蛇毒cystatin基因合成及其在大肠杆菌的表达

目的　研究蛇毒 cystatin基因的合成并在大肠杆菌系统内表达。　方法　根据中华眼镜蛇毒 cystatin蛋白的氨基酸序列合成 cystatin基因的 4个片段 ,通过缓慢退火 PCR方法将其拼接为完整的 cystatin基因 ,经Bam H 及 Sac 双酶切后定向克隆到原核表达载体 p ET- 4 2 a(+)中 ,PCR及测序鉴定 ,转化宿主菌 BL 2 1 (DE3) ,异丙基硫代 -β- D半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,SDS- PAGE凝胶电泳分析表达产物 ,GST· Mag琼脂糖树脂纯化融合蛋白 ,Western- blot鉴定。　结果　成功合成蛇毒 cystatin基因 ,并构建原核表达质粒 p ET- 4 2 a(+) /GST- cystatin,在大肠杆菌 BL 2 1 (DE3)中表达融合蛋白 GST- cystatin,SDS- PAGE凝胶浓度扫描显示表达量占菌体总蛋白的 30 % ,Western- blot证实纯化蛋白为重组 cystatin蛋白。　结论　合成蛇毒 cystatin基因并在大肠杆菌中表达 ,为进一步研究其生物学活性及抗肿瘤转移功能奠定基础     

蛇毒cystatin基因真核表达质粒的构建与表达

目的 构建蛇毒cystatin真核表达载体pcDNA3.1/His-cystatin,对其在COS7细胞中的表达进行初步研究.方法 采用PCR法扩增蛇毒cystatin基因片段,插入pcDNA3.1/His C载体中,测定DNA序列后,转染COS7细胞,利用Western-blot检测COS7细胞中cystatin基因的表达.结果 经酶切、测序鉴定证实插入片断已正确,Western-blot检测表明融合蛋白能够在COS7细胞中表达.结论 构建的真核表达载体peDNA3.1/His-cystatin能够在COS7细胞中表达蛇毒cystatin融合蛋白.     

人脂联素球状结构域基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

目的 利用杆状病毒表达系统表达人脂联素球状结构域(gAd)基因.方法 以人基因组为模板,PCR法扩增人gAd基因,将gAd基因与供体质粒pFastBacHTB连接,转化含有穿梭载体:Bacmid的大肠杆菌DH10Bac.筛选转座成功的重组穿梭载体Bacmid-gAd,通过脂质体介导,转染昆虫细胞Sf9,经SDS-PAGE、免疫印迹法检测表达产物.结果 重组杆状病毒感染的Sf9细胞形态变化明显,SDS-PAGE电泳结果 显示,Bacmid-gAd组和对照组相比,在相对分子质量15 000～25 000之间多出一清晰的蛋白条带,免疫印迹法证实该条带能与相应的抗His标签抗体结合.结论 人gAd基因成功在真核细胞中表达,为后续的实验研究奠定了基础.     

OPCML基因在杆状病毒—昆虫细胞表达系统中的表达

目的：利用杆状病毒表达系统行OPCML基因在Sf9昆虫细胞中表达。方法：以OPCML-PWPI为模板,利用PCR方法扩增OPCML基因,将OPCML基因连接到PACGp67A质粒上,获得OPCML-PACGp67A质粒后,通过脂质体介导,转染Sf9细胞,使其表达重组杆状病毒,经Western-blot检测表达产物。结果：OPCML-PACGp67A质粒转染Sf9细胞后,在相对分子质量约37 000处有一条新生蛋白带经检测为OPCML蛋白。结论：OPCML基因成功在Sf9细胞中得到表达。     

神经营养素—4（NT—4）在昆虫杆状病毒表达系统中的克隆与表达

目的 通过昆虫杆状病毒表达系统的优势,表达出具有生物学活性的神经营养系－4（hNT－4）蛋白。方法 通过PCR方法获得hNT－4成熟肽的基因。将其连接到昆虫表达载体pAcgp67B上,在昆虫细胞Sf9中进行表达。对表达产物进行免疫原性和生物学活性测定。结果 获得hNT－4蛋白的表达产物,SDS－PAGE电泳显示表达产物相对分子质量为15000。经Western-blot验证,表达上清及细胞全蛋白均有一条能与抗人NT－4抗体发生特异性免疫反应的条带。经PC12细胞测定。表达上清中的rNT－4蛋白具有明确的生物学活性。结论 hNT－4在昆虫杆状病毒表达系统中的表达为今后进一步深入研究hNT－4的功能及其在临床中的应用提供了条件。     

抑癌基因P16INK4在sf9细胞中的表达和鉴定

目的利用杆状病毒表达系统在体外表达抑癌蛋白P16,为研究P16蛋白的结构与功能及其在肿瘤生物治疗中的应用奠定基础.方法①利用定向克隆的方法将P16全基因序列插入转移载体pSX-IVVI+X3的EcoRI、Sall位点上,经氨苄青霉素平板初筛、菌落原位杂交、PCR扩增酶切电泳鉴定后,分离含P16的重组转移载体一pSXIVVI+X3.16;②用昆虫杆状病毒TnNPV-SVI-G感染sf9细胞扩增病毒,用PEG法沉淀病毒、酚/氟仿抽提纯化病毒DNA;③CaCl2沉淀法使重组转移载体一pSXIVVI+X3-16和病毒TnNPV-SVI-G DNA共转染sf9细胞.通过多角体观察和PCR法鉴定重组病毒;④经空斑纯化法纯化重组病毒,重组病毒感染草地夜蛾细胞(sf9)使P16大量表达,经SDS-PAGE及Western Blot鉴定所表达的P16蛋白.结果①筛选出两株含P16全基因的重组转移载体-pSXIVVI+X3-16;②构建了含P16全基因序列的重组杆状病毒TnNPV-p16;③SDS-PAGE电泳显示重组病毒TnNPV-P16感染sf9细胞的培养上清及胞体裂解物和阳性对照Hela细胞裂解物在16kD左右均有蛋白条带,而阴性对照TnNPV-SVI-G感染的sf9细胞培养上清中无此蛋白条带,经免疫印迹染色证实此蛋白为抑癌蛋白P16.结论利用我国自己构建的昆杆状病毒表达系统成功了表达P16蛋白,分子量大小及特异性与国外报道相同.     

重组杆状病毒TnNPV-KAI1的构建及其在Sf细胞中的初步表达

目的：为了制备ＫＡＩ１抗体②，本研究利用杆状病毒表达载体系统在Ｓｆ细胞中初步表达了ＫＡＩ１基因②。方法：利用ＰＣＲ在ＫＡＩ１基因的５′端引入合适的克隆酶切位点ＥｃｏＲＩ，经共转染、空斑筛选等技术，构建重组杆状病毒ＴｎＮＰＶＫＡＩ１，通过ＳＤＳＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹，检测ＫＡＩ１基因在Ｓｆ细胞中的表达。结果：重组病毒ＴｎＮＰＶＫＡＩ１感染的细胞裂解液中有一条分子质量约３０ｋｕ的特异抗原反应带。结论：ＫＡＩ１在Ｓｆ细胞中得到表达，表达产物具有抗原特异性，为制备ＫＡＩ１抗体提供新途径。     

百日咳毒素亚基基因的克隆与表达及其重组亚基的免疫学特性

目的从百日咳包特杆菌ＣＳ株中克隆百日咳毒素（ＰＴ）及其各亚基的基因,并探讨在昆虫细胞中表达百日咳毒素亚基基因片段的可能性及表达产物的生物学特性。方法采用ＰＣＲ技术进行克隆,并通过限制性内切酶和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ进行分析鉴定。利用重组杆状病毒技术,在昆虫细胞Ｓｆ９中表达各亚基基因,并通过免疫荧光实验进行分析鉴定,通过ＥＬＩＳＡ实验进行重组蛋白的免疫学特性评价。结果获得百日咳毒素及其各亚基的基因,并在昆虫细胞中表达了重组亚基。经体外聚合后的各重组亚基混合物与抗天然完整ＰＴ免疫血清的反应性和诱生特异性抗ＰＴ抗体的能力都明显高于各重组亚基单体混合物,含有Ｓ１重组亚基混合物诱生特异性抗ＰＴ抗体水平又明显高于不含Ｓ１重组亚基混合物的水平。说明百日咳毒素亚基单体仅具有很弱的诱生特异性抗ＰＴ抗体的能力,且抗完整ＰＴ的抗血清对百日咳毒素亚基单体也缺乏很好的识别作用。结论百日咳毒素诱导产生特异性抗体的能力依赖于聚合体的空间构型,而且其主要抗原决定簇位于聚合体的Ｓ１亚基上。     

杆状病毒多基因表达系统介导的轮状病毒样颗粒表达与组装

目的 构建能同时表达轮状病毒vp2、vp6、vp7基因的重组家蚕杆状病毒,并在BmN细胞中进行初步表达.方法 利用MA104细胞繁殖人A组轮状病毒,RT-PCR扩增病毒结构蛋白vp2、vp6、vp7基因,连接至转移载体pFBDM和pUCDM中,同时引入含IE1启动子的绿色荧光蛋白基因利于检测感染和表达量,再分别通过Tn7及Cre-LoxP重组构建重组病毒.为方便检测基因的表达,在VP7的C-末端添加6-组氨酸(6-His)标签,可通过ELISA等方法快速检测目的 基因表达.结果 扩增获得了轮状病毒三个结构蛋白基因,构建了能高效组装轮状病毒样颗粒的重组表达载体,ELISA检测VP7得到了表达,在BmN细胞中观察到病毒样颗粒.结论 成功构建杆状病毒多基因的表达系统,为生产多哑基蛋白复合物,研究大分子结构提供借鉴.     

人VEGF基因杆状病毒表达载体的构建及生物学活性鉴定

目的构建含人血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因的杆状病毒表达载体,并对其表达产物的生物学活性进行测定。方法用HindⅢ对pcDNA3.1/VEGF进行酶切,回收575 bp的VEGF片段;pFast a载体用HindⅢ酶切回收,与VEGF片段连接。NcoI酶切鉴定方向,得到正向连接重组载体pFast/VEGF;将其转化DH10BAC感受态细胞,经卡那霉素、四环霉素、庆大霉素及蓝白斑筛选得到重组杆状病毒载体pBacmid-Fa-VEGF,PCR扩增鉴定得到单一VEGF条带。将该病毒载体转染sf9细胞,用噬斑筛选及SDS-PAGE和Western blot检测VEGF表达,并通过MTT法检测VEGF促内皮细胞生长活性。结果病毒液在稀释到10-7时出现噬斑,Western blot检测出现单一条带,MTT检测促内皮细胞生长率为19.44%。结论成功构建了含VEGF基因的杆状病毒表达载体,且表达产物具有显著的促内皮细胞生长作用。     

EBV-LMP1基因杆状病毒表达载体的构建及其在昆虫细胞中的表达

目的：构建EBV-LMP1基因的杆状病毒重组供体质粒，包装重组LMP1的杆状病毒，感染昆虫细胞进行表达。方法：先将已克隆的LMP1 cDNA与线性化的pFastBACHTb进行连接，使pFASTBACHTb-LMP1与DHl0BAC感受菌进行转座重组，利用抗性及蓝白斑筛选重组Bacmid／LMPl克隆，提取Bacmid／LMP1转染昆虫细胞Sf9包装杆状病毒，利用病毒感染Sf9细胞进行蛋白表达，通过免疫荧光、SDS-PAGE和Western-blot检测表达情况。结果:获得了重组LMP1的杆状病毒，细胞能表达出与LMP1单抗结合的蛋白，分子量为63kDa左右，细胞可直接分泌LMP1蛋白至上清。结论:LMPl能在昆虫细胞中获得良好表达，为研究肿瘤疫苗及LMPl在EBV致瘤分子机理中的作用奠定了基础。     

细粒棘球蚴95抗原在真核昆虫表达系统中表达、纯化及免疫原性初步分析

目的 采用真核昆虫表达系统表达细粒棘球蚴95(Eg95)抗原,探讨其免疫原性.方法 从GeneBank 获取Eg95基因序列(序列编号:EU595937.1),合成开放读码框(CDS)全长基因;利用杆状病毒表达系统Bac-to-Bac symtem在昆虫细胞中表达目的基因Eg95,亲和层析纯化,Western blot鉴定;对Balb/c小鼠分别免疫接种重组昆虫表达目的蛋白Eg95(简称eu rEg95)、原核重组表达Eg95(简称pro rEg95)、阴性对照PBS,制备免疫血清,间接法ELISA对各组特异性IgG抗体进行分析.结果 合成Eg95基因CDS全长471 bp,经测序与理论完全一致;Western blot证实目的蛋白通过重组杆状病毒在昆虫细胞内实现可溶性表达;ELISA结果表明:eu rEg95能够诱导产生原头蚴特异性IgG抗体,抗体水平高于pro rEg95组(P＜0.05).结论 利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达出具有良好免疫原性的Eg95抗原,为优化细粒棘球蚴疫苗奠定基础.     

庚型肝炎病毒NS3蛋白在杆状病毒载体中的表达及其抗原性研究

目的：利用Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ ＨＴ杆状病毒系统在Ｓｆ９昆虫细胞中表达庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）ＮＳ３蛋白,并对表达产物的免疫原性进行研究。方法：将ＨＧＶ ＮＳ３基因片段定向克隆至转座载体ｐＥａｓｔＢｓｃ ＨＴａ,转化ＤＨ１０Ｂａｃ感受态细胞,３７℃振荡培养４ｈ使发生转座,用抗生素平皿筛选重组ｂａｃｍｉｄ。脂质体介导转染Ｓｆ９昆虫细胞,待细胞形态明显改变后收获细胞和培养上清液,将上清液再次感染Ｓｆ９细     

蛇毒多肽和蝎毒多肽对小鼠肝癌移植瘤的抑制作用和Caspase-3表达的影响

目的:检测蛇毒多肽(卡迪,KD)和蝎毒多肽(polypeptide from Buthus martensii venom,PBMV)对肝癌移植瘤(H22)带瘤小鼠瘤重的抑制作用,并观察肿瘤细胞Caspase-3表达,初步探讨其作用机理.方法:昆明种系近交小白鼠,60只,复制肝癌移植瘤模型,随机分为6组:阴性对照组(生理盐水),阳性对照组(环磷酰胺0.010 mg/mL),KD 0.016、0.010 mg/mL组和PBMV 0.016、0.010 mg/mL组,分别注射KD、PBMV和阳性药物10 d后,分析统计带瘤小鼠的体重变化、脾指数和肿瘤生长抑制率;并采用免疫组织化学方法,观察治疗后Caspase-3表达的改变.结果:KD 0.016、0.010 mg/mL组和PBMV 0.016、0.010 mg/mL组的平均瘤重显著地减小,均具有明显的肿瘤生长抑制率,与阴性对照组相比有显著差异(P＜0.05),而与阳性对照组相比没有显著差别(P＞0.05).免疫组化显示:阴性对照组胞浆无着色或着色很浅;阳性对照组胞浆浅红棕色,着色胞浆分布较集中;两组待测组胞浆均显红棕色,分布面积广,而且随着用药浓度的增加而增多.结论:KD和PBMV对H22生长和增殖具有抑制作用,其抑制作用的机制可能是通过增强Caspase-3蛋白的表达而促使肿瘤细胞的凋亡.     

肝素酶反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建肝素酶（heparanase，Hpa）反义RNA真核表达载体。方法 提取胃癌组织总RNA，按照GenBank中检索出的Hpa基因cDNA序列，设计并合成反义Hpa基因片段的引物，进行RT-PCR，并将扩增产物克隆至DGEMT载体，PCR鉴定及测序证实后，双酶切pGEM-T-antiHpa重组体回收目的片段，再将其反向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3．1中，并对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析。结果 PCR扩增出的反义片段与预期长度相符。构建的Hpa反义RNA表达质粒pcDNA3．1-antiHpa，分别作PCR及双酶切（BamHⅠ和HindⅢ）鉴定，证实其中有目的片段完整插入，插入片段测序结果与反义Hpa序列设计完全一致。结论 成功构建了Hpa反义RNA真核表达载体pcDNA3．1-antiHpa，此结果为进一步研究Hpa蛋白分子的生物学功能和以Hpa为靶点的恶性肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。     

蛇胆中胆酸的分离与结构鉴定

从蛇胆中分得胆酸和牛磺胆酸,并做了化学性质和物理常数测试。实验采用胆盐和胆汁酸的薄层层析(TLC)、胆盐的柱层析、胆盐的碱水解、胆汁酸的反相分配柱层析等技术。胆酸的化学结构通过IR、MS、~1H-NMR 等物理测试证实。胆盐碱水解水相产物纸层析和 TLC表明与胆酸及其它胆汁酸结合的氨基酸为牛磺酸,蛇胆汁中胆酸的天然存在形式为牛磺胆酸。本文从分离和结构鉴定角度证实蛇胆汁的主要成分为牛磺胆酸。     

登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列pcDNA3.1载体的构建

目的：克隆登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,构建NS1基因部分序列的真核表达载体。方法：用PCR技术扩增登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,并定向克隆入pcDNA3.1（＋）的kpnⅠ、xhoⅠ位点,构建真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1,转化EcoliDH5a。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。电穿孔法将真核重组载体转染COS-7细胞,RT-PCR鉴定其表达情况。结果：阳性质粒经kpnⅠ及xhoⅠ双酶切及PCR获得了1个核苷酸长度为413 bp的基因,序列测定证实与NGC株NS1基因部分基因序列有99%同源,重组真核质粒转染COS-7细胞经RT-PCR鉴定证实有表达。结论：成功构建了含有登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列基因的真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1。     

利用杆状病毒表达载体系统表达重组乙型肝炎病毒核心蛋白

目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组乙型肝炎病毒核心蛋白。方法构建含有HBVC基因的杆状病毒转移载体pFastBac Dual—HBV core，转化大肠埃希菌DH10Bac进行转座，提取重组Bacmid DNA转染昆虫细胞Sf9，获得含有HBVC基因的重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染Sf9细胞进行乙型肝炎病毒核心蛋白表达，然后通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达情况。结果成功构建了含HBVC基因的重组杆状病毒，而且在昆虫细胞Sf9中表达了乙型肝炎病毒核心蛋白。结论利用Bac to Bac杆状病毒表达系统，成功地表达了乙型肝炎病毒核心蛋白，为进一步研究奠定了基础。