IL-18对肾小管上皮细胞Col-IV及MCP-1表达和分泌的影响

目的 探讨白细胞介素18（IL-18）对肾小管上皮细胞Col-IV及MCP-1表达和分泌影响。 方法 应用终浓度为0、0.1、1、10、100ng/mL的IL-18处理体外培养人类近端肾小管上皮细胞株（HK-2细胞）24h、48h和72h。应用RT-PCR法检测IL-18对HK-2细胞Ⅳ型胶原（Col-IV）及单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）mRNA表达;采用ELISA法测定细胞培养上清中Col-IV及MCP-1分泌水平。 结果 IL-18呈剂量和时间依赖性地促进HK-2细胞Col-IVmRNA和MCP-1 mRNA的表达,IL-18呈剂量和时间依赖性地促进HK-2细胞Col-IV的分泌,呈剂量依赖性地促进HK-2细胞MCP-1分泌,但其蛋白分泌量在24h即达高峰,未见时间依赖关系。 结论 IL-18可能部分通过促进细胞外基质的过度分泌和炎症细胞趋化,参与促进肾间质纤维化的进程。     

TGF-β1对肾小管上皮细胞炎症相关趋化因子表达的影响

目的 观察转化生长因子β1(TGF-β1)对肾小管上皮细胞炎症相关趋化因子表达的影响,探讨其在肾间质炎症进展中的作用.方法 体外培养人近端肾小管上皮细胞系(HK-2),用不同浓度(0～10 ng/mL)TGF-β1刺激24 h或用5 ng/mL TGF-β1刺激不同时间(0～48 h),荧光定量PCR技术和ELISA方法分别检测趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白介素-8(IL-8)、正常T细胞活化后表达和分泌调节蛋白(RANTES)的mRNA和蛋白表达的变化.结果 TGF-β1能诱导HK-2细胞MCP-1、IL-8、RANTES的表达上调,且呈剂量和时间依赖效应.2 ng/mL TGF-β1作用24 h即可诱导MCP-1和IL-8 mRNA明显升高,5 ng/mLTGF-β1作用时达高峰.MCP-1和IL-8蛋白分泌分别于刺激后36 h和24 h达高峰.2 ng/mL和5 ng/mL TGF-β1均可诱导RANTES mRNA明显升高,2 h时RANTES mRNA表达开始升高,24 h达高峰;RANTES蛋白基础分泌水平极低,TGF-β1作用24 h时RANTES蛋白分泌开始升高,36 h达高峰.结论 TGF-β1诱导能明显上调趋化因子MCP-1、IL-8和RANTES的mRNA表达和蛋白分泌.因此,有效干预TGF-β1诱导的趋化因子的表达可能成为减轻肾间质炎症的途径之一.     

TGF-β1对肾小管上皮细胞炎症相关趋化因子表达的影响

目的观察转化生长因子β1(TGF-β1)对肾小管上皮细胞炎症相关趋化因子表达的影响,探讨其在肾间质炎症进展中的作用。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞系(HK-2),用不同浓度(0~10 ng/mL)TGF-β1刺激24 h或用5 ng/mL TGF-β1刺激不同时间(0~48 h),荧光定量PCR技术和ELISA方法分别检测趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白介素-8(IL-8)、正常T细胞活化后表达和分泌调节蛋白(RANTES)的mRNA和蛋白表达的变化。结果TGF-β1能诱导HK-2细胞MCP-1、IL-8、RANTES的表达上调,且呈剂量和时间依赖效应。2 ng/mL TGF-β1作用24 h即可诱导MCP-1和IL-8 mRNA明显升高,5 ng/mLTGF-β1作用时达高峰。MCP-1和IL-8蛋白分泌分别于刺激后36 h和24 h达高峰。2 ng/mL和5 ng/mL TGF-β1均可诱导RANTES mRNA明显升高,2 h时RANTES mRNA表达开始升高,24 h达高峰;RANTES蛋白基础分泌水平极低,TGF-β1作用24 h时RANTES蛋白分泌开始升高,36 h达高峰。结论TGF-β1诱导能明显上调趋化因子MCP-1、IL-8和RANTES的mRNA表达和蛋白分泌。因此,有效干预TGF-β1诱导的趋化因子的表达可能成为减轻肾间质炎症的途径之一。     

乙醛对人肾小管上皮细胞合成分泌TGF-β1的影响研究

目的 通过研究乙醛对体外培养的人肾小管上皮细胞合成分泌转化生长因子-β1 (TGF-β1)的影响,以探讨乙醛导致肾小管间质纤维化的机制.方法 选取人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)培养于含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液中.以不同浓度的乙醛(0、50、100、200、400 μmol/L)刺激HK-2细胞24 h.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HK-2细胞中TGF-β1的基因表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中TGF-β1的蛋白表达.酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞培养上清液中TGF-β1的水平.结果 RT-PCR和Western blot结果显示,乙醛呈剂量依赖性地增加HK-2细胞中TGF-β1基因和蛋白的表达;ELISA法结果显示,乙醛呈剂量依赖性地增加HK-2细胞培养上清液中TGF-β1的水平.结论 乙醛能够促进体外培养的人肾小管上皮细胞合成分泌TGF-β1,从而促进肾小管间质纤维化的进展.     

C3a-C3aR在尿酸促进人肾小管上皮细胞MCP-1表达中的作用

目的 探讨尿酸(UA)对人肾小管上皮细胞单核趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响及其机制。 方法 体外培养人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2),以不同浓度UA分别作用不同时间,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测MCP-1的mRNA水平。在UA诱导下,通过针对补体C3的小干扰RNA(C3 siRNA)转染下调HK-2细胞内源性C3的表达、小分子C3aR阻断剂SB290157阻断C3a-C3aR作用、外源性C3a刺激促进C3aR激活3种方式抑制或激活C3aR的信号通路,并通过实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测其对于MCP-1 mRNA表达的影响。 结果 150 μmol/L UA干预HK-2细胞12 h可上调MCP-1 mRNA转录水平; C3 siRNA转染或C3aR阻断能够抑制被UA上调的MCP-1 mRNA的表达; C3a与UA共同进行干预时,显著增强UA对MCP-1 mRNA的诱导作用。 结论 UA可上调HK-2细胞MCP-1 mRNA的表达,其机制可能与UA激活C3或C3aR有关。     

极低密度脂蛋白对人肾小球系膜细胞脂质沉积和单核细胞趋化蛋白-1表达的影响

目的 通过研究极低密度脂蛋白(VLDL)诱导人肾小球系膜细胞脂质沉积和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)分泌的情况,探讨其肾毒性的机制.方法 采用一种已建立的人肾小球系膜细胞株(HMCLs)为研究对象,通过油红"O"染色和酶法分别定性和定量检测细胞内脂质沉积情况;使用实时荧光定量RT-PCR和ELISA法分别检测细胞MCP-1 mRNA和蛋白表达水平;通过HMCLs与THP-1的共孵育,检测单核细胞的趋化黏附情况.结果 VLDL可呈时间和浓度依赖性诱导HMCLs细胞内脂质沉积.随着VLDL刺激时间的延长(0～24 h)和浓度的增加(0～200μg/ml),细胞内甘油三酯积聚逐渐增多,总胆固醇未发现明显变化.VLDL在一定时间(0～6 h)和浓度范围(0～100μg/ml)内可呈时间和剂量依赖性刺激HMCLs MCP-1 mRNA的表达.VLDL可呈剂量依赖性(0`100 μg/ml)上调MCP-1蛋白的分泌;剂量依赖性(0～200μg/ml)增加HMCLs对THP-1单核细胞的趋化.结论 VLDL可通过诱导HMCLs细胞内脂质积聚和增加MCP-1分泌发挥其脂毒性作用.     

白细胞介素-18促肾小管上皮细胞转分化的机制研究

目的探讨白细胞介素-18（IL-18）诱导体外培养的人近端肾小管上皮细胞转分化的细胞内信号的转导机制。方法应用细胞培养技术培养HK-2细胞。予不同浓度的p38MAPK通路特异性阻断剂SB203580预孵育细胞30min后,再加入IL-18共同培养。应用RT—PCR方法检测α-SMA mRNA的表达水平,ELISA方法测定细胞胞浆中α—SMA的表达水平。结果SB203580可呈剂量依赖性地抑制IL—18诱导的HK-2细胞α-SMA基因和蛋白的表达。结论阻断p38MAPK信号通路可明显抑制IL—18诱导的HK-2细胞转分化作用：p38MAPK通路可能是调控IL-18诱导的HK-2细胞转分化的主要信号通路之一。     

非诺贝特对游离脂肪酸诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的探讨非诺贝特对游离脂肪酸诱导的肾小管上皮细胞(HK-2)凋亡的影响。方法通过MTT法检测细胞的增殖,分光光度法检测细胞MDA表达和SOD活性;ELISA法检测细胞上清中的MCP-1和IL-8;Real-time PCR法及Western blot分别检测Bax和Bcl-2的m RNA和蛋白表达水平。结果游离脂肪酸的刺激呈剂量和时间依赖性抑制HK-2细胞的增殖,并使细胞Bax的m RNA与蛋白表达显著上升,Bcl-2的m RNA和蛋白的表达显著下降。非诺贝特的加入显著减轻游离脂肪酸对HK-2细胞增殖的抑制作用;并使细胞bax的m RNA与蛋白表达下降,而Bcl-2的m RNA与蛋白的表达上升。同时细胞SOD表达水平上升,MDA的表达水平下降;炎性介质MCP-1和IL-8表达水平均下降。结论游离脂肪酸诱导的肾小管上皮细胞凋亡具有时间和剂量依赖性,非诺贝特可通过减少氧化应激,抑制炎性反应,上调Bcl-2以及下调Bax的表达来抑制游离脂肪酸诱导的细胞凋亡,从而减少其肾毒性。     

阿昔洛韦诱导的人肾小管上皮细胞NGAL、IL-18表达及其意义

目的观察不同浓度阿昔洛韦诱导的体外培养人近端肾小管上皮细胞（HK-2）的形态变化、IL-18、NGAL的表达及其意义。方法将正常培养的HK-2细胞分组：1正常组;22μg/ml阿昔洛韦组;33μg/ml阿昔洛韦组（模型组）。各组干预12 h后,倒置显微镜下观察各组细胞状态、细胞数量变化,逆转录-聚合酶链式反应法（RT-PCR）检测各组细胞IL-18、NGAL基因表达水平,Western-blotting法检测各组IL-18、NGAL蛋白表达。结果12μg/ml阿昔洛韦及3μg/ml阿昔洛韦组,细胞生长与正常组比较无差异,但细胞形态异常;2在mRNA水平,模型组干预后,IL-18水平明显增高,NGAL水平明显增高,与正常组比较P〈0.01;与蛋白水平表达方面类似。结论阿昔洛韦对HK-2细胞的生长有浓度依赖性抑制作用;高浓度的阿昔洛韦可导致HK-2细胞结晶,低浓度阿昔洛韦诱导的肾小管上皮细胞损伤伴有NGAL、IL-18的异常表达和分泌,对临床早期监测阿昔洛韦所致急性肾损伤有重要意义。     

马兜铃酸Ⅰ诱导人肾小管上皮细胞转分化机制的初步探讨

目的:探讨马兜铃酸Ⅰ(aristolochic acid Ⅰ,AAI)诱导体外培养的人肾小管上皮细胞株(HK-2)转分化的可能机制.方法:将HK-2细胞分为对照组和AAI组,两组细胞分别培养24h、48h、72h.应用倒置相差显微镜观察HK-2细胞形态学变化;免疫组织化学方法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle acfin,α-SMA)的表达;ELISA法定量检测上清液中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表达;逆转录-聚合酶反应(RT-PCR)检测结缔组织生长因子(connection tissue growth factor,CTGF)mRNA的水平变化.结果:20μg/ml的AAI可诱导HK-2细胞肥大、拉长呈梭形,TGF-β1分泌增加,CTGFmRNA合成增加,α-SMA表达增强.这些作用呈一定的时间依赖性.结论:AAⅠ可诱导肾小管上皮细胞转分化,可能与TGF-β1分泌增多有关,而TGF-β1可能通过下游CTGF发挥生物学效应.     

SARA在高糖诱导肾小管上皮细胞转分化中的表达变化

目的：建立高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化模型,检测肾小管上皮细胞转分化过程中Smad锚着蛋白（Smad anchor for receptor activation, SARA）的表达变化。方法：采用Western印迹和实时定量PCR检测细胞波形蛋白（vimentin）、紧密连接蛋白（Zona occludens-1, ZO-1）、SARA蛋白及其mRNA表达水平。结果：30 mmol/L D-葡萄糖刺激后,HK-2细胞vimentin蛋白及其mRNA水平呈时间依赖性升高,而ZO-1蛋白及其mRNA水平呈时间依赖性下降,此变化在高糖刺激48 h时最为显著。同时,SARA蛋白及其mRNA表达水平呈时间依赖性下降。结论：高糖可诱导HK-2细胞发生转分化,SARA可能作为保护因子参与了这一过程。     

肾小管上皮细胞中可溶性表氧化物水解酶对小鼠巨噬细胞极化的调控作用

目的探讨肾小管上皮细胞中可溶性表氧化物水解酶(sEH)在小鼠巨噬细胞极化中的作用。方法以人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞及小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞为研究对象。将HK-2细胞分为正常对照组、sEH抑制剂组、尿蛋白组及sEH抑制剂联合尿蛋白组;正常对照组细胞不给予任何干预处理;sEH抑制剂组细胞给予1μmol·L~(-1)sEH抑制剂;尿蛋白组细胞给予10 g·L~(-1)尿蛋白;sEH抑制剂联合尿蛋白组细胞给予10 g·L~(-1)尿蛋白和1μmol·L~(-1)sEH抑制剂;各组细胞均培养24 h。将RAW264.7细胞分为A、B、C、D组及干扰素-γ(IFN-γ)阳性对照组、白细胞介素(IL)-4阳性对照组。A、B、C、D组细胞分别加入正常对照组、sEH抑制剂组、尿蛋白组、sEH抑制剂联合尿蛋白组培养24 h的HK-2细胞培养基孵育24 h;IFN-γ阳性对照组和IL-4阳性对照组细胞分别加入M1型巨噬细胞诱导剂IFN-γ及M2型巨噬细胞诱导剂IL-4。采用Western blot法检测HK-2细胞中sEH蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链反应检测HK-2细胞中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、IL-6、集落刺激因子-1(CSF-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达及RAW264.7细胞中诱导型氮氧化物合酶(iNOS)、IL-6、精氨酸酶-1(Arg~(-1))及IL-10 mRNA表达。酶联免疫吸附试验检测各组HK-2细胞培养上清液中14,15-环氧二十碳三烯酸(14,15-EET)和14,15-脱氧二十碳三烯酸(14,15-DHET)水平,计算14,15-EET/14,15-DHET比值。结果正常对照组和sEH抑制剂组HK-2细胞中sEH蛋白表达及MCP-1、IL-6、CSF-1、TNF-αmRNA表达、细胞培养上清液中14,15-EET/14,15-DHET比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组比较,蛋白尿组HK-2细胞中sEH蛋白及MCP-1、IL-6、CSF-1、TNF-αmRNA表达均显著增加(P<0.05),细胞培养上清液中14,15-EET/14,15-DHET显著降低(P<0.05)。与尿蛋白组比较,sEH抑制剂联合尿蛋白组HK-2细胞中MCP-1、IL-6、CSF-1及TNF-αmRNA表达显著下降(P<0.05),培养上清液中14,15-EET/14,15-DHET显著升高(P<0.05)。sEH抑制剂联合尿蛋白组与尿蛋白组HK-2细胞中sEH蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。A组与B组RAW264.7细胞中IL-6、iNOS、Arg~(-1)及IL-10 mRNA表达比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与A组比较,C组、IFN-γ阳性对照组RAW264.7细胞中iNOS、IL-6 mRNA表达显著增加(P<0.05,P<0.01);IL-4阳性对照组RAW264.7细胞中Arg~(-1)、IL-10 mRNA表达显著增加(P<0.05)。与C组比较,D组RAW264.7细胞中iNOS、IL-6 mRNA表达显著降低(P<0.05),Arg~(-1)、IL-10 mRNA表达显著增加(P<0.05)。结论肾小管上皮细胞中的sEH可上调诱导M1型巨噬细胞极化的细胞因子表达。     

PI3K抑制剂对转化生长因子β1诱导人肾小管上皮细胞Smad泛素化调节因子2表达的影响

目的探讨体外条件下转化生长因子β1(TGF-β1)对人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)表达Smad泛素化调节因子2(Smurf2)的诱导情况,以及PI3K抑制剂LY294002对其的影响。方法应用RT-PCR法检测Smurf2 mRNA的表达,应用Western印迹法检测Smurf2蛋白的表达。结果HK-2细胞有基础量的Smurf2 mRNA和蛋白的表达,TGF-β1呈时间和剂量依赖性增加HK-2细胞Smurf2 mRNA和蛋白的表达(P<0.01)。PI3K抑制剂LY294002呈剂量依赖性抑制TGF-β1(100pM)所诱导的HK-2细胞Smurf2 mRNA和蛋白的表达(P<0.01)。结论在体外,TGF-β1可能通过PI3K/AKT通路诱导HK-2细胞Smurf2 mRNA和蛋白的表达。PI3K抑制剂LY294002可抑制Smurf2 mRNA和蛋白的表达。     

探讨游离脂肪酸对近曲肾小管上皮细胞HK-2的影响及作用机制

目的探讨游离脂肪酸（Free Fatty Acids,FFAs）对人近曲肾小管上皮细胞（HK-2）的影响及作用机制。方法用含有不同浓度（0、125、250、500μmol/L）软脂酸的DMEM-F12培养人近曲肾小管上皮细胞（HK-2）,在0h、24h、48h三个时段：MTT法检测不同环境下FFAs对HK-2细胞增殖的影响,流式细胞术检测FFAs对细胞凋亡和细胞周期的影响,免疫细胞化学法检测处理前后HK-2细胞中白细胞介素-β（IL-β）、白细胞介素-8（IL-8）表达的变化。结果 FFAs呈剂量和时间依赖性抑制HK-2细胞的增殖（P〈0.05）,并可能通过阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡（P〈0.05）。经FFAs作用后,IL-β、IL-8的表达增加。结论游离脂肪酸有抑制HK-2细胞增殖,促进其凋亡的作用,同时炎性细胞因子IL-β、IL-8表达增多,参与了其发生和发展的过程。     

糖基化终产物对人肾小管上皮细胞Fractalkine表达的影响

目的 既往实验已观察到糖基化终产物(advanced glycation end products, AGE)可增加人肾系膜细胞单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)、RANTES等表达,fractalkine(FKN)在糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)中的作用尚不明确.本实验探讨AGE对人肾小管上皮细胞(tubular epithelial cells, TEC)株HK-2 FKN表达的影响.方法 运用AGE-BSA按不同的时间和浓度干预HK-2,分别用RT-PCR和ELISA法检测FKN mRNA的表达及蛋白分泌;用AGE-BSA及AGE-BSA加FKN中和抗体分别干预HK-2,用Transwell小室、共培养及荧光染色法检测HK-2趋化和黏附单核细胞株U937的功能.结果 AGE-BSA干预组的HK-2 FKN的mRNA表达和蛋白分泌较对照组显著增加(P＜0.05),且随干预时间和浓度的增加而进一步增加.AGE-BSA干预组HK-2趋化及黏附的U937数较对照组和加FKN抗体组明显增加(P＜0.01). 结论 AGE可能部分通过FKN/CX3CR1途径参与DN肾小管间质病变的发生发展.     

表面活性蛋白A不同亚型在脂多糖诱导肾小管上皮细胞IL-8表达中的作用

目的探讨表面活性蛋白A(surfactant protein A,SP-A)不同亚型(SP-A1,SP-A2)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)IL-8表达的影响。方法体外培养HK-2细胞,分别转染SP-A1、SP-A2及阴性对照siRNA,实时定量PCR检测SP-A1及SP-A2 mRNA表达水平,并给予1μg/ml LPS刺激8h,ELISA观察转染不同siRNA后IL-8蛋白表达变化。结果转染SP-A1、SP-A2 siRNA可分别显著下调转染SP-A1、SP-A2的mRNA表达水平(P<0.05);1μg/ml LPS刺激8h可引起HK-2细胞IL-8蛋白表达显著增加(P<0.05),低表达SP-A2可下调LPS诱导的IL-8表达(P<0.05)。结论 LPS刺激下肾小管上皮细胞IL-8表达增加与SP-A2的表达有关,SP-A2可能在肾脏炎性反应中发挥重要作用。     

P13K抑制剂对转化生长因子β1诱导人肾小管上皮细胞Smad泛素化调节因子2表达的影响

目的 探讨体外条件下转化生长因子β1（TGF-β1）对人近端肾小管上皮细胞系（HK-2）表达Smad泛素化调节因子2（Smurf2）的诱导情况，以及P13K抑制剂LY294002对其的影响。方法 应用RT-PCR法检测Smurf2mlKNA的表达，应用Western印迹法检测Smurf2蛋白的表达。结果 HK-2细胞有基础量的Smurf2mlKNA和蛋白的表达，TGF-β1呈时间和剂量依赖性增加HK-2细胞Smurf2mRNA和蛋白的表达（P〈0．01）。P13K抑制剂LY294002呈剂量依赖性抑制TGF-β1（100pM）所诱导的HI〈-2细胞Smurf2mRNA和蛋白的表达（P〈0．01）。结论 在体外，TGF-β1可能通过P13K／AKT通路诱导HK-2细胞Smurf2mRNA和蛋白的表达。P13K抑制剂LY294002可抑制Smurf2mRdNA和蛋白的表达。     

高尿酸通过TLR4/NF-κB信号通路诱导肾小管上皮细胞上皮-间充质转化的作用研究

目的 探讨尿酸诱导肾小管上皮细胞上皮-间充质细胞转化(epithelia-mesenchymal transition,EMT)的作用及机制.方法 采用不同质量浓度的尿酸预孵育肾小管上皮细胞(HK-2)48 h,通过倒置显微镜观察尿酸对HK-2细胞形态的影响,Western blot检测Fibronectin、α-SMA和E-cadherin蛋白表达变化.Real-time PCR检测炎症因子IL-1 β、IL-6以及TNF-α mRNA的表达变化,免疫荧光检测上皮细胞标志物cytokeratin和间充质细胞标志物vimentin的表达变化.结果 与正常组相比,15 mg/dL的尿酸处理HK-2细胞48 h后,HK-2细胞间隙增大,呈长梭形改变.间充质细胞标志物Fibronectin、α-SMA表达明显升高,而上皮细胞标志物E-cadherin的表达明显下降(P＜0.05).同时,高浓度尿酸诱导了HK-2细胞炎症因子IL-1β、TNF-α的表达升高(P＜0.05),TLR4/NF-κB信号通路活化,而靶向抑制NF-κB信号通路活化可以显著抑制尿酸诱导的EMT.结论 高尿酸可以通过活化TLR4/NF-κB信号通路诱导肾小管上皮细胞EMT的发生,靶向干预NF-κB信号通路可以显著抑制尿酸诱导的肾间质纤维化.     

单核细胞趋化蛋白-1诱导肾小管上皮-肌成纤维细胞转化的作用及机制探讨

目的 探讨单核细胞趋化蛋白(MCP)-1诱导.肾小管上皮细胞发生上皮-肌成纤维细胞转化(EMT)的作用和细胞分子机制,主要是EMT过程中Erk1/2、P38MAPK、RhoA、RhoC、Snail表达水平的变化.方法 将HK-2细胞分为阴性对照组,阳性对照组(TGF-β1、5 μg/L),MCP-1作用组(0.1、1、10、100 μg/L),观察不同时间(12、24、48、72 h)MCP-1刺激与α-SMA表达水平之间的变化.用Western印迹方法检测肾小管上皮细胞PErk1/2、Erk1/2、P-P38MAPK、P38MAPK、RhoA蛋白水平的变化,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测RhoC、Snail基因水平的变化.此外,分别观察Erk、P38MAPK、Rho信号通路的阻断剂(PD98059、SB203580、Y27632)对MCP-1诱导EMT的影响.结果 在不同浓度MCP-1刺激下,HK-2细胞α-SMA mRNA及蛋白表达水平均明显增强,以1 μg/L刺激下表达最强;在1 μg/L MCP-1作用下,24、48、72 h α-SMA mRNA及蛋白表均达显著高于阴性对照组(均P＜0.05),48 h作用达到最高峰.在不同浓度(0.1、1、10、100 μg/L)MCP-1刺激5 min时,HK-2细胞(PErk1/2)/(Erk1/2)和(P-P38MAPK)/(P38MAPK)的比值均显著高于阴性对照组(均P＜0.05),并表现为剂量依赖性.不同浓度MCP-1刺激下RhoA蛋白水平和RhoC基因表达水平与阴性对照组比较差异均无统计学意义(均P＞0.05).PD98059可以部分阻断MCP-1诱导的肾小管上皮细胞α-SMA蛋白表达水平,与阳性对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05);而SB203580及Y27632均不能阻断MCP-1诱导的α-SMA蛋白表达,与阳性对照组比较差异无统计学意义(均P＞0.05).MCP-1(10、100 μg/L)刺激下Snail基因表达水平明显升高,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 MCP-1诱导体外培养的HK-2细胞发生EMT与上调Erk1/2信号转导通路有关,并可能与上调Snail转录因子水平有关,本研究未能证实该机制与P38MAPK信号通路及Rho信号转导通路有关.     

肝细胞生长因子和血管紧张素Ⅱ对肾小管上皮细胞转分化的影响及其作用机制

目的: 探讨肝细胞生长因子(HGF)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化(TEMT)的影响,并阐明其作用机制。方法: 体外培养人近曲小管上皮HK-2细胞,取Ⅳ期细胞分为对照组、AngⅡ(1×10^-6mol·L^-1)组、HGF(8 μg·L^-1)组和AngⅡ(1×10^-6mol·L^-1)+HGF(8 μg·L^-1)组。采用CCK8法检测HK-2细胞增殖情况,RT-PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA表达水平,Western blotting法检测α-SMA的蛋白表达水平。结果: 与对照组比较,AngⅡ组HK-2细胞增殖活性降低(P<0.01),HGF组HK-2细胞增殖活性升高(P<0.05),AngⅡ+HGF组HK-2细胞增殖活性降低(P<0.05)。与对照组比较,AngⅡ组 HK-2细胞中α-SMA mRNA及蛋白表达水平升高(P<0.05或P<0.01),HGF组HK-2细胞中α-SMA mRNA及蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01), AngⅡ+HGF组HK-2细胞α-SMA mRNA及蛋白表达水平降低(P<0.05); 与AngⅡ 组比较,AngⅡ+HGF组细胞增殖活性升高(P<0.05),α-SMA mRNA及蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论: AngⅡ抑制肾小管上皮细胞增生而促进TEMT, HGF促进肾小管上皮细胞增生而抑制TEMT,HGF可能介导AngⅡ抑制HK-2细胞增生及促进TEMT的作用。