人白介素17基因的分离及其在大肠杆菌中的表达

用ＲＴ－ＰＣＲ方法从活化的人外周淋巴细胞中分离了人白１７基因，序列分析结果表明与文献报道的完全相符，以质粒ｐＢＶ２２０为表达载体，在大肠杆菌中高效表达了ｈＩＬ－１７基因，重组蛋白以包涵体的形式存在，约占菌体总蛋白的量４０％。     

TRAP蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的：研究金黄色葡萄球菌(金葡菌)毒素的调控机制，构建pET—trap表达载体，在大肠杆菌中表达金葡菌毒素调控的重要分子TRAP蛋白。方法：从金葡菌中提取基因组DNA，用特异引物钓取trap基因。通过亚克隆的方法构建了pET—trap表达载体，在大肠杆菌中诱导表达，经亲和柱层析分离纯化。制备纯化蛋白的多抗血清，利用Western印迹检测多抗与天然蛋白的反应。结果：目的基因在大肠杆菌中获得高表达，超声破碎后，表达产物主要存在于上清中，制备的多抗血清可以与天然蛋白发生特异性反应。结论：通过原核表达获得了天然的TRAP蛋白，为研究金葡菌毒素调控机制及防治金葡菌感染奠定了基础。     

肠毒素大肠杆菌定居因子CS6抗原基因在大肠杆菌中的高效表达

目的：构建表达肠毒素大肠杆菌(ETEC)定居因子CS6的重组质粒，并在大肠杆菌DH5d中高效表达。方法：利用基因工程的方法，将含有cS6基因的质粒pMG233用限制性内切酶Cla Ⅰ酶切，得到长约3．1kb的CS6片段(含有cS6结构基因及调控基因的DNA片段)；并与用限制性内切酶Cla Ⅰ酶切的表达载体质粒pBV321连接．得到含有CS6片段的重组质粒pMG235，转化至大肠杆菌DH5a。结果：SDS-PAGE、Western印迹及免疫荧光观察的结果表明，重组菌DH5a／pMG235可高效表达相对分子质量为14600的CS6抗原蛋白，并在重组菌表面表达，表达产物可被抗CS6多克隆抗体识别。结论：重组菌可稳定表达肠毒素大肠杆菌定居因子抗原CS6。     

人白细胞介素15基因的分离及其在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：分离编码人ｈＩＬ－１５的ｃＤＮＡ并大肠杆菌中克隆与表达，方法：采用ＰＨＡ刺激人外周血白细胞提取ｍＲＮＡ，并利用ＲＴ－ＰＣＲ方法获得ｈＩＬ－１５的ｃＤＮＡ将其定向插入ＰＵＣ１９载体中，ＤＮＡ序列分析表明分离的ｈＩＬ－１５的序列与文献报道一致，以ｐＢＶ２２０为表达载体构建并筛选出重组于ｐＢＶｈＩＬ－１５；重组子转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α菌株，经４２℃诱导表达。结果：相对分子质量为１４０００的ｈＩＬ     

外源基因在大肠杆菌中的表达

随着生物技术的迅猛发展,采用基因工程方法大量制备一些有用蛋白质,特别是医用蛋白质药物已成为可能.目前,表达系统可分为原核表达系统和真核表达系统.原核表达系统主要是指大肠杆菌表达体系,其它尚有枯草杆菌体系等;真核表达系统包括酵母细胞表达体系、杆状病毒-昆虫细胞表达体系和哺乳动物细胞表达体系.各种表达体系都     

人TNF—α及其突变体在大肠杆菌中的高效表达

利用重组ＤＮＡ技术，将不含非编码区和信号肽编码区的肿瘤坏死因子－αｃＤＮＡ插入原核表达载体ｐＢＶ２２０，并在大肠杆菌中进行表达。竽组产物具有匀伤鼠Ｌ９２９细胞的细胞毒活性，且均在可溶性ＴＮＦ，表达量占菌体总蛋白６０％左右。     

抗乙肝病毒表面抗原单链抗体在大肠杆菌中的高效表达

在本室构建的抗乙肝病毒表面抗原单链抗体表达载体pHBSCS的基础上,通过PCR将单链抗体基因重组到原核细胞表达载体pT7中,构建了单链抗体高效表达载体pT7SC.将pT7SC质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,获得ScFv的高效表达,经SDS-PAGE检测,表达产物占菌体总蛋白的28%以上.对IPTG诱导后的细菌培养上清进行竞争抑制性ELISA检测,证明所表达的ScFv具有抗体活性.     

内毒素结合肽表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

应用PCR技术,从含人NH@LBP cDNA的质粒中扩增出93bp的内毒素结合肽(endotoxin binding peptide,EBP)基因片段,插入原核融合蛋白表达质粒Pinpoint Xa3的多克隆位点构建成表达质粒,转化大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性重组子Pinpoint Xa3-EBP并进行酶切鉴定及序列分析.异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,经SDS-PAGE及Westen blot鉴定得到分子量约为16.5kD的生物素化EBP融合蛋白,为进一步研究其内毒素拮抗效应打下良好基础,并为内毒素结合肽的研究提供了一条新的途径.     

登革2型病毒包膜蛋白B区在大肠杆菌中的高效表达

目的：在大肠杆菌中对登革2型病毒包膜蛋白B区进行表达，为观察其抗原性和免疫原性奠定基础。方法：将通过PCR扩增的登革2型病毒包膜蛋白B区插入高效原核表达栽体pBAD／Topo ThioFusion，然后在大肠杆菌中利用阿拉伯糖进行诱导表达。时表达产物以免疲印迹和ELISA法进行检测。结果和结论：登革2型病毒包膜蛋白B区在大肠杆菌中的表达产物以可溶性形式存在，表达量约占细菌可溶性总蛋白的62％。表达产物可与登革2型病毒的特异多抗反应，但与登革1、3和4型病毒的特异多抗无交叉反应。登革2型病毒包膜蛋白B区可在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达。     

胶质细胞源性神经营养因子基因的克隆及其在大肠杆菌中 …

目的;分离胶质细胞源性神经营养因子（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ,ＧＤＮＦ）基因,并在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得表达。方法：从人多形性成胶质细胞瘤细胞株ＢＴ３２５中提取总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术分离ＧＤＮＦ基因,构建表达载体ｐＢＶ－ＧＤＮＦ,转化大肠杆菌,温控诱导ＧＤＮＦ的表达。结果与结论;分离得到的人ＧＤＮＦ基因,在大肠杆菌中得到高效表达,表     

胶质细胞源性神经营养因子基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的：分离胶质细胞源性神经营养因子（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ,ＧＤＮＦ）基因,并在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得表达。方法：从人多形性成胶质细胞瘤细胞株ＢＴ３２５ 中提取总ＲＮＡ ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术分离ＧＤＮＦ基因,构建表达载体ｐＢＶ－ＧＤＮＦ,转化大肠杆菌,温控诱导ＧＤＮＦ的表达。结果与结论：分离得到的人ＧＤＮＦ基因,在大肠杆菌中得到高效表达,表达产物占全菌总蛋白的２４．７％ ,初步纯化后纯度达９０％ 以上。     

白介素-15突变体在大肠杆菌中的克隆表达及鉴定

目的 :构建两株IL 15末端缺失突变体以研究其N、C端对其功能的影响。方法 :以pBV2 2 0为载体 ,在大肠杆菌中进行表达。表达产物以包涵体形式存在 ,经过SDS PAGE纯化 ,复性 ,以CTLL 2增殖实验检测野生型及突变体的生物活性。结果 :N端缺失突变体失去了增殖活性 ,而C端缺失突变体保持了对CTLL 2的生长刺激活性     

Mda7/IL-24基因的克隆及其融合蛋白在E.coli中的表达

目的 :克隆人黑素瘤分化相关基因 (melanomadifferentiationassociatedgene ,mda 7/IL 2 4 ) ,并在大肠杆菌中表达。方法 :从PHA刺激培养的人外周血淋巴细胞提取总RNA ,根据mda 7/IL 2 4基因序列设计引物 ,用PCR法扩增mda 7/IL 2 4基因。将mda 7/IL 2 4基因插入表达载体pET 2 8a(+)中 ,构建表达载体pET 2 8a mda 7/IL 2 4 ,用IPTG诱导目的蛋白在E .coli中表达。通过Western印迹分析对表达产物进行鉴定。结果 :经RT PCR从人外周血分离的淋巴细胞中扩增到mda 7/IL 2 4cDNA ,序列分析与文献报道一致 ;SDS PAGE分析表明 ,经 0 .5mmol/LIPTG 37℃诱导 4h后在E .coli中有大量mda 7/IL 2 4融合蛋白表达 ,相对分子质量约为 2 8× 10 3 ,融合蛋白约占诱导菌总蛋白的30 % ;Western印迹分析提示 ,诱导表达产物能与His单抗发生特异性反应。结论 :从人外周血淋巴细胞中获得了mda 7/IL 2 4的全长cDNA ,融合蛋白在E .coli中获得高效表达。     

人NR1靶片段的原核表达

目的 :克隆人N_甲基_D_门冬氨酸受体 (NMDAR ,NR)靶片段cDNA ,构建其原核表达载体并建立相应的表达体系。方法 :用常规RT_PCR法从脑肿瘤切除组织中克隆人NR1靶片段cDNA ,测序鉴定后构建其原核表达载体 ,并在大肠杆菌DH5α中升温诱导表达 ,表达产物通过SDS_PAGE分析及免疫印迹分析进行鉴定。结果 :成功克隆了人NR1靶片段 4 89bp长cDNA ,测序结果与文献报道一致 ,原核表达载体在宿主菌中诱导表达后得到了NR1蛋白靶片段的高效表达产物 ,占全菌体 15 %～ 30 %。SDS_PAGE及免疫印迹分析与预计相同。结论 :人NR1靶片段可通过改构设计在原核体系中获得高效表达     

人CD81胞外大环在大肠杆菌中的克隆表达及活性研究

目的：构建人CD81分子胞外大环（ED2）的原核表达质粒,并研究胞外大环同HCV E2蛋白的结合性能。方法：从人外周血淋巴细胞中经RT－PCR克隆出CD81胸外大环序列,插入原核表达载体pBVILl中,构建表达质粒pBVILl-EC2并在大肠杆菌中表达。表达产物经纯化后用间接ELISA法测定同E2蛋白的结合能力。结果：经序列测定证明,CD81分子胞外大环正确插入载体。融合蛋白得到高效表达,以包涵体形式存在,经Q－Sepharose FF阴离子交换柱得到有效纯化。初步结果表明,重组CD81胞外大环能同原核表达的截短的HCV E2（384－661）蛋白结合。结论：本研究为进一步研究CD81同E2及HCV的相互作用和制备抗EC2单克隆抗体奠定了基础。     

重组人角质细胞生长因子-2基因的克隆和表达

目的：克隆人KGF-2基因，并在大肠杆菌中进行表达。方法：通过PCR扩增，从人胎肝cDNA文库中获得编码人KGF-2的cDNA，并将其分别克隆入pBV220，pLEX和pGEX4T-1质粒中，研究其在不同表达质粒和大肠杆菌中的表达情况。结果：克隆得到的KGF-2cDNA经测序证明与文献报道的序列一致。将其克隆于pBV220质粒中，在E．coli JM109中表达量相对最高，约占茵体总蛋白的4％；克隆于pLEX质粒中，在E．coli G1724中的表达量约占全茵总蛋白的5％；克隆于pGEX4T-1中，在E．coli JM109中的表达量可占到全茵总蛋白的20％。结论：采用GST融合蛋白表达质粒pGEX4T-1对KGF-2进行表达，较pBV220和pLEX具有明显优势，能实现对KGF-2的高效表达，为进一步的功能研究奠定了基础。     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA在大肠杆菌中的表达研究

将去除信号肽编码序列的组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）结构基因片段插入载体ｐＢＶ２２０的ＥｃｏＲＩ位点。目的基因受λＰ＿ＬＰ＿Ｒ启动子调控，通过温度调节诱导，ｔ－ＰＡ基因获得表达。电镜观察可见表达产物以包含体形式存在；表达量占非溶性菌体总蛋白的５％－８％。包含体产物经溶解及复性处理，可恢复活性；用溶纤维琼脂糖平板法、中和试验等方法证明了复性产物具有特异的ｔ－ＰＡ溶纤活性．     

新型低抗原性葡激酶的构建、表达及功能分析

目的:降低野生型葡激酶(wild-type staphylokinase,wt-SAK)的抗原性,获得新型溶栓剂.方法:利用生物信息学分析野生型SAK抗原表位,将其分子内主要的抗原决定簇编码序列定点突变为丙氨酸密码子,将其N端抗原性较强的前10位氨基酸缺失.经过筛选从系列突变体中得到突变体NSAKV.结果:生物信息学分析突变后分子抗原性,结果表明其主要抗原表位消失.该突变体(NSAKV)与原核表达载体pET17b重组后,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导获得高效表达,NSAKV占全菌总蛋白的40%～50%,以可溶性形式存在.经进一步纯化,纯度达98%以上,分子量与理论值相符.比活性2.616×104 AU/mg.经ELISA法和溶圈法测定,NSAKV与wt-SAK制备的免抗wt-SAK抗血清的免疫反应性显著降低,经抗血清温育后wt-SAK活性下降程度远高于NSAKV.结论:突变体(NSAKV)保持了野生型SAK的活性,同时抗原性下降.