人乳头瘤病毒16 E7限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的穿膜肽疫苗设计及体外免疫学研究

目的：利用穿膜肽人免疫缺陷病毒（HIV）-Tat49-57的穿膜能力,设计穿膜肽人乳头瘤病毒（HPV）16E7限制性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位（第49～57位氦基酸）的融合肽疫苗,并在体外研究其诱导特异性CTL的应答能力。方法：应用多肽固相合成技术,分别合成含HIVTat49-57和人类白细胞抗原（HLA）-A2．1限制性CTL优势表位HPV16E749-57的18肽,和该CTL表位的9肽,并用一无关肽作对照,在体外用乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性试验分别检测了上述18肽和9肽在HLA—A2阳性健康者外周血单个核细胞（PBMC）中诱导的表位E749-57的特异性CTL活性。结果：经质谱分析,上述多肽成功合成,纯度均在95％以上。与9肽相比,18肽能在体外诱导出明显增强的特异性CTL活性（P〈0．05）。结论：在HPV16E7HLA—A2．1限制性CTL表位（49～57）的N-末端加上HIV—Tat49-57序列,不会影响表位的提呈效率,而且在体外能有效激发针对E749-57特异性的CTL应答,为新型抗肿瘤及细胞内感染的多肽疫苗设计提供了新思路。     

人乳头瘤病毒16型E7抗原细胞毒性T细胞预测表位的分子模拟研究

对人乳头瘤病毒（HPV）16型E7抗原的预测表位从理论上分析其与HLA－A2分子结合的情况，推测成为HLA－A2限制性表位的可能性。通过计算机分子模拟，确立各表位及其与HLA－A2分子结合形成复合物的模拟结构。结果发现，各表位的三维结构符合HLA－A2限制性细胞毒性T细胞（CTL）表位的结构要求，能较好地与HLA－A2分子结合。根据分子模拟提供的理论支持，各预测表位符合要求，提示可在后续实验中进行表位合成、筛选、鉴定和多肽疫苗的研制。     

人乳头瘤病毒16E749-57的分子修饰与鉴定

目的 对人乳头瘤病毒(HPV)16型E7抗原的人白细胞抗原A2分子限制性细胞毒性T细胞表位HPV16E7_49-57进行氨基酸置换修饰,并鉴定修饰表位。方法 运用量化模体方案对置换后的多肽与人白细胞抗原A2分子的结合系数进行比较,以分子模拟方法确定合成序列,采用标准Fmoc方案进行合成与纯化多肽以及乳酸脱氢酶释放法检测特异性细胞毒性T细胞诱导活性。结果 修饰多肽符合人白细胞抗原A2分子限制性细胞毒性T细胞的表位要求,9肽RLHYNIVTF具有特异性细胞毒性T细胞诱导活性。结论 修饰表位(氨基酸序列RLHYNIVTF)具有更好的结合力和较强的抗原性,可以代替原有序列E7_49-57(氨基酸序列RAHYNIVTF)作为人乳头瘤病毒感染治疗性肽疫苗分子设计的候选表位。     

HPV16E7抗原的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的筛选与鉴定

目的 筛选和鉴定人工合成的人乳头瘤病毒16型E7抗原人白细胞抗原A2分子限制性细胞毒性T细胞预测表位。方法 对预测的E7抗原人白细胞抗原A2分子限制性细胞毒性T细胞(CTL)表位运用标准Fmoc方案进行合成与纯化,采用标准⁵¹Cr释放试验检测特异性CTL诱导活性。结果 筛选并鉴定出E711-19(YMLDLQPET)和E7_49-57(RAHYNIVTF)2条人乳头瘤病毒16型E7抗原人白细胞抗原A2分子限制性CTL表位。结论 E711-19(YMLDLQPET)和E7_49-57(RAHYNIVTF)抗原性较强,有可能作为HPV感染治疗用肽疫苗的候选表位。     

人乳头瘤病毒16 E7抗原细胞毒性T细胞预测表位合成肽的纯化与鉴定

人乳头瘤病毒(HPV)16基因组中E7基因主要与细胞转化功能及致癌有关,从感染早期到肿瘤形成期均可持续检测到E7蛋白的表达。本研究选用已预测出的HLA-A2限制性CTL表位^[1],采用固相合成法合成多肽,产物经反相高效液相(RP-HPLC)纯化、分析和质谱分析鉴定,所获取的高纯度肽为预测表位抗原性的检测奠定了基础。     

穿膜肽对HPV16E7细胞毒性T细胞表位MHC-I类抗原提呈影响的初步研究

目的 研究穿膜肽（Tat49-57）对HPV16E7 MHC-Ⅰ类限制性细胞毒性T细胞（CTL）表位（E749-57）在抗原提呈细胞内经MHC-Ⅰ类途径被提呈的动力学影响。方法 应用多肽固相合成技术，分别合成含穿膜肽与HPV（人乳头瘤病毒）16E7惟一HLA-A2/H2-Kb+限制性CTL表位E749-57的融合多肽，同时合成该表位N端自然延伸的抗原肽和无关对照肽。采用流式细胞仪（FACS）分析技术，检测抗原提呈细胞（APC）在不同时相点对上述各抗原肽进行MHC-Ⅰ类提呈的情况。结果 在与APC孵育早期，Tat-E749-57在短时间内即被APC快速提呈并进入MHC-Ⅰ类抗原提呈途径，提呈的效率略低于E749-57（P > 0.05）；在孵育的后期，与Tat-E749-57组孵育的APC细胞表面，E749-57/Kb复合物存在时间较其他组明显延长（P < 0.05）。结论 在外源性抗原肽中引入穿膜肽可明显促进其MHC-Ⅰ类限制性CTL表位的提呈效率，从而有效增强外源性抗原肽的免疫原性。     

穿膜肽对HPV16E7细胞毒性T细胞表位MHC-Ⅰ类抗原提呈影响的初步研究

目的研究穿膜肽（Tat49-57）对HPV16E7 MHC—Ⅰ类限制性细胞毒性T细胞（CTL）表位（E749-57）在抗原提呈细胞内经MHC—Ⅰ类途径被提呈的动力学影响。方法应用多肽固相合成技术，分别合成含穿膜肽与HPV（人乳头瘤病毒）16E7惟一HLA-AJH2-K^b＋限制性CTL表位E749-57的融合多肽，同时合成该表位N端自然延伸的抗原肽和无关对照肽。采用流式细胞仪（FACS）分析技术，检测抗原提呈细胞（APC）在不同时相点对上述各抗原肽进行MHC—Ⅰ类提呈的情况。结果在与APC孵育早期，Tat—E749-57在短时间内即被APC快速提呈并进人MHC—Ⅰ类抗原提呈途径，提呈的效率略低于E749-57（P〉0．05）；在孵育的后期，与Tat—E749-57组孵育的APC细胞表面，E749-57／K^b复合物存在时间较其他组明显延长（P〈0．05）。结论在外源性抗原肽中引人穿膜肽可明显促进其MHC—Ⅰ类限制性CTL表位的提呈效率，从而有效增强外源性抗原肽的免疫原性。     

HPV16 CTL表位E749-57以HSP110为分子伴侣的免疫原性研究

目的 探讨以mHSP110为分子伴侣的HPV16 CTL表位E749-57的免疫原性。方法 将mHSP110基因克隆、原核表达和纯化,SDS-PAGE和Western blot鉴定。在热休克状态与E749-57结合形成复合物,高压液相色谱（HPLC）鉴定其结合程度。用mHSP110-E749-57复合物免疫小鼠,IFN-γ胞内染色、MTT法检测小鼠脾细胞中特异CTL。结果 克隆mHSP110片段经DNA序列测定与基因库中其CDS一致,长度为2577 bp;经SDS-PAGE和Western印迹证实mHSP110表达、纯化成功,HPLC分析E749-57能够与mHSP110形成复合物。复合物免疫小鼠的脾淋巴细胞中CD8+IFN-γ+ T细胞的频率、脾淋巴细胞增殖活性明显高于E749-57组、HSP110组和PBS组。复合物免疫小鼠可明显抑制TC-1肿瘤的生长。结论 mHSP110-E749-57复合物能诱导产生特异性CTL并产生抗肿瘤效应。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型细胞毒性T淋巴细胞表位重组DNA疫苗的构建表达及鉴定

目的：针对单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）包膜糖蛋白gD和gB的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）表位,构建重组真核表达质粒pVAX-gD-CTL。方法：用PCR方法从已构建好的pc-gD真核表达质粒中扩增gD片段,将其与CTL表位共同连接到pVAX1载体,构建重组真核表达质粒pVAX-gD-CTL。采用免疫组化和Western-blotting法鉴定重组质粒的表达情况,免疫BALB／c小鼠,进行CTL活性鉴定。结果：构建的重组质粒能在非洲绿猴肾细胞（COS-7细胞）内表达。该重组DNA疫苗免疫接种BALB／c小鼠后,其CTL活性增高。结论：成功构建HSV-2 pVAX-gD-CTL重组真核表达质粒,并能在真核细胞内表达,该DNA疫苗对细胞免疫有明显的促进作用。     

HPV16E7多肽体外诱生抗原特异性细胞毒性T细胞表型及功能的研究

目的 探讨高致癌性HPV16E7病毒抗原肽体外诱生HLA-A2阳性正常人外周血抗原特异性CD8＋细胞毒性T细胞（CTL）的表型及功能状态。方法 以HPV16E711－20合成多肽、重组人IL-7、IL-2体外刺激26例HLA-A2阳性正常人外周血T细胞,用HLA-A*0201限制性表位肽/ YMLDLQPETT五聚体技术,结合流式细胞仪对抗原特异性CTL进行频率、表型［CD45RA+CD27-效应性CTL、CD45RA-CD27-效应性记忆CTL（TEM）、CD45RA-CD27＋中枢性记忆CTL（TCM）、CD45+CD27+初始性CTL］及功能（穿孔素、颗粒酶B、FasL）分析,并以无关肽HBVcore18－27作为阴性对照。结果 病毒多肽体外刺激T细胞7 d后,抗原特异性CD8＋ CTL数为（0.73 ± 0.33）%,比未刺激组的（0.02 ± 0.03）%明显增多（P < 0.01）。进一步分析,在抗原特异性CTL中,效应性CTL、TEM、TCM及初始性CTL百分比分别为（26.07 ± 13.46）%、（7.97 ± 7.11）%、（33.25 ± 19.68）%及（32.73 ± 13.89）%,均比未刺激组的（0.02 ± 0.03）%、（0.02 ± 0.03）%、（0.02 ± 0.03）%及（0.02 ± 0.05）% 明显增多,P值均 < 0.01。HPV16E711－20表位特异性CTL分泌穿孔素、颗粒酶B、Fas-L的水平分别为（47.01 ± 18.69）%、（80.53 ± 13.32）%及（26.48 ± 7.81）%,均比未刺激组的（0.38 ± 0.55）%、（0.34 ± 0.22）%及（0.16 ± 0.16）%明显增多,P值均 < 0.01。结论 HPV16E711－20多肽诱导CD8＋ T细胞克隆扩增,产生抗原特异性CD8＋ CTL,分泌毒性细胞因子,通过不同机制特异性杀伤病毒感染的靶细胞,在抗病毒免疫应答中发挥作用。     

角蛋白置换肽配体对银屑病患者外周血T细胞的抑制作用

目的 筛选下调银屑病患者T细胞功能的置换肽配体。方法 分离和纯化寻常型银屑病患者和健康人外周血T细胞，通过MTT法和ELISA法分别检测T细胞增殖情况和IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10等细胞因子的变化，筛选得到抑制银屑病患者外周血T细胞功能的APL。结果 APL 119R和355L可显著下调银屑病患者T细胞的增殖，分别与谷胱甘肽巯基转移酶和空白对照比较，在10 μg/mL和100 μg/mL浓度下，P < 0.05；而对健康人T细胞无明显作用。同时二者可显著下调银屑病患者外周血T细胞的IFN-γ和IL-2，上调IL-4和IL-10的分泌表达，分别与相对应的野生型表位比较，在10 μg/mL和100 μg/mL浓度下，P < 0.05。结论 APL 119R和355L具有体外下调银屑病患者外周血T细胞增殖和增强Th2极化的作用。     

聚合酶链反应诱导HPV16E7C端基因突变和突变蛋白在真核细胞表达

目的 聚合酶链反应(PCR)诱导人乳头瘤病毒(HPV16)早期基因E7C端锌指结合基序基因突变,评价突变对抗原稳定性的影响。方法 采用PCR技术对HPV16E7第58、91位氨基酸进行突变,构建野生型(pcDNA3.1/16E7)和突变型(pcDNA3.1/16ME7)重组体,对其蛋白表达进行比较。结果 HPV16E7C端第58、91位氨基酸突变后真核细胞表达成功,免疫荧光检测在质粒转染COS-7细胞24h后两种重组体均有阳性细胞出现,但在48h时突变型重组体阳性细胞消失。免疫印迹技术在24h和48h时,突变型重组体均未见阳性条带。结论 HPV16E7C端锌指结构对维持蛋白稳定性起重要作用,突变后蛋白稳定性下降。     

不同RNA干预技术对人乳头瘤病毒11型E7基因的沉默作用

目的探讨RNA干预技术的两种形式在体外对人乳头瘤病毒（HPV）11型E7基因的沉默作用。方法化学合成1对小片段干扰RNA（siRNA-11E7）、同时构建3个短发夹状小RNA（shRNA）表达质粒（pRNAT-11E71^#、2^#、3^#），分别转染稳定表达HPV11E7的C57BL／6小鼠黑素瘤细胞系B16细胞株，采用实时荧光定量PCR技术检测细胞转染前后靶基因mRNA的表达水平。结果siRNA-11E7转染细胞后6、12、24、48、72、96、120h对靶基因表达的抑制率分别为12.60％、31.41％、41.93％、42.93％、74．35％、32.71％、29．00％；最佳作用浓度为25nmol／L（抑制率70.06％），最低作用浓度可至3.13nmol／L（抑制率47.00％）。以0．4μg pRNAT-11E71^#、2^#、3^#及上述3个质粒等量混合转染细胞72h后对靶基因表达的抑制率分别达44．52％、59．26％、89.62％、54.09％，阴性质粒无干预作用。pRNAT-11E73^#作用6、12、24、48、72、96、120h对靶基因表达抑制率分别为0、17．50％、40．90％、42．40％、61．90％、51．50％、0％；最佳作用剂量0．2μg。结论siRNA及shRNA表达载体均可在体外安全高效地沉默HPV11E7基因的表达，其干预作用存在一定的量效性和时效性，且可能存在最佳作用浓度（剂量）和最佳作用时间。     

T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3对黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗刺激小鼠淋巴细胞的影响

目的 探讨体外T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（TIM-3）对与小鼠黑素瘤B16F10细胞共培养的酪氨酸相关蛋白-2（TRP-2180-188）抗原肽刺激小鼠淋巴细胞的影响。 方法 构建TIM-3重组质粒pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2,分别转染重组质粒及空质粒pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2至人上皮293T细胞,继续培养48 h,制备含TIM-3、免疫球蛋白（Ig-tail）的上清液。TRP-2180-188肽疫苗免疫C57BL/6小鼠,分离小鼠脾淋巴细胞,用TRP-2180-188抗原肽和白细胞介素（IL）-2刺激培养5 d,以未刺激细胞作为对照组。构建B16F10细胞与上述TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴细胞共培养体系,分为空白对照组（加293T细胞培养48 h上清液）、TIM-3组（加含TIM-3上清液）、阴性对照组（加含Ig-tail上清液）。CCK-8法检测细胞增殖情况,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测共培养体系中干扰素（IFN）-γ和肿瘤坏死因子（TNF）-α浓度,流式细胞仪检测共培养体系中CD8+T淋巴细胞。 结果 酶切和测序鉴定证实目的基因正确插入真核表达载体中,检测到转染重组质粒pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2的293T细胞上清液中有TIM-3表达,转染空质粒pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2的293T细胞上清液中有Ig-tail的表达。CCK-8法检测显示24 h时空白对照组、阴性对照组、TIM-3组淋巴细胞增殖活力分别为（100.00 ± 10.42）%、（108.70 ± 9.90）%、（78.06 ± 6.37）%,48 h时分别为（100.00 ± 6.24）%、（168.00 ± 2.98）%、（42.93 ± 5.93）%;24 h、48 h时TIM-3组淋巴细胞活力低于空白对照组和阴性对照组（均P ＜ 0.05）。TIM-3组48 h相比24 h淋巴细胞增殖倍数低于空白对照组和阴性对照组（均P ＜ 0.05）。24 h时,空白对照组、阴性对照组、TIM-3组IFN-γ浓度分别为（216.44 ± 7.85）、（223.67 ± 7.79）、（192.96 ± 5.05） ng/L,48 h时分别为（230.06 ± 4.23）、（167.24 ± 3.33）、（54.95 ± 0.57） ng/L。24 h、48 h时,TIM-3组IFN-γ浓度低于空白对照组和阴性对照组（均P ＜ 0.05）。24 h、48 h时,TIM-3组TNF-α浓度低于空白对照组和阴性对照组（均P ＜ 0.05）。24 h时空白对照组、阴性对照组、TIM-3组CD8+T淋巴细胞中位数分别为0.421%、2.22%、3.30%,48 h时分别为0.577%、0.691%、4.06%。24 h、48 h时TIM-3组CD8+T淋巴细胞中位数高于空白对照组和阴性对对照组。 结论 TIM-3在体外能够抑制B16F10细胞与TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴细胞共培养体系中淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ、TNF-α,提高CD8+T淋巴细胞。