产物,非甲型副伤寒沙门菌株PCR结果均为阴性;PCR检测下限为103cfu/ml.结论 PCR比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏、简便,为临床诊断、实验室筛查以及流行病学快速查源、溯源提供了新的手段.     

肠炎沙门菌随机扩增多态性DNA分子分型

目的对不同来源的12株肠炎沙门菌分离株进行分子分型。方法分别提取不同菌株基因组DNA,建立和优化随机扩增多态性DNA（RAPD）反应体系,试用22条随机引物对不同菌株进行RAPD扩增,筛选清晰稳定的扩增条带做统计分析。结果筛选到OPG-03、OPG-06、OPG-07和OPG-13共4条随机引物具有鉴别作用,每一菌株均可扩增出4~10条DNA片段,大多数片段在100~2000bp之间,共扩增出42条RAPD条带,其中共有条带7条,多态性条带35条,多态性为83.3%。不同来源的肠炎沙门菌分离株之间的遗传相似系数在42.6%~100%之间,在0.850的相似性水平上可将12株肠炎沙门菌分离株分为5个不同的亚型。结论应用RAPD技术在分子水平上对肠炎沙门菌进行鉴别和分型具有简便、快速和辨别能力高的优势,对肠炎沙门菌的分子流行病学研究具有较好的应用前景。     

2009年江苏省伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳基因分型分析

目的:对江苏省2009年分离出的伤寒沙门菌进行同源性分析.方法:用生化和血清学方法,对江苏省2009年从肠道传染病患者中分离到的伤寒沙门菌进行鉴定.伤寒沙门菌基因组经限制性内切酶XbaI酶切后,采用脉冲场电泳获得电泳图谱,再利用BioNumerics软件对电泳图谱进行同源性分析.结果:共从江苏省9个地区分离得到39株伤寒沙门菌,BioNumerics分析结果显示,共有31个不同的PFGE带型出现,除5株以外,其余34株分布于8个相似性在85%以上的簇内.结论:江苏省2009年可能存在8个主要的伤寒沙门菌克隆,这些克隆传播可能是同期伤寒流行的主要病原.PFGE指纹图谱为伤寒沙门菌分子分型网络监测打下了良好的基础,为疾病主动监测和传染来源追踪提供了技术支持.     

伤寒沙门菌的脉冲场凝胶电泳分型方法研究

目的：运用脉冲场凝胶电泳研究宁波市伤寒沙门菌的分子流行病学。方法：选择XbaⅠ酶对伤寒沙门菌染色体DNA进行酶切，采用脉冲场凝胶电泳技术分析电泳酶切指纹图谱，了解其流行状况。结果：14株伤寒沙门菌，根据电泳图谱分析，可分为3个带型。结论：PFGE具有分辨力高，重复性好的特点，是研究伤寒沙门菌分子流行病学较好的基因分型方法。     

16S rRNA、16S-23S rRNA基因测序分析检测主要血流感染病原菌比较

目的比较细菌16S rRNA、16S-23S rRNA 基因测序分析在血流感染病原菌检测中的作用。方法提取临床上血流感染常见的金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、洛菲不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、潘尼变形杆菌、屎肠球菌、粘质沙雷菌、宋内志贺菌、产气肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、腐生葡萄球菌基因组 DNA,运用 16S rRNA、16S-23S rRNA 基因进行 PCR 扩增。扩增产物经测序后在美国国家生物技术中心(NCBI)上进行比对分析,确定菌种。结果在所分析的 19 种临床血流感染常见细菌中,16S rRNA 基因测序分析可将除粘质沙雷菌外的细菌鉴定到种的水平,但无法完全区分近缘种属;16S-23SrRNA 成功鉴定 17 种细菌,除大肠埃希菌、宋内志贺菌外所有细菌均成功鉴定到单一种的水平。结论 16S-23S rRNA 基因可作为血流感染细菌检测较好的分子靶标。     

1株沙门样大肠埃希菌的分离与鉴定

目的对1株与沙门菌抗血清发生交叉凝集的肠道菌分离株进行鉴定。方法分别通过生化培养、抗血清凝集试验与16S rRNA序列比对分析,对该菌株进行鉴定。结果该菌株的分离培养、生化代谢特征均与大肠埃希菌一致,但能与沙门菌属多型、群特异性抗血清发生凝集,与大肠埃希菌抗血清无凝集反应。序列分析结果表明,该菌株16S rRNA与大肠埃希菌一致,与沙门菌属存在明显差异。结论本实验分离获得1株具有沙门菌血清凝集特征的大肠埃希菌。     

伯氏疏螺旋体5S～23SrRNA和D剃基因在浙江省鼠标本检测中的应用

目的探索5S～23SrRNA和ospA基因序列在伯氏疏螺旋体检测中的应用,了解浙江省鼠中感染伯氏疏螺旋体状况。方法用PCR方法,检测磐安县100只鼠标本中5S～23SrRNA和ospA基因特异片段。对检测到的阳性结果进行测序。结果检测100只鼠标本,其中3只鼠标本伯氏疏螺旋体的5S～23SrRNA基因片段为阳性,5只鼠标本伯氏疏螺旋体的ospA基因片段为阳性,与参考核酸序列基本一致。结论 利用ospA和5S～23S rRNA基因能从标本中检测到伯氏疏螺旋体。     

乳酸杆菌及嗜热链球菌的种水平鉴定——16SrRNA基因PCR扩增及序列分析

目的建立鉴定乳酸杆菌及嗜热链球菌的16SrRNA基因PCR方法。方法优化细菌DNA提取方法及PCR反应条件,将细菌16SrRNA基因的PCR产物克隆到质粒载体上并进行序列分析,以对乳酸杆菌酸奶分离株进行鉴定。结果 16SrRNAPCR鉴定方法将50株益生菌酸奶分离株分为7个种,分别为:保加利亚乳酸杆菌24株、嗜热链球菌12株、嗜酸乳酸杆菌7株、干酪乳酸杆菌3株、德氏乳酸杆菌2株、发酵乳酸杆菌1株及巴黎链球菌1株。结论建立的16SrRNA基因PCR方法灵敏、可靠,适用于乳酸杆菌及嗜热链球菌的鉴定。     

多重PCR检测食品中的金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌

目的建立一种能同时检测食品中金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的多重PCR检测方法。方法采用7.5%NaCl肉汤对食品样品中的金黄色葡萄球菌进行增菌,同时采用GN增菌剂对食品样品中的志贺菌和沙门菌进行增菌。根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、志贺菌的ipaH基因、沙门菌的invA基因设计引物,通过多重聚合酶链反应(PCR)反应对食品样品中上述三种病原菌的目标基因进行扩增,同时对反应体系进行优化。结果特异性实验表明本方法的特异性良好。对污染金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的牛奶样品进行检测,检出限为1cfu/ml。结论本实验建立的多重PCR检测方法适用于食品中金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的快速检测,具有快速、简便、灵敏的特点。     

利用荧光素原位分子杂交检验水样中嗜肺军团菌的研究

目的：利用针对嗜肺军团菌种特异性16SrRNA和军团菌致病基因-巨噬细胞感染增强因子（mip）序列探针原位分子杂交建立嗜肺军团菌的快速、特异性检验方法。方法：设计特异性针对嗜肺军团菌种特异性16SrRNA和mip探针，采用荧光素标记探针对采自西安市8家宾馆中央空调冷凝水、贮水池水各8份进行原位分子杂交，并且结合细菌分离、生化鉴定技术检验水样中嗜肺军团菌。结果：细菌分离鉴定表明2份冷凝水、5份贮水池水分离到可疑菌落，抗体凝集实验证实嗜肺军团菌血清Ⅰ型3份、Ⅴ、Ⅵ型各1份，2份阴性。实验周期约10～12d；原位分子杂交显示16SrRNA、mip的探针杂交信号成堆分布于原虫细胞内，形如杆菌状，16SrRNA与mip的杂交信号存在完全双标记，但有少数mip的杂交信号不与16SrRNA共存，5株鉴定为嗜肺军团菌Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ型的水样原虫中，经16SrRNA、mip探针杂交均为阳性，对2株非嗜肺军团菌水样原虫进行16SrRNA、mip的杂交结果均为阴性。实验周期约20h。结论：结果表明该方法适用于对存在于原虫内致病性嗜肺军团菌进行检验，是种快速、特异性的致病性嗜肺军团菌检验方法。     

细菌16S rRNA在诊断非中性粒细胞性腹水自发性细菌性腹膜炎中的应用

目的 评价荧光定量PCR检测腹水细菌16S rRNA基因在诊断非中性粒细胞性腹水自发性细菌性腹膜炎患者中的临床应用价值.方法 用细菌16S rRNA基因荧光定量PCR法检测64例非中性粒细胞性腹水疑似自发性细菌性腹膜炎患者及6例慢性肝病伴非感染性腹水患者腹水中的细菌DNA,同时与腹水细菌培养结果进行对比.结果 细菌16S rRNA荧光定量PCR最低可检测到10个拷贝的DNA复制,检测细菌的阳性率明显高于细菌培养的阳性率,分别为15.63%和3.13%,两组差异有统计学意义(x2=5.52,P＜0.05).6例非感染性腹水荧光定量PCR及细菌培养均阴性.结论 腹水细菌16S rRNA荧光定量PCR检测细菌的特异性强、敏感性高,在诊断非中性粒细胞性腹水自发性细菌性腹膜炎患者中具有重要的临床应用价值.     

Copy number of the 16S rRNA gene in Coxiella burnetii

Coxiella burnetii is an obligate intracellular bacterium with a doubling time of 5–7 hours. Chromosomal DNA from C. burnetii was digested with various restriction enzymes previously determined to not cut within the genomic 16S rRNA gene, or with a combination of these noncutting enzymes in conjunction with AflIII, a restriction enzyme that cuts twice within the 16S rRNA gene. Restriction fragments were resolved electrophoretically and probed with a radiolabeled DNA fragment containing the 3 AflIII portion of the C. burnetii 16S rRNA gene. Only a single DNA fragment in these digests hybridized to the probe, indicating that there is a single genomic copy of the 16S rRNA gene in C. burnetii and thus only a single copy of the rRNA operon.     

武汉市2006年食品中沙门菌污染状况监测

目的:了解武汉市2006年食品中沙门菌的污染状况,为国家食品安全监测网提供数据。方法:随机从武汉超市和集贸市场采取生畜肉、生禽肉、熟肉制品、水产品、生食蔬菜、蔬菜沙拉样品共172份,经过两步增菌后,用HE和科玛嘉沙门菌选择性平板分离,可疑菌株再进行API生化条和血清学鉴定。结果:从31份样品中分离出沙门菌,检出率18.02%,其中以生牲畜肉最高(37.14%),熟肉制品次之(21.21%)。结论:武汉市2006年食品沙门菌污染严重,应加强食品安全监督。     

鼠疫耶尔森氏菌16S-23S rRNA基因间区的酶切位点分析

目的：了解鼠耶尔森氏菌１６Ｓ－２３ＳｒＲＮＡ基因间区的酶切位点分布情况。方法：ＰＣＲ扩增及限制性内切酶分析。结果：对ＥＶ菌及不同来源的１０３株鼠疫耶尔森氏菌１６Ｓ－２３ＳｒＲＮＡ基因间区进行了扩增,选用限制性内切酶Ｔａｑ、１ｅｙ Ｍｓｐ１对扩增产物进行酶切分析,结果发现所用鼠疫耶尔森氏菌该间区扩增产物及酶切图谱一致,选用Ｔａｑ１＋Ｍｓｐ,Ｈｉｎｆ１＋Ｍｓｐ１对ＥＶ菌１６Ｓ－２３ＳｒＲＮＡ基因间区扩