骨髓基质干细胞移植对脑梗死大鼠生长相关蛋白43表达的影响

背景:目前生长相关蛋白43作为构建中枢神经系统可塑性的基本物质,是研究神经生长及损伤修复的首选分子标记物.目的:通过建立大鼠局灶性脑缺血模型,观察骨髓基质干细胞移植内源性轴突再生标志物生长相关蛋白43的表达变化.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-03/2007-10在武汉大学人民医院神经科实验室和丝宝药业有限公司博士后科研工作站完成.材料:选取清洁级成年SD大鼠60只,按随机数字表法分为模型对照组、假手术组和干细胞移植组,每组20只.方法:另取2月龄SD大鼠4只用于制备骨髓基质干细胞,骨髓基质干细胞悬液用5-溴脱氧尿嘧啶核苷法标记.假手术组大鼠麻醉后分离结扎右侧颈内总动脉;其余大鼠制备右侧大脑中动脉缺血模型,造模后24 h向干细胞移植组大鼠左侧侧脑室推注20 μL5×105的骨髓基质干细胞,模型对照组推注等量磷酸盐缓冲液.主要观察指标:每组大鼠于移植前、移植后7,14,21,28 d应用免疫组织化学法检测脑梗死灶周边区生长相关蛋白43的表达和移植细胞的存活及迁移情况,并记录神经功能缺损评分.结果:培养的骨髓基质干细胞经5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记后移植到大鼠左侧侧脑室,可迁移到梗死灶周围,移植后7 d在梗死灶能检测到5溴脱氧尿嘧啶核苷标记的阳性细胞,移植后14 d增多达高峰,移植后28 d逐渐减少并消失.免疫组织化学图像分析结果显示干细胞移植组大鼠在移植后7,14 d脑梗死灶周边区生长相关蛋白43免疫活性高于模型对照组(P<0.05).假手术组大鼠无神经损伤症状,神经功能评分均为0分;随时间的推移,模型对照组和干细胞移植组动物的神经功能评分逐渐降低,从移植后14 d开始,干细胞移植组的神经功能评分均明显低于模型对照组(P<0.05).结论:骨髓基质干细胞移植能上调局灶性脑缺血大鼠脑梗死灶周边区生长相关蛋白43的表达,与大鼠神经功能的恢复趋势相符.     

骨髓间充质干细胞移植对永久性大脑中动脉阻塞大鼠生长相关蛋白43及脑梗死体积的影响

背景:大量实验表明骨髓间充质干细胞植入缺缸大鼠脑内能够通过血脑屏障在脑中成活并迁移,可部分转变为神经元,并能促进多种神经营养因子分泌,明显改善神经功能缺损,较神经保护剂具有更长的治疗时间窗.目的:观察骨髓间充质干细胞移植对大鼠永久性大脑中动脉阻塞后内源性轴突再生标志物生长相关蛋白43的表达及脑梗死体积的影响.方法:将成年SD大鼠按随机数字表法分为模犁对照组、假手术组、干细胞移植组.另取成年SD大鼠4只制备骨髓间充质干细胞,并以5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记.假手术组分离结扎右侧颈总动脉:其余大鼠制备永久性右侧大脑中动脉缺血模型,造模后,干细胞移植组移植骨髓间充质干细胞,模型对照组推注等量磷酸盐缓冲液.于移植前、移植后7,14,21,28d进行神经功能缺损评分,应用免疫组织化学法检测脑梗死灶周边区生长相关蛋白43表达.结果与结论:干细胞移植组移植后7d在梗死灶能检测到5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的阳性细胞,移植后14 d增多达高峰,移植后28 d逐渐减少并消失;移植后7,14 d脑梗死灶周边区生长相关蛋白43免疫活性显著高于模型对照组(P<0.05).假手术组大鼠无神经损伤症状,神经功能评分均为0分;随时间推移,模犁对照组和干细胞移植组神经功能评分逐渐降低,从移植后14 d开始,干细胞移植组神经功能评分明显低于模型对照组(P<0.05).与模型对照组相比,干细胞移植组脑梗死体积均显著减小(P<0.05).结果显示,骨髓间充质干细胞移植能上调局灶性脑缺血大鼠脑梗死灶周边区生长相关蛋白43的表达,并显著减小脑梗死体积.     

脑室移植骨髓基质细胞对脑缺血损伤后神经功能恢复的影响

目的:采用脑室系统注入体外培养的骨髓基质细胞,观察其对神经功能损伤修复的影响及其在脑内的存活、迁移、分化情况。方法:实验于2004-03/12在中国医科大学神经内科实验室完成。①将28只Wistar大鼠随机分为假手术组(n=6),模型组(n=8),梗死半球移植组(n=7),健侧半球移植组(n=7)。②除假手术组外,其他3组大鼠采取longa法制备大脑中动脉梗死模型,梗死后次日将培养的骨髓基质细胞悬液(10μL,约1×105个细胞)注入梗死半球移植组和健侧半球移植组大鼠侧脑室,模型组注入等量的磷酸盐缓冲液。③通过神经功能评分观察大鼠脑神经功能恢复情况,采用免疫组织化学方法观察移植入脑的骨髓基质细胞的存活、迁移及分化情况。结果:28只大鼠全部进入结果分析。①神经功能缺损评价:假手术组动物无神经功能缺损。移植前各组梗死后大鼠神经功能损害评分差异无显著性(P>0.05),移植2周后梗死大鼠神经功能均有不同程度恢复,但梗死半球移植组、健侧半球移植组评分明显低于模型组(6.71±0.49,6.86±0.38,8.63±0.52,P<0.05)。②大鼠脑病理改变:苏木精-伊红染色显示大脑中动脉梗死大鼠的缺血区脑组织稀疏,细胞数量明显减少且间隙增大。假手术组则无此表现,表明大鼠脑梗死模型制作成功。③脑组织切片免疫组织化学染色结果:可见来源于骨髓基质细胞的细胞(5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞经免疫组织化学染色呈暗棕色)在脑组织内存活,并且聚集于缺血梗死区域。在梗死半球移植组对侧半球脑组织内未发现5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞;在健侧半球移植组仅在移植损伤道周围发现少量5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞。应用免疫双标染色随机选取10个5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞区域计数发现大鼠脑梗死后14d约1.2%的5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞同时表达神经元标志蛋白特异性烯醇化酶,约6%的5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞同时表达神经胶质细胞标志蛋白神经胶质纤维酸性蛋白。结论:经脑室移植的骨髓基质细胞对梗死后大鼠神经功能的恢复有明显促进作用。不同脑脊液途径移植的骨髓基质细胞对神经功能缺损的修复无明显差异。经脑室系统途径移植的骨髓基质细胞可在脑组织内存活,血管下间隙为骨髓基质细胞在脑组织内迁移提供途径。脑损伤是骨髓基质细胞迁移、分化的主要原因。     

脑室移植骨髓基质细胞对脑缺血损伤后神经功能恢复的影响

目的：采用脑室系统注入体外培养的骨髓基质细胞，观察其对神经功能损伤修复的影响及其在脑内的存活、迁移、分化情况。 方法：实验于2004-03／12在中国医科大学神经内科实验室完成。①将28只Wistar大鼠随机分为假手术组（n=6），模型组（n=8），梗死半球移植组（n=7），健侧半球移植组（n=7）。②除假手术组外，其他3组大鼠采取longa法制备大脑中动脉梗死模型，梗死后次日将培养的骨髓基质细胞悬液（10μL，约1&;#215;10^5个细胞）注入梗死半球移植组和健侧半球移植组大鼠侧脑室，模型组注入等量的磷酸盐缓冲液。③通过神经功能评分观察大鼠脑神经功能恢复情况，采用免疫组织化学方法观察移植入脑的骨髓基质细胞的存活、迁移及分化情况。 结果：28只大鼠全部进入结果分析。①神经功能缺损评价：假手术组动物无神经功能缺损。移植前各组梗死后大鼠神经功能损害评分差异无显著性（P〉0．05），移植2周后梗死大鼠神经功能均有不同程度恢复，但梗死半球移植组、健侧半球移植组评分明显低于模型组（6．7l&;#177;0．49，6．86&;#177;0．38，8．63&;#177;0．52，P〈0．05）。②大鼠脑病理改变：苏木精-伊红染色显示大脑中动脉梗死大鼠的缺血区脑组织稀疏，细胞数量明显减少且间隙增大。假手术组则无此表现，表明大鼠脑梗死模型制作成功。③脑组织切片免疫组织化学染色结果：可见来源于骨髓基质细胞的细胞（5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞经免疫组织化学染色呈暗棕色）在脑组织内存活，并且聚集于缺血梗死区域。在梗死半球移植组对侧半球脑组织内未发现5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞；在健侧半球移植组仅在移植损伤道周围发现少量5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞。应用免疫双标染色随机选取10个5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞区域计数发现大鼠脑梗死后14d约1．2％的5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞同时表达神经元标志蛋白特异性烯醇化酶，约6％的5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞同时表达神经胶质细胞标志蛋白神经胶质纤维酸性蛋白。 结论：经脑室移植的骨髓基质细胞对梗死后大鼠神经功能的恢复有明显促进作用。不同脑脊液途径移植的骨髓基质细胞对神经功能缺损的修复无明显差异。经脑室系统途径移植的骨髓基质细胞可在脑组织内存活，血管下间隙为骨髓基质细胞在脑组织内迁移提供途径。脑损伤是骨髓基质细胞迁移、分化的主要原因。     

骨髓间充质干细胞移植促进脑缺血性损伤大鼠神经细胞黏附分子的表达

背景:骨髓间充质干细胞移植能促进神经功能修复,其作用机制可能与上调神经细胞黏附分子有关。目的:观察骨髓间充质干细胞移植对急性脑缺血损伤大鼠神经细胞黏附分子表达的影响。方法:将SD大鼠按随机数字表法分为假手术组和模型组。模型组大鼠采用线栓法制作大脑中动脉阻塞模型,再随机分为细胞移植组(左侧侧脑室移植同种异体骨髓间充质干细胞5×105)和对照组(移植磷酸盐缓冲液)。假手术组不闭塞大脑中动脉也不移植。结果与结论:移植后7,14d,细胞移植组与对照组梗死灶周围神经细胞黏附分子表达高于假手术组(P<0.01),且细胞移植组高于对照组(P<0.05)。移植后14d,细胞移植组神经功能缺损评分明显低于对照组(P<0.05)。说明骨髓间充质干细胞移植后通过上调局灶性脑缺血大鼠脑梗死灶周神经细胞黏附分子表达促进神经功能的恢复。     

骨髓间充质干细胞移植及生长相关蛋白43表达在脑修复中的作用

背景: 研究证实骨髓间充质干细胞移植能够促进脑功能恢复,并对大鼠脑皮质及海马结构损伤具有修复作用,可能与细胞的自身代偿以及神经生长递质的参与有关,也可能是由于神经应激性损伤刺激靶组织细胞分泌各种神经因子的表达有关.目的: 从细胞生物学的角度,观察大鼠脑缺血损伤后骨髓间充质干细胞移植对神经再生及脑的修复作用.方法: 参考改良Nagasawa法建立大脑中动脉闭塞再灌注模型后,实施骨髓间充质干细胞移植,并分别进行跑台运动训练和水迷宫康复训练,进行神经功能评分及学习记忆评分.采用TUNEL法检测脑皮质区及海马区凋亡神经元的表达以及免疫组化技术检测生长相关蛋白43蛋白在两区的表达变化.结果与结论: 移植组16 h移植骨髓间充质干细胞在皮质区及海5 CA1区表达明显增加;7 d细胞表达达高峰,分化细胞明显增加.移植后运动训练7,19,21 d移植组mNSS评分低于模型组(P均<0.01);移植组大鼠水迷宫试验平台潜伏期的时间较模型组明显缩短(P<0.05);移植组大鼠穿越平台次数较模型组增多(P<0.05);缺血再灌注24 h凋亡细胞达高峰,3 d梗死体积测量为最大值;再灌注19 d生长相关蛋白43达高峰.提示大鼠脑缺血损伤介导了神经功能缺损,骨髓间充质干细胞移植促进了神经再生,生长相关蛋白43表达上调抑制神经元凋亡,进一步促进了脑梗死灶的修复.     

高压氧联合骨髓间充质干细胞移植修复缺氧缺血性脑损伤

背景:单纯骨髓间充质干细胞移植对脑梗死组织的修复作用并不理想,需要结合药物及生物工程材料等手段进行综合治疗。目的:验证高压氧结合骨髓间充质干细胞移植修复大鼠缺氧缺血性脑损伤的效果。方法:体外培养大鼠骨髓间充质干细胞。应用线栓法建立大脑中动脉阻塞大鼠模型,按随机区组法分为3组,即对照组、骨髓间充质干细胞移植组及高压氧+骨髓间充质干细胞移植组。静脉移植后24h,3d及伤后1,2周行Longa行为学评分,检测神经功能的损伤情况。移植2周后,应用RT-PCR法测定生长相关蛋白43mRNA的表达,并以BrdU免疫组化和苏木精-伊红染色行梗死处组织学检查以证实恢复程度。结果与结论:移植后1周,高压氧+骨髓间充质干细胞移植组大鼠神经功能障碍评分低于骨髓间充质干细胞移植组,骨髓间充质干细胞移植组低于对照组(P<0.05)。2周后脑梗死周围组织生长相关蛋白43mRNA的表达高压氧+骨髓间充质干细胞移植组高于骨髓间充质干细胞移植组,骨髓间充质干细胞移植组高于对照组(P<0.05)。BrdU免疫组化和苏木精-伊红切片中的神经元数量高压氧+骨髓间充质干细胞移植组多于骨髓间充质干细胞移植组,骨髓间充质干细胞移植组多于对照组(P<0.05)。提示高压氧联合骨髓间充质干细胞静脉移植治疗大鼠缺氧缺血性脑损伤可明显改善大鼠的神经功能,效果优于单纯骨髓间充质干细胞移植。     

自体骨髓干细胞动员移植与手术移植治疗脊髓损伤的比较

背景:研究表明,骨髓干细胞可在损伤脊髓中存活、向损伤部位迁移并向神经元和星形胶质细胞分化,促进损伤脊髓功能的恢复,是治疗脊髓损伤的一条有效途径.自体骨髓干细胞动员移植与手术移植治疗脊髓损伤均具有更广阔的临床应用前景,但两者的疗效与治疗机制是否存在区别还不清楚.目的:比较自体骨髓干细胞动员移植与手术移植治疗脊髓损伤的效果,并以定性定量化指标评价.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-06/2008-04在河南省人民医院完成.材料:10周龄SD大鼠90只,雌雄各半,体质量(240±10)g,用于制备脊髓损伤模型.方法:动物造模前注射5-溴2-脱氧尿嘧啶核苷50 mg/(kg·d)×3 d后抽取自体骨髓,体外分离自体骨髓干细胞;NYU Imlpactor制作脊髓损伤模型.90只模型大鼠按随机数字表法分为3组,每组30只.动员移植组:应用重组粒细胞刺激因子皮下注射,20 mg/(kg·d)×7 d:手术移植组为损伤局部移植0.3 mL(1×10~(10)L~(-1))骨髓间充质干细胞;对照组:脊髓损伤后给予相同体积(0.3 mL)的生理盐水.各组均从术前3 d开始,连续10 d腹腔注射5-溴2-脱氧尿嘧啶核苷50 mg/(kg·d).主要观察指标:采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分检测伤后3 d,1,2,4,8周大鼠后肢的运动功能;伤后1,2,4.8周通过体感诱发电位和运动诱发电位检测脊髓上、下行神经传导通路,判断脊髓损伤和恢复程度;病理和免疫组织化学观察脊髓损伤组织细胞结构变化及5-溴2-脱氧尿嘧啶核苷、胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶分布表达.结果:①脊髓损伤后1,2,4,8周动员移植组和手术移植组BBB评分均较对照组升高(P＜0.01);动员移植组和手术移植组相比,差异均无显著性意义(P＞0.05).②脊髓损伤1,2,4,8周后,与对照组相比,动员移植组和手术移植组体感诱发电位和运动诱发电位潜伏期均降低(P＜0.05～0.01),波幅均增高(P＜0.05～0.01);动员移植组和手术移植组各时间点相比,差异均无显著性意义(P＞0.05).③组织病理学显示动员移植组和手术移植组较对照组有更少的空洞、坏死及胶质纤维酸性蛋白瘢痕组织,较多的5-溴2-脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞和特异性烯醇化酶阳性细胞.结论:自体骨髓干细胞动员移植和手术移植两种方法均能明显减轻脊髓损伤的程度,促进损伤后脊髓功能的恢复,两者对比,前者更为方便、无创,实用性强.     

脐血间充质干细胞移植对脑梗死大鼠脑内NGF、BDNF表达的影响

目的观察脐血间充质干细胞（UCBMSCs）对脑梗死大鼠脑内NGF、BDNF表达及神经功能的影响。方法实验分假手术组、对照组、移植组,采用颈内动脉线栓法制作脑梗死大鼠模型,移植组于成模后1d、4d经尾静脉移植2×10^6UCBMSCs,假手术组和对照组尾静脉注射等量PBS,移植后7d、14d进行神经功能评分,3d、7d、14d免疫组织化学法分别计数梗死灶周边区域NGF、BDNF表达阳性细胞数。结果移植后3d对照组、移植组脑内NGF、BDNF表达阳性细胞数明显高于假手术组,移植组明显高于对照组,7d、14d逐渐下降,14d时两组比较元明显差别,大鼠神经功能较对照组改善不明显。结论脑梗死后早期移植UcBMSCs促进脑内神经营养因子的表达,但神经功能修复作用有限。     

高压氧联合骨髓间充质干细胞移植修复缺氧缺血性脑损伤

背景：单纯骨髓间充质干细胞移植对脑梗死组织的修复作用并不理想,需要结合药物及生物工程材料等手段进行综合治疗。目的：验证高压氧结合骨髓间充质干细胞移植修复大鼠缺氧缺血性脑损伤的效果。方法：体外培养大鼠骨髓间充质干细胞。应用线栓法建立大脑中动脉阻塞大鼠模型,按随机区组法分为3组,即对照组、骨髓间充质干细胞移植组及高压氧＋骨髓间充质干细胞移植组。静脉移植后24h,3d及伤后1,2周行Longa行为学评分,检测神经功能的损伤情况。移植2周后,应用RT-PCR法测定生长相关蛋白43mRNA的表达,并以BrdU免疫组化和苏木精-伊红染色行梗死处组织学检查以证实恢复程度。结果与结论：移植后1周,高压氧＋骨髓间充质干细胞移植组大鼠神经功能障碍评分低于骨髓间充质干细胞移植组,骨髓间充质干细胞移植组低于对照组（P〈0.05）。2周后脑梗死周围组织生长相关蛋白43mRNA的表达高压氧＋骨髓间充质干细胞移植组高于骨髓间充质干细胞移植组,骨髓间充质干细胞移植组高于对照组（P〈0.05）。BrdU免疫组化和苏木精-伊红切片中的神经元数量高压氧＋骨髓间充质干细胞移植组多于骨髓间充质干细胞移植组,骨髓间充质干细胞移植组多于对照组（P〈0.05）。提示高压氧联合骨髓间充质干细胞静脉移植治疗大鼠缺氧缺血性脑损伤可明显改善大鼠的神经功能,效果优于单纯骨髓间充质干细胞移植。