金钗石斛遗传多样性研究的ISSR-PCR反应体系建立与优化

目的：对影响金钗石斛ISSR-PCR扩增效果的一些因素进行优化,为进一步研究其遗传多样性奠定基础。方法：通过筛选引物并设定影响金钗石斛ISSR反应诸因子的不同浓度,检测ISSR不同反应体系的扩增效果;通过分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,建立金钗石斛ISSR稳定可靠的反应体系。结果：金钗石斛较适宜的ISSR-PCR反应条件为：10 lμPCR反应体系,含5～15 ng模板DNA、2.0 mmol/L Mg^2＋、0.20 mmol/L dNTP、0.6～0.75 U Taq DNA聚合酶、1.0μmol/L引物。较适宜的退火温度为46～62℃。结论：Taq酶质量、DNA模板品质、退火温度等对ISSR反应结果具有较大影响。所建立的金钗石斛ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可用于金钗石斛的遗传多样性研究。     

白花蛇舌草的简单重复序列区间(ISSR)遗传多样性分析

采用简单重复序列区间(ISSR)分子标记对不同产地白花蛇舌草的遗传多样性进行分析。分别在广西壮族自治区、广东省、湖南省、浙江省、福建省、江西省和安徽省共采集23份白花蛇舌草样品,选用150条ISSR引物进行PCR扩增,运用POPGENE1.32、NTSYS2.10软件进行遗传多样性分析。筛选出11条引物,扩增出115条多态性条带,多态性比率为85.22%,等位基因数(Na)为1.852 2,有效等位基因(Ne)为1.543 4,Neis基因多样性指数(H)为0.316 5,Shannon′s信息指数(I)为0.470 0。聚类分析结果表明白花蛇舌草可分成3类,实验结果表明ISSR分子标记可以为白花蛇舌草的系统分类和鉴定提供分子水平的科学依据。     

采用ISSR分子标记进行草珊瑚8个种源的遗传多样性分析

目的研究草珊瑚的遗传多样性及不同种源之间的遗传关系,为保护种质资源奠定基础。方法采用ISSR分子标记对8个种源共51个草珊瑚样品进行了DNA分子水平的分析评价,用Popgen32软件计算遗传多样性和遗传距离,通过UPCMA法进行聚类分析。结果筛选出10条多态性ISSR引物用于草珊瑚不同样品的ISSR-PCR,检测得到111个位点,其中106个为多态性位点,约占95.50%。草珊瑚不同种源间遗传距离在0.0347～0.1850。8个种源总遗传多样性主要来自种源内遗传变异,种源间分化指数Gst=0.3403。结论8个草珊瑚种源大体可以分成2大类群。且根据遗传距离与产地海拔高度的关系,可以将其划分为较高海拔类群(800～900m)、较低海拔类群(250～300m)、中等海拔类群(600m)。     

ISSR分析3种类型黄连的遗传多样性和遗传结构

目的 研究3种类型黄连的遗传多样性和遗传结构。方法 对3种类型黄连的90个单株进行ISSR分析,运用POPGENE 1.31软件计算相关参数。结果 22个引物共检测到164个位点,其中108个为多态位点;黄连3种类型具有较丰富的遗传多样性,在物种水平上,多态位点百分率（PPB）为65.85%,有效等位基因数（N_e）为1.229 8,Nei’s基因多样度指数（H）为0.144 0,物种水平Shannon’s多样性信息指数（H_sp）为0.230 2;在类型水平上,PPB为55.08%,N_e为1.218 9,H为0.136 0,类型水平Shannon’s多样性信息指数（H_pop）为0.215 1。Nei’s基因多样性指数计算的类型间遗传分化系数与Shannon’s类型分化系数分别为0.056 1和0.065 2,均说明大部分遗传变异存在于类型内;ISSR标记检测到类型间存在着广泛的基因流（N_m＝8.405 4）,遗传分化程度较低;两两类型间的Nei’s遗传一致度（I）的范围为0.983 1～0.989 7;根据Nei’s遗传距离进行各类型间的UPGMA聚类,基于ISSR分子标记的聚类结果与形态分类基本一致。结论 3种类型的黄连遗传多样性较高,为新品种的培育提供了丰富的遗传基础。     

ISSR分子标记对金荞麦8个野生居群的遗传多样性分析

目的 对野生金荞麦进行遗传多样性研究。方法 通过ISSR技术对8个野生金荞麦居群的共92个个体进行遗传多样性分析。结果 用12个随机引物共扩增出103条清晰条带,其中90条具多态性,平均多态性位点比率为87.38%,Nei′s基因多样性指数H=0.374 7,Shannon多样性指数I=0.572 8,遗传分化指数Gst=0.171 8。遗传距离和遗传一致度分别为：0.043 1～0.384 9和0.684 3～0.954 5。结论 金荞麦种内具有较高的遗传多样性,遗传变异主要存在于居群内部,遗传多样性与地理关系表现出明显的相关性。ISSR可以作为研究遗传多样性及遗传分化的有效标记。     

金钗石斛的茎段组织培养与植株再生

目的：为了有效加速贵重药用植物金钗石斛的人工繁殖。方法：以带侧芽的金钗石斛茎段作外殖体；不同种类的培养基、同种培养基用于不同配比的激素进行培养，结果：以MS培养基附加6－BA（0.5mg/L）、NAA（0.2mg/L）诱导分化最佳，附加6－BA（3．0mg/L）、NAA（0．5mg/L），增殖最适，附加IBA（0．3mg/L）、NAA（0．1mg/L）对生根最适（生根率95％）。生根小苗在以椰渣，碎火山石块，碎砖块（1：1：1）的基质中覆以蕨长势良好，结论：为确保金钗石斛资源的保持和可持续利用提供有效途径。     

铁皮石斛人工栽培居群的遗传多样性研究

目的 了解铁皮石斛人工栽培居群的遗传多样性,为种质资源的保护与新品种的选育提供基础。方法 利用RAPD分子标记对浙江义乌、天台、建德、武义,云南麻栗坡、勐海的14个居群的铁皮石斛和1个居群的紫皮石斛进行遗传多样性分析。结果 从225个RAPD引物中筛选出15个引物,对105个铁皮石斛和3个紫皮石斛样本进行PCR扩增,共扩增出138条带,其中133条为多态性条带,多态性条带比率（PPB）为96.38%;14个铁皮石斛居群的多态位点（PPL）在10.79%～76.26%,平均为45.32%。结论 全国主产区人工栽培的铁皮石斛遗传多样性丰富,铁皮石斛种质的亲缘关系远近与其地理种源具有显著的相关性,与栽培地点无关。     

基于ISSR的栝楼遗传多样性分析

目的 对栝楼的遗传多样性进行分析,旨在为栝楼的遗传育种中亲本的组配奠定基础。方法 采用ISSR分子标记法对采自不同种植地区的34份栝楼种质进行多态性和聚类分析。结果 不同种植地区的栝楼的遗传多态性可达90.0%;根据ISSR聚类结果可将34份栝楼种质分为食籽用型、药食两用型和野生型3大类群。结论 栝楼种质之间存在着较高的遗传多样性,与种植地区没有相关性。     

中金钗石斛相关序列扩增多态性反应体系的正交优化研究药大质量观及实践

目的 建立金钗石斛Dendrobium nobile相关序列扩增多态性 (SRAP) 反应体系,为金钗石斛分子生物学研究提供技术支持。方法 运用 L25(56) 正交设计对影响金钗石斛 SRAP 反应的5个因素：模板 DNA、Mg2+、dNTPs、Taq 酶、引物在5个水平上进行优化试验,对 PCR 结果进行极差分析。结果 金钗石斛 SRAP 反应最佳体系为：25 μL PCR 体系中含有 20 ng 模板 DNA,2.0 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L dNTPs, 1 U Taq 酶,0.6 μmol/L 引物。各因素对 SRAP 反应的影响依次为：〖WTBX〗Taq 酶＞Mg2+＞dNTPs＞模板 DNA＞引物。结论 所建立的金钗石斛 SRAP 反应体系具有标记位点清晰、多态性丰富、稳定性好等特点,可用于金钗石斛分子生物学的研究。     

苦豆子ISSR标记的遗传多样性分析

目的 通过对产自宁夏、甘肃、青海、新疆和内蒙的苦豆子遗传多样性和亲缘关系的分析,为野生苦豆子资源的驯化和保护等提供依据。方法 采用ISSR分子标记技术,对22个苦豆子居群的DNA进行扩增,对其扩增条带进行遗传多样性分析,在所得遗传距离的基础上进行UPGMA聚类和主成分分析（PCA）,并绘制亲缘关系树状聚类图。结果 51条ISSR引物共检测到433个位点,每条引物5～12个,平均8.49个;平均多态性位点百分率（PPB）93.30%;Nei’s遗传多样性指数（H）和Shannon信息指数（I）分别为0.335 1、0.499 8;遗传距离变幅范围0.173 6～0.650 2。结论 22个苦豆子居群间具有较高的遗传多样性,各居群间遗传距离与地理距离没有明显关系。     

金钗石斛总生物碱对四氧嘧啶所致糖尿病大鼠的保护作用

目的观察金钗石斛总生物碱（Dendrobium nobile Lindl．alkaloids,DNLA）对四氧嘧啶所致糖尿病大鼠的影响。方法体重200—220g的雄性sD大鼠60只随机分为空白、模型、总生物碱低、中、高剂量（40mg／kg、80mg／k卧160mg／kg）及二甲双胍（100mg／kg）组。预先灌胃给药1wk后腹腔注射四氧嘧啶（175mg／kg）制备高血糖大鼠模型,72h后取血测各组大鼠空腹血糖,并观察胰腺组织形态学变化。结果注射四氧嘧啶3d后,大鼠血糖较空白组明显增高（P〈0．05）,胰岛萎缩、数量减少,岛内细胞数减少;与模型组比较,DNLA（40mg／kg、80mg／kg、160mg／kg）及二甲双胍（100mg／kg）可明显降低大鼠血糖水平（P〈0．05）,胰岛数量较多,体积较大,岛内细胞数较多。结论DNLA可降低四氧嘧啶所致糖尿病大鼠血糖水平,其机制与DNLA对胰岛的保护作用有关。     

不同产地金钗石斛HP LC特征图谱的比较

目的：建立金钗石斛HPLC的特征图谱,为其质量评价提供参考。方法采用ZORBAX SB-Aq色谱柱;流动相乙腈-0．2%(体积分数)甲酸,梯度洗脱,流速1．0 mL · min-1;柱温30℃;检测波长270 nm。结果分别建立了不同产地金钗石斛的HPLC特征图谱,一类是以贵州赤水产金钗石斛为代表的HPLC特征图谱,标记出22个共有峰,相似度为0．979~0．998;一类是以云南产金钗石斛为代表的HPLC特征图谱,标记出27个共有峰,相似度为0．902~0．980。结论金钗石斛的HPLC特征图谱主要分为2类,贵州赤水产为一类,云南产为一类,广西产的两类都有。本法稳定可靠、重复性好,可用于不同产地金钗石斛的鉴别和质量控制。     

ISSR标记不同产地的大戟科狼毒种质资源多样性分析简

目的：利用ISSR分子标记技术对不同产地的大戟科狼毒进行了遗传多样性分析。方法：从100条引物中挑选出12条合适的引物对不同产地的大戟科狼毒进行遗传多样性分析。结果：12条引物一共扩增出353条带,用SPSS16.0软件分析,建立了Jaccard相关系数矩阵,构建了遗传树状图,从该图中可知各产地大戟科狼毒的相似系数在0.258~0.845;大戟科狼毒遗传变异与地理分布呈现较明显的相关性。结论：ISSR标记适合于大戟科狼毒基因组DNA多样性分析;ISSR分子标记技术对于大戟科狼毒种质资源划分上有十分重要的影响。     

束花石斛化学成分研究

目的 对束花石斛三氯甲烷部位进行化学成分研究.方法 采用硅胶柱层析、ODS柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱及重结晶等方法对束花石斛三氯甲烷部位进行分离纯化,并通过理化性质与核磁、质谱等光谱分析方法鉴定化合物的结构.结果 分离鉴定出10个单体化合物,分别为纽替皂苷元-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)、2,7-二羟基-4-甲氧基-9-芴酮(2)、dengibsinin(3)、chrysotoxone (4)、丁香醛(5)、对羟基苯甲醛(6)、香草酸(7)、三十一烷醇(8)、十六烷酸(9)、大黄酚(10).结论 化合物1为首次从石斛属植物中分离得到,也是首次在束花石斛中发现变形螺甾烷醇类甾体皂苷.     

束花石斛降血糖活性及化学成分研究

目的研究兰科石斛属植物束花石斛Dendrobium chrysanthum Lindl.各部位的降血糖活性及活性部位的化学成分。方法采用胰岛素抵抗Hep G2细胞模型筛选束花石斛降血糖活性部位,并应用多种柱色谱及重结晶的方法对活性部位进行分离纯化,根据化合物的理化性质和波谱数据鉴定化合物结构。结果加药质量浓度为2.0 mg/m L时,三氯甲烷部位的胰岛素抵抗Hep G2细胞葡萄糖消耗量达到了模型组的442.4%,细胞存活数为模型组的62.9%。从三氯甲烷部位分离并鉴定了10个化合物,分别鉴定为β-谷甾醇(1),moscatin(2),对羟基反式肉桂酸三十烷基酯(3),1,3,5-三甲氧基苯(4),isonuatigentin(5),香豆素(6),2,4,7-三羟基-5-甲氧基-9-芴酮(7),大黄素甲醚(8),丁香酸(9),胡萝卜苷(10)。结论综合考虑降血糖活性及对细胞的毒性,束花石斛三氯甲烷部位活性优于其他部位,其中化合物2~6、9为首次从该植物中分离得到,化合物4、5为首次从该属植物中分离得到。     

金钗石斛水提物对糖尿病大鼠肾组织非酶糖基化及氧化的影响

目的 观察金钗石斛(Dendrobium nobil Lindl, DNL)水提物对糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠肾组织非酶糖基化和氧化应激的影响,探讨DNL对糖尿病大鼠肾脏的保护作用。方法 采用链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导DM大鼠模型,分为正常对照组(N组),糖尿病对照组(DM组),金钗石斛低(DNLL)、中(DNLM)、高(DNLH)剂量组和氨基胍(aminoguanidine, AG)对照组(AG组),给药12周。分别检测血糖、血尿素、肌酐、糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)、尿肌酐、24h尿白蛋白、血清及肾组织AGEs、肾组织总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。透射电镜观察肾组织超微结构变化。结果 DM组大鼠血糖、血尿素、24h尿白蛋白、血清及肾组织AGEs、肾组织MDA含量显著高于N组(P＜0.05);肌酐清除率、肾组织总SOD活性显著低于N组(P＜0.05);DM组大鼠系膜扩张明显异常,基底膜明显增厚。DNL明显降低DM大鼠血糖、血尿素、24h尿白蛋白、血清及肾组织AGEs、肾组织MDA含量(P＜0.05),明显增加肌酐清除率(P＜0.05)、增强肾组织总SOD活性(P＜0.05)、减轻肾系膜的扩张和基底膜的增厚。结论 DNL能降低血糖、抑制AGEs的形成、抑制氧化应激的发生,从而阻止或延缓糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)的发生发展。     

鼓槌石斛乙醇提取物对糖尿病大鼠视网膜组织凋亡相关因子表达的影响

目的:观察鼓槌石斛乙醇提取物(EDC)对糖尿病大鼠视网膜凋亡相关因子表达的影响。方法:SD大鼠随机分为正常对照组、糖尿病模型组(DM组)及EDC低剂量组(LEDC组)和高剂量组(HEDC组)。除正常对照组外,其余各组大鼠均通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型。8周后,LEDC组、HEDC组分别给予EDC100 mg·kg~(-1)·d~(-1)、300 mg·kg~(-1)·d~(-1)灌胃,正常对照组和DM组予等量0.9%Na Cl溶液灌胃。干预8周后,采用HE染色观察各组大鼠视网膜各层结构,Western blot、免疫组化法检测视网膜组织Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达,TUNEL法观察视网膜组织凋亡指数。结果:与正常对照组比较,DM组视网膜内界膜不完整,内、外核层界限模糊,神经纤维层肿胀明显;而EDC不同剂量组与DM组比较,内、外核层界限渐清晰,神经纤维层肿胀减轻。与正常对照组比较,DM组Bax、Caspase-3蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达下降;LEDC组、HEDC组视网膜Bax、Caspase-3蛋白表达明显低于DM组,Bcl-2蛋白表达明显高于DM组(P0.05)。免疫组化结果显示,正常对照组视网膜中未见Caspase-3阳性表达,DM组Caspase-3明显表达于神经纤维层、内核层、色素上皮层,LEDC、HEDC组少量表达于神经纤维层、色素上皮层,并且HEDC组Caspase-3阳性表达低于LEDC组。TUNEL结果显示,DM组大鼠视网膜细胞凋亡指数明显高于正常对照组(P0.01),而HEDC、LEDC组凋亡指数明显降低(P0.01)。结论:EDC可能通过调控糖尿病视网膜病变过程中凋亡相关因子的表达,对糖尿病大鼠视网膜有一定的改善作用。     

鼓槌石斛改善糖尿病性视网膜病活性及其机制

目的 观察鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxum Lindl.)乙醇提取物(DC)对链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导小鼠糖尿病性视网膜病(DR)的改善作用,并研究其可能的机制.方法 采用STZ诱导C57小鼠发生糖尿病(DM),进而诱导产生DR,并给予DM小鼠DC干预.通过视网膜血管免疫荧光染色和视网膜组织苏木精-伊红(HE)染色来检测视网膜血管新生情况;采用实时PCR和酶联免疫分析(ELISA)分别检测视网膜组织血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通路基因表达情况和玻璃体、血清中VEGF含量.结果 DC不同剂量均能够明显降低STZ诱导的糖尿病小鼠视网膜血管新生程度;研究其机制发现,DC能降低STZ诱导的糖尿病小鼠视网膜内增加的低氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α,HIF-1 α),VEGF及其受体VEGFR1和VEGFR2的基因表达,并能降低STZ诱导的糖尿病小鼠玻璃体和血清中增加的VEGF含量.结论 DC具有改善DR的药效活性,其机制为抑制VEGF信号通路的基因表达,并降低玻璃体和血清中的VEGF水平,进而抑制DR病变过程中的视网膜血管新生.     

鄂尔多斯高原锦鸡儿属药用植物的ISSR分析

目的分析鄂尔多斯高原分布的8种锦鸡儿的遗传多样性。方法采用ISSR技术进行研究。结果8种锦鸡儿总的多态位点百分率(PPB)很高,达100%,表明它们的遗传多样性很丰富。但是在种间的分布是不均匀的,藏锦鸡儿、柠条锦鸡儿、狭叶锦鸡儿、荒漠锦鸡儿和中间锦鸡儿的遗传多样性较高,甘蒙锦鸡儿和秦晋锦鸡儿较低,短脚锦鸡儿最低。此结果与Nei′s基因多样度和Shannon信息指数的遗传多样性分析结果一致。根据非加全算术平均聚类法以及ISSR特征图谱可以将不同种区分开来。结论ISSR分子标记可很好地用于锦鸡儿物种的分子鉴定和遗传背景研究,其结果为制定有效的保护策略和措施提供了科学依据。