肝片吸虫组织蛋白酶L真核表达载体构建及重组蛋白活性分析

目的构建肝片吸虫组织蛋白酶L(CatL)的真核表达载体,研究重组蛋白的生物学活性。方法以构建好的重组质粒pET30a-FhCatL为模板,利用PCR技术扩增肝片吸虫组织蛋白酶L基因(catL),连接真核表达载体pEGFP-N1,构建重组质粒pEGFP-N1-CatL,转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光,Western blotting检测重组蛋白表达情况。结果重组质粒pEGFP-N1-CatL在HeLa细胞中获得了表达,Western blotting结果表明真核表达质粒表达的重组蛋白能与自然感染肝片吸虫的山羊阳性血清发生特异性反应。结论肝片吸虫CatL真核表达载体构建成功,真核表达产物可与自然感染的山羊阳性血清发生特异性反应,具有免疫反应性,可做为分子疫苗的候选和诊断抗原进行进一步的研究。     

华支睾吸虫ATP合酶b亚基的组织和亚细胞定位

目的 了解华支睾吸虫ATP合酶b亚基（CsATP-synt_B）的虫体组织定位,并以HeLa细胞为替代模型观察其亚细胞定位。 方法 用CsATP-synt_B重组蛋白免疫SD大鼠,取其抗血清对华支睾吸虫成虫石蜡切片进行间接免疫荧光染色,观察CsATP-synt_B蛋白在华支睾吸虫成虫组织中的分布。根据生物信息学预测的CsATP-synt_B线粒体转运序列（MTS序列）和核定位序列（NLS序列）位置,设计4组引物［CsATP-synt_B全长序列,以及3个缺失突变体（MTS-缺失线粒体转运序列、NLS-缺失核定位序列、MTS-NLS-线粒体-核定位双缺失）引物］,扩增出全长基因和3个突变体基因,构建重组质粒pEGFP-N1-CsATP-synt_B1-300、pEGFP-N1-CsATP-synt_B30-300、pEGFP-N1-CsATP-synt_B（1-238）+（257-300）及pEGFP-N1-CsATP-synt_B（30-238）+（257-300）。将这些重组质粒用阳离子脂质体转染HeLa细胞,48 h后用激光共聚焦显微镜观察CsATP-synt_B全长基因和3个突变体在HeLa细胞的表达和亚细胞定位。 结果 CsATP-synt_B蛋白在华支睾吸虫成虫中分布较为广泛,主要分布在腹吸盘、卵巢、卵黄腺和皮层。绿色荧光蛋白GFP表明CsATP-synt_B全长序列表达于线粒体或细胞核,线粒体转运序列缺失突变体表达于细胞核,核定位序列缺失突变体表达于线粒体,双缺失突变体仅表达于胞浆。 结论 CsATP-synt_B蛋白在华支睾吸虫的分布与线粒体的分布一致,主要集中在能量代谢较旺盛的组织部位。CsATP-synt_B蛋白既可进入线粒体,也可进入细胞核,理论预测的定位序列得到证实。     

肝片吸虫GST真核表达载体构建及重组蛋白活性分析

目的构建肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶（GST）的真核表达载体,研究重组蛋白的免疫原性。方法以构建好的重组质粒pET30a-FhGST为模板,利用PCR技术扩增肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶基因（GST）,连接真核表达载体pEGFP-N1,构建重组质粒pEGFP-GST,转染Hela细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光,Western blotting检测重组蛋白表达情况。结果重组质粒pEGFP-GST在Hela细胞中获得了表达,Western blotting结果表明真核表达质粒表达的重组蛋白能与自然感染肝片吸虫的山羊阳性血清发生特异性反应。结论肝片吸虫GST真核表达载体构建成功,真核表达产物可与自然感染的山羊阳性血清发生特异性反应,具有生物学活性,可做为分子疫苗的候选进行进一步的研究。     

人胆固醇酯水解酶真核表达载体的构建及U937细胞系的转染

目的构建人胆固醇酯水解酶（hCEH）绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-hCEH,并观察其转染单核巨噬细胞株U937后,细胞中hCEH的表达情况。方法以人肝细胞L-O2总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增hCEH编码区序列,将扩增片段插入到pMD19-T载体中,回收、纯化目的片段后亚克隆到pEGFP-N1真核表达载体上,经双酶切、测序鉴定后,转染U937,观察U937中绿色荧光蛋白的表达情况。结果 RT-PCR扩增hCEH基因的编码区序列获得1条约1.7 kb的片段,与预期片段大小相符;以pEGFP-N1为载体,成功构建重组表达质粒pEGFP-N1-hCEH,该质粒可以在U937中表达。结论成功构建pEGFP-N1-hCEH,用其转染U937后,细胞中pEGFP-N1-hCEH大量表达。     

华支睾吸虫磷脂酶A2基因生物学特性的初步研究

目的对新发现的华支睾吸虫磷脂酶A2（CsPLA2）基因进行生克隆、原核表达,确定该蛋白是否为成虫分泌/排泄蛋白（excretory-secretory protein,ESP）。方法利用多种生物信息学分析软件,从华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中识别出CsPLA2样基因,分析该基因表达蛋白的生物学功能特征;将CsPLA2克隆入原核表达质粒pET28a（＋）,并在大肠埃希菌BL21/DE3中诱导表达,蛋白表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定;应用Western blot确定CsPLA2是否为ESP;应用免疫荧光方法观察CsPLA2在成虫的组织定位。结果该基因编码307个氨基酸,含有信号肽序列,具有PLA2功能域和活化位点,与谷蛀虫同源蛋白相比,一致性为45%,相似性为52%。PCR、双酶切及DNA测序结果表明pET28a-CsPLA2重组质粒构建成功,SDS-PAGE显示目的基因在大肠埃希菌BL21/DE3中高效表达,表达产物为包涵体。Western blot结果表明CsPLA2是华支睾吸虫的ESP组分之一。虫体免疫组织化学定位显示CsPLA2定位于虫体的腹吸盘、肠支、睾丸处。结论新发现一个CsPLA2基因,其表达的蛋白定位于虫体的腹吸盘、肠支、睾丸处,为华支睾吸虫成虫ESP组分之一。该基因可在原核表达系统中高效表达。     

原癌基因pim-3的克隆及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的:克隆大鼠原癌基因pim-3并构建真核表达重组质粒pEGFP-N2／pim-3,观察他在真核细胞SMMC-7721中的表达情况以及对细胞凋亡的影响．方法:利用TRIzol从液氮保存的大鼠骨骼肌组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获取pim-3 cDNA,并构建重组质粒pEGFP-N2／pim-3,转化用CaCl2法制备的大肠杆菌JM-109菌株,酶切以及测序鉴定．将重组质粒通过脂质体介导转染肝癌SMMC-7721细胞后利用倒置荧光显微镜观察基因表达情况,并利用流式细胞术及MTT比色实验对转染细胞的生物学行为进行检测．结果:将RT-PCR产物全部用于低熔点琼脂糖凝胶电泳、回收,在DL 2000 Marker 1000 bp附近可见清晰条带,与实验设计符合;阳性克隆质粒的酶切电泳和测序结果表明,大鼠pim-3 cDNA的克隆和重组质粒pEGFP-N2／pim-3的构建成功;重组质粒pEGFP-N2/pim-3转染组凋亡细胞占3．5％,质粒pEGFP-N2转染组凋亡细胞占10．7％,而仅加入转染液的空白组凋亡细胞占11．0％,重组质粒转染组与两对照组之间差异有统计学意义(P<0．05);倒置荧光显微镜可以观察到pim-3在SMMC-772 1细胞中的正常表达;MTT比色实验显示原癌基因pim-3能够明显抑制细胞凋亡．结论:真核表达重组质粒pEGFP-N2/pim-3构建成功;原癌基因pim-3能明显抑制肝癌细胞凋亡．     

Fas相关死亡结构域蛋白荧光真核表达载体的构建及其鉴定

目的: 构建真核表达载体pEGFP-N1-FADD并检测其在结肠癌细胞株SW480中的表达.方法: 设计人FADD特异性引物, 从人结肠癌细胞SW480细胞提取总RNA, 通过RT-PCR方法获取人FADD全长cDNA, 定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1. 应用PCR、酶切和DNA测序进行鉴定, 确认后转染人结肠癌细胞SW480.G418抗性筛选获得FADD稳定表达细胞克隆,应用Western blot检测FADD的表达水平.结果: 测序及酶切鉴定证明获得人全长FADD基因, FADD基因正确插入pEGFP-N1中, 在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白在SW480细胞中的稳定表达, Western blot检测结果显示稳定转染pEGFP-N1-FADD的细胞FADD表达水平增高, 是未转染细胞的2.34倍.结论: 成功构建真核表达载体pEGF P-N1-FADD, 并且在SW480细胞中稳定表达.     

PRL-3真核绿色荧光蛋白表达载体的构建及其在结肠癌SW480细胞中的表达

目的:构建蛋白酪氨酸磷酸酶-3(PRL-3)绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-PRL-3,为PRL-3基因功能研究奠定基础.方法:设计人PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW620细胞总RNA,应用RT-PCR方法获取人PRL-3全长cDNA,分别克隆至T载体及真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1,应用PCR、酶切及DNA测序进行鉴定,确认后转染大肠癌细胞SW480,应用G418进行筛选获取PRL-3稳定表达细胞克隆,应用荧光定量PCR检测PRL-3基因表达.结果:获得522 bp的PRL-3基因编码序列并成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFPN1-PRL-3,该重组载体能够在SW480细胞中稳定表达.结论:成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-PRL-3和建立PRL-3稳定表达SW480细胞,为进一步深入研究PRL-3基因在大肠癌发生发展中的作用奠定基础.     

华支睾吸虫ATP合酶b亚基模拟亚细胞定位与细胞周期的关系

目的了解华支睾吸虫ATP合酶b亚基(CsATP-synt_B)核定位序列(NLS)介导该蛋白进入细胞核与细胞周期的关系,及该蛋白对自身和宿主同源基因表达的影响。方法将已构建的CsATP-synt_B与绿色荧光蛋白(GFP)融合表达质粒(pEGFP-N1-CsATP-synt_B)转染Hela细胞,转染细胞经同步化处理后,在激光共聚焦显微镜下观察在不同细胞周期相,细胞不同部位的荧光分布。流式细胞技术检测该融合蛋白表达量的变化,并通过半定量RT-PCR分析不同细胞周期相CsATP-synt_B和Hela细胞同源基因的表达。结果转染细胞经同步化处理后,流式细胞检测结果显示,空载体pEGFP-N1在G0/G1期Hela细胞中的表达量明显下降,而pEGFP-N1-CsATP-synt_B在该时期表达量呈上升趋势;在其他细胞周期时相,两者的荧光表达量的变化趋势相似。显微镜观察发现,在G0/G1期、S期和G2/M期CsATP-synt_B集中在线粒体表达,G1/S期细胞核内见绿色荧光,且多数细胞的绿色荧光集中见于核仁。在不同的细胞周期,半定量RT-PCR分析结果显示,该重组蛋白进入细胞核后,目的基因CsATP-synt_B和人源性ATP-synt_B(Ho-moATP-synt_B)mRNA的表达均呈上升趋势,CsATP-synt_B上升幅度较大,但两者的表达变化趋势一致。结论 CsATP-synt_B在G1/S期进入细胞核,受细胞能量需求和细胞周期的调控。     

C-端截短变异的HBx真核表达质粒的构建及表达

目的构建羧基端缺失30个氨基酸的HBx蛋白的真核表达质粒,并在真核细胞内稳定表达。方法提取HBV-DNA阳性血清总DNA,PCR扩增截短变异的HBx基因(HBx),克隆到真核质粒pEGFP-N3中,酶切及测序鉴定。利用脂质体将重组质粒转染HepG2细胞,通过W estern blot方法检测细胞内截短变异的HBx蛋白的表达。结果构建的重组质粒pEGFP-N3/x经酶切及测序鉴定结果正确。质粒pEGFP-N3/x转染细胞后可检测到目的蛋白。结论成功构建在真核细胞内稳定表达的重组质粒pEGFP-N3/x。     

华支睾吸虫富甘氨酸2a类抗原Cs4重组蛋白的免疫学特性与定位

目的 对华支睾吸虫富甘氨酸2a(glycine rich antigen 2a,GRA2a)类抗原Cs4重组蛋白(rCs4)进行免疫学特性分析,并对GKA2a类抗原进行组织定位.方法 使用蛋白质印迹(Western印迹)分析rCs4与华支睾吸虫病患者混合血清的免疫反应性,并分析GRA2a类抗原的分泌性.应用ELISA法检测rCs4免疫小鼠血清中抗rCs4特异性IgG水平,并动态检测华支睾吸虫感染兔0～44周的血清中抗rCs4特异性IgG水平.通过免疫荧光实验(immunofluorescence assay,IFA)对华支睾吸虫GRA2a类抗原进行组织定位.结果 纯化的rCsd可被华支睾吸虫病患者混合血清识别.rCs4单抗(mAb Cs4-31)与华支睾吸虫排泄分泌抗原和可溶性抗原在相对分子质量(Mr)26 000与55 000之间分别有13、15个反应条带,均呈阶梯状分布.ELISA检测rCs4免疫小鼠抗rCs4和ESA的IgG效价均达1:64 000,感染兔的抗rCs4特异性抗体平均水平自感染第4周开始上升,于第6周达到高峰,此后逐步递减,至第20周已呈较低水平.IFA检测发现GRA2a类抗原定位于华支睾吸虫成虫的表皮.结论 Cs4蛋白是华支睾吸虫在感染早期的分泌型蛋白,具较好的抗原性.GRA2a类抗原定位于华支睾吸虫成虫表皮.

Abstract：

Objective To study immunological characteristics of Cs4 recombinant protein(rCs4)of Clonorchis sinensis,one of the glycine rich antigen 2a(GRA2a)gene family member,and the histolocalization of GRA2a antigens. Methods The immunological reactivity of Clonorcihs sinensis Cs4 protein to pooled sera from clonorchiasis patients was investigated by using purified rCs4 in Western blotting.The secretory property of GRA2a antigens was also analyzed by Western blotting.The level of specific antibodies against rCs4 in the sera from mice immunized with rCs4,and the dynamic change of antibodies against rCs4 in the sera of C. sinensisinfected New Zealand rabbits(O-44 w post infection)were examined by ELISA.Immunofluorescence assay (IFA)was performed using the anti-rCs4 monoclonal antibody Cs4-31(mAb Cs4-31)to determine the localization of GRA2a antigens in C. sinensis adult worm.Results The purified rCs4 was recognized by pooled sera from clonorchiasis patients.13 and 15 bands appeared at the sites between M,26 000 and 55 000 after mAb Cs4-31 reacting with excretory-secretory antigen(ESA)and soluble adult worm antigen(AWA),respectively.The anti-rCs4 and anti-ESA serum antibody titers in mice immunized with rCs4 were 1:64 000.In C. sinensis infected rabbits,antibody level began to elevate at 4 w after infection,peaked at 6 w,and declined rapidly to a lower level at 20 w.IFA revealed that GRA2a antigens were localized in the tegument of C.sinensis adult worm.Conclusion The Cs4 protein was a secretory antigen appeared in the early stage of infection,and exhibited high antigenieity.GRA2a antigens were localized in tIle tegument of C. sinensis adult worm.     

华支睾吸虫抗原定位,生化及免疫学特性初步分析

本文在制备了华支睾吸虫全虫粗抗原（ＣｓＡｇ）、代谢抗原（ＥｓＡｇ）、表膜抗原（ＭＡｇ）及其相应抗血清的基础上，应用石蜡和冰冻两种连续组织切片、ＩＦＡＴ、ＩＧＳＳ、ＰＡＰ三和免疫化学方法对华支睾吸虫抗原定位进行了较系统的研究。结果表明：虫体定位器官主要是肠管，睾丸，储精囊和虫卵卵黄膜。两种切片抗原定位的主要区别是虫体皮层，石蜡切片未见皮层有抗原性，而冰冻切片虫体皮层有抗原性性。在此基础上应用ＩＥ、Ｓ     

4种驱虫药对重组华支睾乳酸脱氢酶(CsLDH)作用研究

目的检测吡喹酮以及苯并咪唑类药物对重组的华支睾吸虫乳酸脱氢酶(CsLDH)酶促功能的影响,探讨其药物作用机制。方法将不同浓度的吡喹酮、阿苯达唑、芬苯达唑和甲苯咪唑加入CsLDH所催化的丙酮酸还原成乳酸(正反应)以及乳酸氧化成丙酮酸(逆反应)的标准反应体系当中,紫外分光光度法测定NADH在A340处吸光度,SPSS16.0统计软件分析试验数据。结果相比于对照组,9mmol/L的吡喹酮对正、逆反应的抑制均可达到94%(P<0.01);0.2 mmol/L的阿苯达唑对正、逆反应的抑制分别为84%(P<0.01)和79%(P<0.01),0.06 mmol/L的芬苯达唑对正、逆反应的抑制分别为92%(P<0.01)和86%(P<0.01),0.1 mmol/L的甲苯咪唑对正、逆反应分别为98%(P<0.01)和87%(P<0.01)。结论吡喹酮、阿苯达唑、芬苯达唑和甲苯咪唑可能以CsLDH为作用靶点杀伤华支睾吸虫而发挥治疗作用。     

Sj43B基因编码蛋白的日本血吸虫虫体组织定位

目的确定Sj43B基因编码蛋白在日本血吸虫成虫体内组织及亚细胞水平定位。方法取新鲜日本血吸虫成虫标本,按电镜生物样品制备方法常规固定、包埋,制成超薄切片,与鼠源纯化的抗重组Sj43B基因编码蛋白的IgE抗体(对照组试验为正常鼠血清)反应,再与大鼠抗小鼠IgE的IgG抗体结合,最后与蛋白A-胶体金连接,透射电镜下观察胶体金颗粒的分布。结果用正常鼠血清处理虫体切片,从皮层、肌层到皮层细胞体,未见有明显的电子致密的胶体金颗粒分布。用特异性IgE抗体处理的样品上,胶体金颗粒分布较广泛,见于皮层、肌层、胞质、核膜和核质内。结论Sj43B基因编码蛋白在血吸虫成虫体内的分布无组织和亚细胞结构特异性。     

Sj43B基因编码蛋白的日本血吸虫虫体组织定位

目的确定Sj43B基因编码蛋白在日本血吸虫成虫体内组织及亚细胞水平定位。方法取新鲜日本血吸虫成虫标本，按电镜生物样品制备方法常规固定、包埋，制成超薄切片．与鼠源纯化的抗重组Sj43B基因编码蛋白的IgE抗体（对照组试验为正常鼠血清）反应，再与大鼠抗小鼠IgE的IgG抗体结合，最后与蛋白A-胶体金连接，透射电镜下观察胶体金颗粒的分布。结果用正常鼠血清处理虫体切片，从皮层、肌层到皮层细胞体，未见有明显的电子致密的胶体金颗粒分布。用特异性IgE抗体处理的样品上，胶体金颗粒分布较广泛，见于皮层、肌层、胞质、核膜和核质内。结论Sj43B基因编码蛋白在血吸虫成虫体内的分布无组织和亚细胞结构特异性。     

华支睾吸虫溶血磷脂酶在虫体组织定位及其特异性抗体类型分析

目的观察华支睾吸虫溶血磷脂酶(CsLysoPLA)在成虫的组织定位,分析其诱导人体产生的特异性抗体类型。方法应用免疫荧光方法,观察CsLysoPLA在成虫的组织定位;应用ELISA方法,CsLysoPLA重组蛋白检测25份华支睾吸虫病人血清的IgG1、IgG2、IgG4、IgE。结果CsLysoPLA定位于虫体的口吸盘、排泄囊、肠支、生殖孔,与虫体分泌/排泄抗原物质密切相关的部位;以CsLysoPLA重组蛋白检测华支睾吸虫感染者血清,IgG1抗体水平较高,IgG2抗体水平稍高,而感染者的IgG4、IgE水平则与健康人无明显差异。结论CsLysoPLA主要经虫体消化道、生殖道、排泄系统分泌/排泄到体外,刺激人体免疫系统产生Th2为主的免疫应答。     

MORF4基因诱导HeLa细胞衰老

目的建立MORF4基因高表达诱导HeLa细胞衰老模型,探索MORF4基因对HeLa细胞衰老的影响。方法分别将pcDNA3.1(+)/Flag-MORF4和pcDNA3.1(+)空载质粒转染人宫颈癌HeLa细胞株。SA-β-Gal染色检测细胞衰老,MTT法及流式细胞术检测细胞周期变化及细胞的增殖活力,两者共同确定MG-132处理的最适条件。Western印迹检测MORF4、PCNA基因的表达。结果质粒经酶切和测序鉴定,证明pcD-NA3.1(+)/Flag-MORF4质粒中含有目的基因序列;经浓度梯度1.25、2.5、5、10μmol/L MG-132处理转染细胞2、4、24、48 h后,SA-β-Gal染色和MTT检测结果显示10μmol/L MG-132处理24 h的转染细胞明显衰老,细胞活力降低;细胞周期被阻滞在G0/G1期,S期细胞明显减少,增殖受到抑制;Western印迹检测结果显示MORF4蛋白在细胞中的含量明显升高,而与增殖相关基因PCNA表达下调。结论构建的pcDNA3.1(+)/Flag-MORF4质粒在HeLa细胞中表达;并在MG-132作用下,使MORF4基因的表达产物积累,从而影响PCNA蛋白的表达量,抑制HeLa细胞的增殖活性,阻滞细胞周期的进行,导致细胞进入衰老状态。     

阳离子脂质体介导日本血吸虫组织蛋白酶L1基因的真核表达

目的真核表达日本血吸虫组织蛋白酶L1(SjCL1)以研究其生物学功能。方法采用阳离子脂质体复合质粒SjCL1/AD1-1 DNA并转染HeLa细胞,通过RT-PCR检测SjCL1基因在HeLa细胞中的转录,SDS-PAGE电泳法分析目的基因的蛋白表达产物,并进一步通过Western Blot法证实。结果RT-PCR检测到转染的细胞中有与目的基因相符大小约1000bp转录条带,SDS-PAGE电泳发现表达质粒SjCL1/AD1-1DNA转染的细胞上清液中存在大小约为31kDa的表达蛋白带,Western Blot法证实该表达蛋白产物可和日本血吸虫兔血清发生特异的反应。结论阳离子脂质体将SjCL1/AD1-1转染入HeLa细胞后可特异地表达一个大小约为31kDa的可分泌的日本血吸虫蛋白产物。     

人胰岛素样生长因子Ⅱ/P4启动子调控胸苷激酶载体的构建

目的 探讨人胰岛素样生长因子Ⅱ/(IGF-Ⅱ)P4启动子调控单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)/丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统体外对人肝癌细胞的选择性杀伤效应.方法用分子生物学方法构建IGF-Ⅱ P4启动子和巨细胞病毒启动子(CMV)调控下HSV-tk 与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因穿梭质粒,并用脂质体转染法将其转入肝癌细胞系HepG2及宫颈癌细胞系HeLa细胞中,在荧光显微镜下观察荧光表达情况.加入GCV使总浓度分别为0、1.0、10.0和100.0μg/ml,用四甲基偶氮唑盐实验检测HSV-tk/GCV系统对各种细胞的杀伤作用,用RT-PCR法检测转染前后胸苷激酶(tk)和EGFP mRNA的表达情况.用方差分析进行统计学处理.结果酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功;转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光;RT-PCR检测到tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达;pDC316-tkEGFP-CMV和pDC316-tkEGFP-P4转染的HepG2细胞均出现明显的细胞生长抑制现象,两者转染细胞的抑制率分别为6.95%±0.67%、24.99%±1.53%、49.68%±1.68%和71.85%±3.28%,4.83%±0.35%、17.34%±1.15%、30.17%±1.30%和40.39%±0.82%,转染后者对HepG2细胞的抑制率低(F=24.055,P<0.05),pDC316-tkEGFP-CMV转染的HeLa细胞也出现明显的细胞生长抑制现象,其抑制率分别是6.36%±0.83%、23.95%±1.72%、45.13%±1.64%和69.38%±3.17%.转染质粒pDC3 16-tkEGFP-P4的HeLa细胞未发现明显的细胞抑制现象.结论成功构建IGF-ⅡP4启动子调控携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体,转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用,为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定基础.

Abstract：

Objective To investigate the selective killing effect of herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir(HSV-tk/GCV)suicide gene system controlled by human IGF-II P4 promoter on HCC cells in vitro.Methods Recombinant shuttle plasmid vectors driven by IGFⅡ P4 promoter and driven by CMV promoter were constructed by techniques of gene recombination.The recombinant shuttle plasmids were then transfected into HepG2 and HeLa cells by techniques of lipidosome transfection.EGFP expression was detected by fluoroscopy.Tk and EGFP mRNA expression were detected by RT-PCR.The selective killing effect after GCV application was determined with MTT method.Statistical analysis was performed with ANOVA analysis.Results Identification of pDC3 16-tkEGFP-P4 by enzyme digestion and sequencing analysis showed that the construction of the recombinant shuttle plasmid was correct.It was found that green fluorescence protein could only be seen in HepG2 cells.not in HeLa cells.The results of RT-PCR showed only two bands could be seen in the samples of pDC316-tkEGFP-P4 transfected HepG2 cells.The growth of HepG2 cells transfected with pDC316-tkEGFP-CMV and pDC316-tkEGFP-P4 were inhibited remarkably,the growth inhibition rates were 6.95% ± 0.67%,24.99% ± 1.53%,49.68% ±1.68%,71.85% ± 3.28% and 4.83% ± 0.35% vs 17.34% ± 1.15%,30.17% ± 1.30%,40.39% ± 0.82%(F = 24.055,P < 0.05),respectively. The growth of HeLa cells transfected with pDC316-tkEGFP-CMV were also inhibed,the growth inhibition rates were 6.36% ± 0.83%,23.95% ± 1.72%,45.13% ± 1.64%and 69.38 % ± 3.17%,respectively. The growth of HeLa cells transfected with pDC316-tkEGFP-P4 was not inhibed. The growth inhibition rates were 0.91 ± 0.04,1.18 ± 1.32,1.19 ± 0.10 and 1.32 ± 0.05(F = 26.469,P < 0.01),respectively. Conclusion The shuttle plasmid vector carrying the tkEGFP fusion protein gene driven by IGF-Ⅱ P4 promoter has been constructed successfully and its specific expression in HepG2 cells provided the basis for targeted gene therapy for HCC.