重组腺病毒介导的血管内皮生长因子165在大鼠骨髓基质细胞中的表达

目的 利用AdEasy腺病毒载体系统构建携带血管内皮生长因子165(VEGF165)的重组腺病毒(Ad-VEGF165),并观察Ad-VEGF165转染大鼠骨髓基质细胞(bMSCs)后VEGF165的表达情况. 方法 将PCR获取的VEGF165目的 基因插入到pAATrackCMV中,构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-VEGF165,经Pme I酶切线性化后,采用电穿孔法转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌感受态细胞中,挑选同源重组菌落.提取质粒并用Pac I酶切鉴定.线性化重组质粒pAdEasy-VEGF165转染293T细胞,包装成重组腺病毒颗粒.并扩增收集重组腺病毒,测定病毒滴度.体外培养大鼠骨髓基质细胞,Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞,转染后在荧光显微镜下观察.转染的骨髓基质细胞采用RT-PCR和ELISA法检测VFGF165的表达水平. 结果 经酶切鉴定,基因测序及绿色荧光观察证实成功构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒,并扩增出109pfu/ml的高滴度重组腺病毒.Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞后,RT PCR证明转染的骨髓基质细胞内有VEGF165mRNA表达.ELISA检测发现转染组上清液中VEGF165蛋白分泌量明显高于对照组(P＜0.01). 结论 pAdEasy-VEGF165转染对骨髓基质细胞的增殖能力无明显影响,而且骨髓基质细胞能够表达并分泌VFGF165为研究骨组织工程血管化局部基因治疗奠定了基础.     

白介素21基因联合放射对子宫颈癌HeLa细胞的协同抑制作用

目的 探讨外源性I L-21基因表达联合放射对子宫颈癌HeLa细胞的协同抑制作用.方法 将构建好的重组腺病毒Ad-IL-21转染人胚肾293A细胞,进行病毒扩增,采用TCID50方法测定腺病毒的滴度.将扩增的Ad-IL-21腺病毒于体外转染HeLa细胞,转染后进行6 Gy 137Cs γ射线照射,利用随机数字表法分为5组,空白对照组不加任何处理,含LacZ基因、但不含IL-21基因的对照腺病毒为Ad-LacZ对照组,Ad-IL-21组,单纯照射组以及联合处理组,观察HeLa细胞的细胞生长曲线、细胞周期、细胞凋亡、IL-21基因和蛋白表达的变化.结果 Ad-IL-21重组腺病毒在293A细胞中扩增成功,获得了高滴度的病毒颗粒,滴度为9×1010pfu/ml.Ad-IL-21组、单纯照射组和联合处理组中,HeLa细胞的生长均明显受到抑制,其中转染后96 h,与Ad-IL-21组和单纯照射组比,联合处理组HeLa细胞的抑制效应最显著(F=85.26、72.98,P＜0.05).联合处理组HeLa细胞发生G.期阻滞,S期细胞数量减少(F=36.69、34.83,P＜0.05),凋亡细胞数量增加(F=28.23、25.57,P＜0.05).联合处理组HeLa细胞中IL-21基因表达量分别是Ad-IL-21组和空白对照组的1.54倍和2.43倍(F=22.31、36.65,P＜0.05);蛋白表达量分别是Ad-IL-21组和空白对照组的1.62倍和2.31倍(F=27.36、35.86,P＜0.05).结论 IL-21基因联合放射对子宫颈癌细胞的抑瘤作用具有协同效应,有效地抑制肿瘤细胞的生长.     

内皮抑素基因抗血管生成治疗子宫内膜异位症的实验研究

目的研究重组腺病毒介导的鼠内皮抑素(mEndostatin)基因对子宫内膜异位症的抑制作用。方法构建携带mEn-dostatin基因的重组腺病毒载体,建立人子宫内膜异位症的裸鼠模型,随机分为Ad-mEndo组、Ad-lacZ组和PBS对照组3组(n=10),观察3组用药前后异位病灶的形态、组织学及微血管密度(MVD)变化。结果治疗20d后,Ad-mEndo组异位病灶体积(34·3±11·2mm3)明显小于Ad-LacZ组(93·3±10·7mm3)和PBS对照组(90·4±18·7mm3,P<0·01),也小于用药前病灶体积(103·3±13·1mm3,P<0·01)。Ad-mEndo治疗的异位病灶MVD(9·6±11·6),明显低于Ad-LacZ组(15·8±10·4)和PBS对照组(15·8±18·6,P<0·01)。光镜下可见Ad-mEndo组异位子宫内膜明显减少,腺腔狭窄,细胞稀疏,呈萎缩状态,或可见腺上皮细胞空泡变性。TUNEL法检测Ad-mEndo组有(30·8%±12·0%)细胞出现凋亡,高于Ad-LacZ组(12·2%±7·1%)和PBS组(15·5%±9·5%,P<0·01)。结论所构建的mEndostatin重组腺病毒可有效地表达具有生物活性的内皮抑素,可以使子宫内膜异位症种植块的血管生成减少,抑制种植块生长,为抗血管生成子宫内膜异位症的临床应用奠定基础。     

bcl-2基因转染对大鼠胰岛细胞培养的影响

目的探讨bcl-2基因转染对培养的胰岛细胞凋亡和生物活性的影响。方法用腺病毒介导的基因转染方法把bcl-2转染人胰岛细胞，用RT—PCR和免疫细胞化学方法检测转染细胞中bcl-2的表达，原位末端标记（TUNEL）检测细胞凋亡，台盼蓝测定细胞活度，放免法测定培养液巾胰岛素水平了解胰岛功能。结果转染的胰岛细胞中70％的细胞有bcl-2蛋白的表达，转染细胞的凋亡率为6％，对照组为22死，转染胰岛细胞的活度为91％，对照组为68％，转染胰岛细胞在高糖培养基中胰岛素水平高于对照组。结论腺病毒介导的基冈转染方法能成功转染胰岛细胞，bcl-2基因转染能降低细胞凋亡率，改善胰岛细胞功能。     

子宫内膜异位症异位内膜细胞原代培养方法的改良

目的：建立一种简易的人异位子宫内膜细胞体外原代培养方法。方法：通过胰蛋白酶消化、贴壁纯化等技术,分离及培养10例子宫内膜异位症患者的异位子宫内膜细胞。在光学显微镜下观察细胞形态,以免疫细胞化学法鉴定细胞类型。结果：8份标本获得成功,培养的异位内膜细胞均有腺上皮细胞和间质细胞两种形态细胞。膜上皮细胞和基质细胞分别经角蛋白单抗和波形蛋白单抗免疫组化染色为阳性,腺上皮细胞平均生长时间为5周,间质细胞平均生长时间为14周。结论：成功建立了子宫内膜异位症异位内膜细胞体外原代培养方法,该改良培养法经济、简单、高效。     

抑癌基因PTEN在孕三烯酮诱导子宫内膜异位症细胞凋亡中的作用

目的　研究抑癌基因PTEN在孕三烯酮诱导体外培养的子宫内膜异位症细胞凋亡中的作用。方法　以不同浓度的孕三烯酮对体外培养人子宫内膜异位症细胞进行处理 ,MTT法测算孕三烯酮作用 0～ 4 8h对子宫内膜异位症细胞的抑制情况并绘制生长曲线 ;取 2 4h为作用时间 ,透射电镜观察细胞超微结构变化 ,流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期 ,应用PTEN单克隆抗体经由流式细胞仪分析细胞内PTEN的表达。结果　细胞生长曲线显示孕三烯酮对子宫内膜异位症细胞的生长增殖有显著的抑制作用 ,且呈时间 剂量 效应关系 ;透射电镜观察发现 ,孕三烯酮可诱导子宫内膜异位症细胞发生典型的凋亡形态学改变 ;流式细胞仪检测显示 1× 1 0 -6mol/L和1× 1 0 -4mol/L浓度的孕三烯酮作用 2 4h后 ,子宫内膜异位症细胞的凋亡率分别为 1 3%和 1 5 0 % ,与对照组相比差异显著 ;同时细胞内PTEN的表达有不同程度的上调。结论　孕三烯酮能明显抑制子宫内膜异位症细胞的生长增殖 ,这一作用可能与上调PTEN的表达及诱导细胞凋亡有关     

慢病毒介导的siRNA靶向CD47基因对人喉癌细胞Hep-2增殖、凋亡的影响

目的 探究慢病毒载体介导siRNA抑制CD47基因表达后对人喉癌细胞株Hep-2体外增殖凋亡的影响.方法 构建慢病毒载体,将靶向CD47基因的siRNA慢病毒转染至Hep-2细胞;用荧光显微镜行细胞形态学变化观察;RT-PCR检测细胞CD47 mRNA表达的变化;Western blotting检测CD47蛋白表达的变化情况;MTT法检测细胞的增殖凋亡情况.结果 CD47-siRNA慢病毒转染Hep-2细胞后,形态学观察显示CD47-siRNA能有效抑制Hep-2细胞增殖,细胞变形明显,体积变小,可见细胞坏死及凋亡.RT-PCR和Western blotting检测显示,CD47的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P＜0.05),使CD47 mRNA表达减少76％～82％,CD47蛋白表达减少77％;慢病毒转染细胞在48h后MTT检测细胞凋亡率明显提高(P＜0.01).结论 慢病毒介导的siRNA干扰CD47基因表达后,明显抑制了喉癌Hep-2细胞CD47的表达并且诱导了Hep-2凋亡.     

凋亡调节基因bcl—2,bax和fas在子宫内膜异位症中的表达

应用免疫组化法检测凋亡调节蛋白bcl 2 ,bax和fas在无异位症妇女的正常子宫内膜、腹腔液巨噬细胞与卵巢子宫内膜异位症患者在位子宫内膜、异位子宫内膜及腹腔液巨噬细胞中的表达。同时 ,用TUNEL法测出各种细胞的调亡率。结果表明 ,bcl 2在异位症患者在位、异位内膜及腹腔液巨噬细胞中的表达较无异位症者增强 ,差异有显著性意义 (P <0 0 1)。bax在异位症中的表达较低 ,差异有显著性意义 (P <0 0 5 )。fas在异位症患者在位及异位内膜中的表达较低 ,差异有显著性意义 (P <0 0 5 )。结果提示 ,子宫内膜异位症患者在位、异位内膜及腹腔液巨噬细胞中凋亡基因的表达与无异位症者不同 ,其凋亡率低 ,对凋亡的接受性降低 ,有利于异位内膜的种植、生存和发展。     

基因成像体外监测人肿瘤坏死因子相关的诱导凋亡配体基因在肺癌A549细胞中表达的实验研究

目的 应用作者构建的同时携带人肿瘤坏死因子相关的诱导凋亡配体(hTRAIL)基因和萤火虫荧光素酶(lue)基因的腺病毒双表达载体(Ad-hTRAIL-lue),以luc为报告基因,体外监测hTRAIL基因的表达及其作用.方法 携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒载体(Ad-EGFP)以不同感染复数(MOI)感染肺癌A549细胞,48 h后检测腺病毒载体的感染效率.Ad-hTRAIL-luc分别以不同MOI感染A549细胞,用流式细胞仪48 h后分别检测hTRAIL的表达率及A549细胞的凋亡率;用液闪计数仪检测荧光素酶发光的每分钟计数(cpm).携带luc基因的腺病毒载体(Ad-luc)以不同MOI感染A549细胞,48 h后枪测荧光素酶发光的cpm值.Ad-hTRAIL-luc转染A549细胞后,对各组细胞的hTRAIL表达率及细胞凋亡率结果(自然对数转换后)、cpm值结果进行完全随机设计资料的方差分析,并对hTRAIL表达率及细胞凋亡率的2组数据进行直线相关分析.对Ad-EGFP感染后阳性率及Ad-luc感染后cpm值进行完伞随机设计多样本比较的秩和检验.结果 Ad-hTRAIL-luc转染A549细胞后,各组hTRAIL基因的表达率经自然对数转换后分别为(2.37 ± 0.04)/、(3.16±0.03)/、(3.64±0.03)/、(3.96±0.02)/、(4.24±0.02)/、(4.34±0.02)/,各组间差异具有统计学意义(F=7364,P＜0.01),两两比较差异均有统计学意义(P＜0.01);将各组细胞凋亡率进行自然对数转换后分别为(1.52±0.04)/、(2.93±0.02)/、(3.39±0.02)/、(3.64±0.02)/、(3.86±0.02)/、(4.08±0.02)/、(4.20±0.02)/,各组间差异具有统计学意义(F=12456.7,P＜0.01),两两比较差异均有统计学意义(P＜0.01);各组细胞检测到的cpm值分别为465 561±26 801、1 038 576±29 417、937 655±23 197、786 432±20 028、524 288±16 338、401 566±15 961,各组间差异具有统计学意义(F=1315.94,P＜0.01),差异两两比较均有统计学意义(P＜0.01).hTRAIL基因的表达率和A549细胞的凋亡率之间存在相关关系(r=0.984,P＜0.01).结论 腺病毒双表达载体Ad-hTRAIL-luc可有效将luc及hTRAIL基因传递到肺癌A549细胞中,从分子或细胞水平研究生物体的变化和疾病的进展,监测基因表达及疾病疗效.     

LRP16、E-cadherin、ER与PR在子宫内膜异位症中的表达及其意义

目的 探讨LRP16与雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、E-钙黏附蛋白(E-cadherin)在子宫内膜异位症(EM)患者在位和异位内膜中的表达及其意义.方法 采用免疫组化SP二步染色法,对72例EM患者在位和异位内膜中的LRP16、E-cadherin、ER、PR进行免疫组化染色.结果 腺上皮细胞胞质中LRP16在在位内膜中的表达高于异位内膜(P＜0.05);胞核中LRP16在位和异位内膜中的表达无明显差异;腺上皮细胞膜中E-cadherin在在位内膜中的表达低于异位内膜(p＜0.05).但在位和异位内膜中LRP16和E-cadherin的表达无相关性(P＞0.05).腺上皮细胞核中ER、PR在在位内膜中的阳性表达率高于异位内膜(P＜0.05),异位内膜中PR的阳性表达率高于胞核中LRP16的阳性表达率(P＜0.05),ER的阳性表达率低于LRP16,且ER与胞核中LRP16表达存在相关性.在位内膜胞核中LRP16的表达高于ER、PR(P＜0.05).结论 LRP16和E-cadherin、ER、PR在在位和异位内膜中的表达异常可能与EM的发生发展有关.     

定量超声基因导入与效应控制

目的研究低频超声裸基因导入新方法与基因导入效应的控制,为疾病的基因治疗提供安全可靠、无细胞毒性的导入新方法。方法用不同参数的35.1kHz超声进行裸基因导入细胞实验,用激光共聚焦显微镜、荧光显微镜、流式细胞仪和分光光度法分析细胞膜形态、细胞膜通透性与损伤阈值、细胞存活率和基因表达。结果实验所见90%细胞存活点的超声能量积分是细胞膜通透安全控制参数,80%细胞存活点的能量积分是细胞的损伤阈值。绿色荧光蛋白(GFP)在安全超声参数下成功导入了S180细胞,细胞转染率为35.83%±2.53%(n=6),荧光表达强度明显高于病毒转染法和控制组(P<0.001)。结论安全参数下低频超声可有效地将裸基因导入S180肿瘤细胞,其基因表达强度随超声能量积累而增强,并有细胞凋亡倾向。     

辐射联合外源性野生型p53基因对不同p53状态的黑色素瘤细胞系的生物学效应

目的研究辐射结合腺病毒（Ad CMV）载体介导的p53基因转导对不同p53状态的人黑色素瘤细胞系基因转移效率、凋亡和辐射敏感性的影响。方法用复制缺陷的重组腺病毒载体（AdCMV-p53）介导入p53基因转导1Gy X射线预照射的黑色素瘤细胞系A375（wt p53）和WM983a（mu p53），RT-PCR检测mRNA水平，流式细胞仪测定细胞周期阻滞及外源性P53蛋白表达情况，Tunel法检测细胞凋亡，克隆形成率测定辐射后细胞存活率。用携带报道基因的复制缺陷重组腺病毒载体AdCMV-GFP作为对照。结果1Gy X射线照射可较高地增加AdCMV-p53对A375和WM983a细胞系的基因转导效率，转导的外源性野生型p53可在两种细胞中高效表达，并诱导细胞周期G1期阻滞；单纯转导p53对A375（wt p53）细胞无明显诱导凋亡和生长抑制效应，但可部分诱导WM983a（mu p53）细胞凋亡；而转导p53基因48h后给予X射线辐射，两种细胞的克隆存活率较其对照组均明显减低，外源性p53基因对WM983a（mu p53）细胞的辐射增敏作用较A375（wt p53）细胞明显。结论外源性野生型p53基因过表达可增加黑色素瘤细胞系A375和WM983a的辐射敏感性，但对WM983a细胞系的辐射增敏作用高于A375细胞系。表明p53是基因治疗黑色素瘤较好的候选基因。     

不同类型子宫内膜组织中GnRH及其受体的表达及意义

目的 在蛋白水平检测促性腺激素释放激素(GnRH)及其受体(GnRH-R)在不同类型子宫内膜组织中的表达,探讨其可能存在的意义。方法 采用免疫组化法检测子宫内膜异位症(EMS)的在位内膜和异位内膜以及子宫内膜增生、子宫内膜癌和对照组子宫内膜上GnRH及GnRH-R的表达及分布。结果 GnRH和GnRH-R在EMS和对照组在位内膜持续表达,阳性物质位于腺上皮和间质上皮胞浆内,分泌期染色最强;异位内膜组织中二者的表达率近50％;子宫内膜增生组织中GnRH和GnRH-R表达率分别为92．3％、92．3％,而子宫内膜癌组织中则分别为58．8％、82．4％。结论 在子宫内膜组织中存在着GnRH及GnRH-R的蛋白表达,其在异位内膜组织、内膜增生和内膜癌中的高表达可能成为临床诊断指标和治疗的靶点。     

KDR启动子驱动双自杀基因诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨KDR启动子驱动双自杀基因体系对胃癌细胞凋亡的诱导作用。方法以重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK体外感染表达KDR的SCG7901细胞株和不表达KDR的HepG2细胞株,并给予不同浓度的前药GCV和（或）5-FC,观察该体系对SCG7901细胞的杀伤效应。分别应用透射电镜、Hoechest33258／PI染色、流式细胞仪观察细胞超微结构、细胞凋亡率和细胞周期的变化。结果携带双自杀基因（CDglyTK）和报告基因（GFP）的重组腺病毒载体转染后,95％以上SCG7901和HepG2细胞中有GFP表达。表达KDR的SCG7901细胞对前药具有较高的敏感性,不表达KDR的HepG2细胞对前药不敏感（P〈0．01）。两种前药联合应用优于任一前药单独应用的疗效（P〈0．01）。流式细胞术检测表明该体系可抑制SCG7901细胞DNA的合成,表现为s期细胞比例增高及G2期细胞减少。同时,Hoechest33258／PI染色和电镜下可见SCG7901有凋亡改变。结论KDR启动子可以调控融合基因体系选择性地杀伤人胃癌SCG7901细胞,并且该体系可以诱导胃癌细胞凋亡。     

三种方法浓缩慢病毒后绿色荧光蛋白转染效率的比较

 目的 比较超滤管法、超速离心法及病毒浓缩液法浓缩慢病毒后绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的转染效率。方法 用摇床过夜摇pMD2.G、psPAX2及GFP载体菌种并用试剂盒提取这三种质粒;将pMD2.G、psPAX2及GFP载体质粒与转染试剂按比例混合后转染293T细胞生产病毒;收集病毒上清液并用超滤管法、超速离心法及病毒浓缩液法浓缩慢病毒;将接种的293T细胞分为3组,并向每组接种有293T细胞的培养液中加入2、4、8、16 μl三种方法浓缩的病毒浓缩液,48 h后用荧光显微镜观察和流式细胞仪检测三种方法浓缩慢病毒后转染293T细胞的GFP表达情况。结果 荧光显微镜观察结果显示随着转染量的增加,GFP表达率增加,超滤管法浓缩病毒转染293T细胞后GFP的表达效率最高;流式检测显示病毒浓缩液法组2、4、8、16 μl GFP的表达率分别为(2.4±0.1)%、(3.8±0.3)%、(8.2±0.6)%、(12.2±0.3)%;超滤管法组2、4、8、16 μl GFP的表达率分别为(5.4±0.3)%、(7.4±0.4)%、(12.7±0.1)%、(17.3±0.6)%;超速离心法组2、4、8、16 μl GFP的表达率分别为(0.7±0.1)%、(1.2±0.1)%、(2.1±0.1)%、(0.4±0.2)%。超滤管法组与其他两组比较,P<0.05,差异有统计学意义。结论 不同方法浓缩慢病毒后的GFP转染效率不同,三种慢病毒浓缩方法中超滤管法浓缩慢病毒后的GFP转染效率最高。     

重组腺病毒Ad-huVEGF121的制备

目的：构建能够用于骨缺血研究的能表达huVEGF121的重组腺病毒载体。方法：将huVEGF121克隆至穿梭质粒，线性化后转染含骨架质粒的BJ5183菌，构建重组腺病毒质粒。酶切及PCR法鉴定；将其线性化后转染293细胞，通过观察绿色荧光监测病毒产生，免疫组化检测VEGF121表达。结果：成功的将hu—VEGF121克隆至穿梭质粒pTrack—CMV，正确构建了重组腺病毒质粒，感染293细胞得到大量病毒。结论：成功构建了huVEGF121重组腺病毒，为缺血性骨病的进一步研究奠定了基础。     

Focal gene induction in the liver of rats by a heat-inducible promoter using focused ultrasound hyperthermia: preliminary results

OBJECTIVE: We sought to examine high-intensity focused ultrasound (HIFU)-induced hyperthermia in the liver of a rat model to focally induce green-fluorescent protein (GFP). MATERIALS AND METHODS: A total of 25 Copenhagen rats were included in this study. Rats were divided into groups treated with an adenovirus coding for green fluorescent protein (GFP) under the control of a hsp70B promoter and a CMV promoter. Ad-CMV-GFP-treated rats served as positive control. Untreated controls only subjected to MRI +/- HIFU-treatment served to find out optimal power of HIFU in the target area of the liver. Temperature was noninvasively monitored by temperature sensitive magnetic resonance imaging (MRI). RESULTS: Rats treated with Ad-hsp70B-GFP demonstrated localized gene induction within the liver parenchyma, in good correlation with MRI and histology. Applying an acoustic power of 1.92 W a relatively uniform focal temperature up to 42 +/- 5 degrees C within the liver parenchyma could be documented. 3 x 10(9) plaque-forming units proved to account for a very homogeneous liver infection. Number of fluorescent cells in the region of hyperthermia was similar to the control group treated with Ad-CMV-GFP. CONCLUSION: Using the introduced parameters spatially controlled gene induction within a parenchymal organ such as the liver in rats using HIFU under control of MRI is feasible.     

A multimodality reporter gene for monitoring transplanted stem cells

IntroductionThe aim of this study is to explore the feasibility of a triple-fused reporter gene, termed TGF [herpes simplex virus type 1 thymidine kinase (HSV1-tk), enhanced green fluorescent protein (eGFP) and firefly luciferase (Fluc)], to monitor stem cells using multimodality molecular imaging.MethodsA recombinant adenovirus vector carrying the triple-fused reporter gene (Ad5-TGF) was constructed. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) were transfected with different virus titers of Ad5-TGF [multiplicities of infection (MOIs) were 0, 50, 100, 150, 200 and 250]. The mRNA and protein expressions of HSV1-tk, eGFP and Fluc in the transfected BMSCs were evaluated using polymerase chain reaction and Western blot. After the transfection of the BMSCs with different virus titers of Ad5-TGF (MOIs were 25, 50, 75, 100 and 125), their uptake rates of ¹³¹I-FIAU were measured. Whole-body fluorescence, bioluminescence and micro-positron emission tomography (PET) images were acquired 1 day after the transfected BMSCs were injected into the left forelimb of rats.ResultsAfter the transfection with different titers of Ad5-TGF, the positive transfection rate reached a peak (70%) when the MOI was 100. HSV1-tk, eGFP and Fluc mRNA and protein were detected in the Ad5-TGF-transfected BMSCs, which implies their successful transfection and expression. The BMSCs uptake of ¹³¹I-FIAU increased with the adenovirus titer and incubation time and reached a plateau (approximately 5.3%) after 3 h. Strong signals were observed in the injected left forearms in the fluorescence, bioluminescence and micro-PET images.ConclusionsA triple-fused reporter gene, TGF, can be used as a multifunctional molecular probe for multimodality imaging.     

脑红蛋白重组腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的：为进一步研究脑红蛋白（NGB）的生理功能并为基因治疗缺血性脑损伤提供有效的表达载体，应用细菌内同源重组方法分别构建含NGB及绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒表达载体，并对其进行鉴定。方法：用电转方法将腺病毒基因组质粒pAdEasy-1导入BJ5183细菌，制备BJ5183-pAdEasy-l细菌，再以后者作为电感受态细菌，与线性化质粒pShuttle-CMV-NGB进行同源重组，获得重组腺病毒质粒pAdEasy-NGB，转染293细胞。制备含脑红蛋白基因的重组腺病毒。结果：通过PCR、序列测定和Western印迹杂交鉴定，确认该重组腺病毒表达载体可正确表达脑红蛋白。结论：成功地构建了表达NGB基因的重组腺病毒载体，为深入开展脑红蛋白的功能研究以及用于缺血性脑损伤疾病的基因治疗奠定了基础。