IL—6／IL—2融合蛋白（CH925）在大肠杆菌中高效表达

本文设计重组ＩＬ－６／ＩＬ－２的嵌合基因，选取合适的中间接头，并对ＩＬ－６及ＩＬ－２功能区基因进行修饰，运用ＰＣＲ拼接技术，克隆了中间接头与ＩＬ－２功能区基因，再与ＩＬ－６基因连接后转化Ｅ．ｃｏｌｉ经序列分析证实获得ＩＬ－６／ＩＬ－２融合蛋白表达载体ｐＦＩＬ－６／２经诱导表达ＩＬ－６／ＩＬ－２占菌体总蛋白３２％，融合蛋白分子量约为３７ｋＤ，分别以ＩＬ－６及ＩＬ－２依赖株测得融合蛋白具有双功能生物活     

IL—6／IL—6R系统与重组IL—6—PE40融合蛋白

ＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒ系统与重组ＩＬ－６－ＰＥ４０融合蛋白军事医学科学院附属医院免疫学研究室（北京１０００３９）奚永志ＩＬ－６／ＩＬ－６－ｒｅｃｅｐｔｏｒｓｙｓｔｅｍａｎｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎＩＬ６－ＰＥ４０ｅｘｏｔｏｘｉｎｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ...     

IL6／IL6R系统介导重组IL6—PE40外毒素融合蛋白靶向？…

目的：利用细胞因子－受体的持异性结合来靶向杀伤肿瘤是新一代导向杀伤策略。鉴于白血病细胞异常高地表达ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ系统,而正常造血细胞几乎不表达抑或微量表达这一事实。我们率先在国际开展了利用ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ系统介导重组ＩＬ６－ＰＥ４０外毒素融合蛋白特异性杀伤高表ＩＬ６Ｒ白血病新策略的科学性及可行性的探讨。方法：１．ＩＬ６－ＰＥ４０外毒素融合蛋白特异性杀伤高表ＩＬ６Ｒ白血病新策略的科学性及可行性的探     

IL－2和IL－6融合蛋白的分子生物学特性的研究

本文应用酶联免疫吸附技术对ＩＬ－６／２融合蛋白（ＦＰＩＬ－６／２）进行了定性、定量分析，测定其等电点，并对该蛋白的表位、柔性和抗原性进行了计算机模拟。ＥＬＩＳＡ测试结果表明：融合蛋白ＩＬ－６／２含有ＩＬ－２和ＩＬ－６两个结构域，可分别与ＩＬ－２和ＩＬ－６单克隆抗体结合，且两个结合无明显空间排阻效应，这与计算机的表位、柔性和抗原性分析结果一致。从计算机模拟也可以看出ＦＰＩＬ－６／２的抗原性与ＩＬ－２和ＩＬ－６的一致性，而且接头区抗原性较低，这为该蛋白的实际临床应用提供了一定的保证。     

人白细胞介素6在大肠杆菌中的高效表达

应用PCR和重组DNA技术,结合人工合成寡核苷酸引物,成功地构建成人白细胞介素6高效表达克隆,命名为pBMhIL6,使人rIL-6编码基因受控于P_RP_L串联启动子和人工合成SD序列,且以TAA终止密码子代替原人IL-6的TAG,在E.coli中获得人rIL-6的高效表达。SDS-PAGE和凝胶密度扫描分析证明表达的人rIL-6蛋白占E.coli总菌体蛋白的28%,分子量为21KDa,Western Blot证明其能特异地与抗IL-6 McAb结合。人rIL-6诱导表达动力学研究表明在42℃条件下诱导6小时,表达达峰值。不同菌株表达人rIL-6及其生长状态影响研究提示以E.coli DH5a生长菌密度至0.7时,人rIL-6诱导表达产率较高。以7TD1细胞株~3HTdR法测定表达的人rIL-6的HPGF活性为5×10~6u/L菌液。     

IL—2和IL—6融合蛋白的分子生物学特性的研究

本文应用酶联免疫吸附技术对ＩＬ－６／２融合蛋白进行了定性，定量分析，测定其等电点，并对该蛋白的表位，柔性和抗原性进行了计算机模拟，ＥＬＩＳＡ测试结果表明；融合蛋白ＩＬ－６／２含有ＩＬ－２和ＩＬ－６两个结构域，可分别与ＩＬ－２与ＩＬ－６单克隆抗体结合，且两个结合无明显空间排阻效应，这与计算机的表拉，柔性和抗原性分析结果一致。     

huIL-6-GM-CSF(9-127)融合蛋白的表达及活性测定

目的　构建及表达具有huIL 6和huGM CSF双重生物学活性的huIL 6 GM CSF(9- 12 7)融合蛋白分子。方法　应用PCR技术对huIL 6和huGM CSF的基因分别加以改造 ,同时在二者之间加上连接肽序列 (G G S G S) 3 ,克隆PCR产物 ,并构建成pBV2 2 0 IL 6 GM CSF(9- 12 7)表达质粒 ,将表达质粒导入E .coliDH5α中 ,诱导表达融合蛋白。通过QSepharoseH .P .离子交换柱和SephacrylS 2 0 0分子筛柱二步柱纯化以获取目的蛋白。使用MTT法测量其huIL 6和huGM CSF生物学活性。结果　pUC18 IL 6 GM CSF(9- 12 7)的序列与理论设计完全一致 ,表达质粒在E .coliDH5α中得到高效表达 ,表达的融合蛋白占总蛋白含量的 30 %以上 ,表达产物以包涵体的形式存在。通过QSepharoseH .P .离子交换柱和SephacrylS 2 0 0分子筛柱二步柱纯化及复性后获得目的蛋白 ,其纯度达到 96 %以上。融合蛋白具有huIL 6和huGM CSF的双重生物学活性 ,其促进huIL 6依赖细胞株B9和huGM CSF依赖细胞株TF 1增殖的比活性分别为 2 .86× 10 7U/mg和 3.33× 10 8U/mg。结论　获得了具有较高纯度和双重生物学活性的huIL 6 GM CSF(9- 12 7)融合蛋白     

未知酪氨酸激酶对骨髓瘤细胞中IL—6诱导Ras／MAPK／NF—IL—6途径活化的调节作用

目的 研究两条主要的IL-6信号转导途径-JAK/STAT和Ras/MAPK/NFG-IL-6在人骨髓瘤细胞系KM-3中的诱导活化情况和调控机制。方法 首先分别采用凝胶阻滞电泳（EMSA）和免疫沉淀（IP）方法检测参与 IL-6信号转导功能的转录因子（STAT3、NF-IL-6）和蛋白激酶（JAK1、MAPK）在KM-3细胞中的诱导活化情况。然后采用特异性酢氨酸蛋白激酶 抑制剂Genistein作用于KM-3细胞,观察酢氨酸磷酸化作用对KM-3细胞中IL-6信号转导功能的影响。结果 IL-6刺激后,KM-3细胞中只出现了Ras/MAPK/NF-IL-6信号转导途径的诱导激活,而JAK/STAT途径则不参与IL-6在KM-3细胞中的信号转导功能。Gwenistein的作用可明显抑制Ras/MAPK/NF-IL-6途径的活化。结论 一种目前尚无法确定的非JAK1酪氨酸蛋白激酶可参与并调节Ras/MAPK/NF-IL-6信号转导途径在KM-3细胞中的诱导活化。     

GM—CSF／IL—3融合蛋白的研究开发进展

本文述及ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３融合蛋白的基因构建和酶母及大肠杆菌的表达工作、着重综述了该融合蛋白的体外生物学活性，动物体内实验及临床试验研究，并涉及其毒副作用和临床应用的安全性问题。     

人可溶性IL－6受体在大肠杆菌中的克隆与表达

根据ｓＩＬ－６Ｒ的结构特点及其功能分析，利用ＰＣＲ技术选择性地扩增两个不同长度的ＩＬ－６ＲｃＤＮＡ胞外片段。经ＤＮＡ测序和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实后，定向插入原核表达载体ｐＥＴ－３ａ中，获得了中、高效表达。     

重组人IL—6在E.coli中的高效表达

通过计算机分析设计,人工合成了寡核苷酸引物,并优化了翻译起始区,应用PCR及重组DNA技术,获得了重组人白细胞介素6(IL—6)高效表达工程菌。从全菌SDS—PAGE考马斯亮蓝染色后薄层密度扫描分析表达产率为38.6％,分子量为2.1×10~4。以IL—6依赖性的小鼠杂交瘤细胞株B9用MTT法测定表达重组人IL—6的HGF活性为2×10~7U/L菌液。不同菌株表达重组人IL—6研究表明,以E.coli DH5α/pBV IL—6表达产率最高。     

突变型人重组IL—2的研制

人白细胞介素—2(Interleukin 2,IL—2)含有3个半胱氨酸(Cys),其中第58位和第105位Cys形成二硫键,第125位Cys的巯基游离。应用PCR和定点突变技术将编码125位Cys的密码子突变成编码丙氨酸(Ala)的密码子,将此突变基因(hIL—2a)受控于P_RP_L串联启动子和人工合成SD序列,在E.coli中获得高效表达,用凝胶过滤法分离表达产物获得新型白细胞介素2[rIL—2(125-Ala)],其比活性达1×10~7IU/mg蛋白。     

高活性人重组双体GM—CSF在大肠杆菌的表达和鉴定

利用基因融合与基因工程技术,将两个粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)基因经白细胞介素—3(IL—3)的N端亲水序列串联起来,插入表达质粒载体,在大肠杆菌中高效表达出含凝血酶识别序列的MS2—双体GM—CSF融合蛋白。表达蛋白经凝血酶消化后,可去除MS2细菌蛋白,获高活性的双体GM—CSF分子(G2)。利用GM—CSF依赖性细胞株TF—1检测活性表明,G2的比活性高于单体GM—CSF的10倍以上,为研制新一代GM—CSF提供了新的途径。     

人重组巨噬细胞移动抑制因子在大肠杆菌的高效表达与鉴定

利用ＰＣＲ技术，从人Ｔ细胞ｃＤＮＡ文库中扩增巨噬细胞移动抑制因子的ｃＤＮＡ经与大肠杆菌表达载体重组，构建成不同表达克隆，在大肠杆菌高效表达成功ＭＩＦ融合蛋白，占细菌总蛋白的３２％－６０％，经纯化的ＭＩＦ产物纯度可达９８％，其氨基酸组成分析与理论值一致。     

四种hGM-CSF/IL-6融合蛋白的基因构建、表达及活性比较

目的 构建及表达具有hGM-CSF和hIL-6双重生物学活性的hGM-CSF／IL-6融合蛋白分子。方法 应用PCR技术对hGM-CSF和hIL-6的基因分别加以改造，同时在二者之间加上连接肽序列(G-G-S-G-S)3，克隆PCR产物，并构建成克隆有4种融合蛋白基因的pBV220表达质粒，4种融合蛋白分别是GM-CSF(9～127)-IL-6(29～184)(简称GII)、GM-CSF(9～127)-IL-6(1～184)(简称GL2)、GM-CSF(1-127)-IL-6(1—184)(简称GI3)、GM-CSF(9-127)-IL-6(24～184)(简称GI4)，表达质粒分别导入E．coli BL-21中诱导表达。通过Q Sepharose HP离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛柱二步柱纯化以获取目的蛋白。使用hGM—CSF依赖细胞株TF1和hIL-6依赖细胞株B9通过MTT法测量融合蛋白的生物学活性。结果 对4种融合蛋白基因的测序结果表明，其序列与理论设计完全一致，表达质粒在E．coli BL-21中均得到高效表达，表达的融合蛋白均占到总蛋白含量的30％以上，表达产物以包涵体的形式存在，通过Q Sepharose HP离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛柱二步柱纯化及复性后获得4种目的蛋白，其纯度均达到95％以上。活性测定结果表明4种融合蛋白均具有较高的hGM-CSF和hIL-6的双重生物学活性。结论 获得了具有较高纯度和双重生物学活性的GM-CSF／IL-6融合蛋白。     

恙虫病东方体58kDa热休克蛋白与47kDa外膜蛋白的基因嵌合及58-47嵌合基因在大肠杆菌中的表达

采用PCR方法 ,从恙虫病东方体Karp株基因组DNA中扩增 5 8kDa热休克蛋白的基因 ,将该基因分别与原核表达载体pQE30及 4 7kDa外膜蛋白的基因重组质粒 (pQE30 4 7)连接 ,构建pQE30 5 8及pQE30 5 8 4 7重组质粒 ,用重组质粒转化大肠杆菌。SDS PAGE显示 ,pQE30 5 8和pQE30 5 8 4 7转化的大肠杆菌分别产生一 5 8kDa重组蛋白和一 90kDa的双抗原 (5 8- 4 7)融合蛋白。免疫印迹分析显示Karp株免疫血清能特异识别 5 8kDa重组蛋白和 90kDa融合蛋白 ,90kDa融合蛋白既与 4 7kDa重组蛋白也与 5 8kDa重组蛋白的免疫血清特异反应 ,5 8kDa与 4 7kDa重组蛋白也被 90kDa融合蛋白免疫血清所识别。研究结果证明 5 8 4 7融合蛋白具有恙虫病东方体Karp株 4 7kDa外膜蛋白和 5 8kDa热休克蛋白的抗原特性     

弓形虫ROP2基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :构建弓形虫棒状体蛋白 (ROP2 )基因重组质粒并在大肠杆菌中表达 ,用于筛选弓形虫新的诊断抗原和疫苗分子。方法 :根据ROP2基因已知序列 ,设计合成一对引物 ,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出ROP2基因片段 ,再克隆到pGEX 4T 1质粒 ,重组质粒经酶切及PCR鉴定 ,而后进行测序 ;重组质粒在大肠杆菌BL2 1 (DE3)中进行ITPG诱导表达 ,表达产物经SDS PAGE及WesternBlot分析。结果 :ROP2基因PCR产物大小与预期相符 ,约 1 0 4 3bp ,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子 ,测序结果与已知序列基本吻合 ;SDS PAGE及免疫印迹显示ROP2融合蛋白表观分子量约为 5 5kDa ,表达产物约占菌体总蛋白1 7% ,具有一定的免疫反应性。结论 :克隆并表达了弓形虫ROP2基因 ,为下一步弓形虫诊断及疫苗研究奠定了基础     

乙型肝炎病毒preS抗原在大肠杆菌中的高效表达与鉴定

利用ＰＣＲ和基因重组技术构建了乙型肝炎病毒完整ｐｒｅＳ抗原高效表达克隆，该克隆在大肠杆菌中表达一分子量约３１ｋＤ的融合蛋白，由ＭＳ２、白细胞介素３Ｎ端１４个氨基酸接头和ｐｒｅＳ抗原组成，在ＩＬ－３Ｎ端与ＭＳ２连接处有凝血酶识别位点，可被该酶切开。     

抗体-白细胞介素2融合蛋白183B2scFv-Interleukin 2的表达及活性检测

目的在哺乳动物细胞内表达抗体细胞因子融合蛋白183B2scFv Interleukin2,为卵巢癌提供一种新的治疗方法。方法通过基因工程的方法将两段基因IL2和183B2scFv开放读框的编码序列克隆在一起,在CHO K1细胞内人巨细胞病毒启动子的作用下表达可溶性融合蛋白,并检测其对肿瘤细胞的靶向性。结果采用哺乳动物细胞表达,系统表达的这种小分子融合蛋白,既保留了与卵巢癌OC183B2抗原结合的特性,又保持了IL2的生物学活性。融合蛋白在细胞培养上清中保持稳定,更重要的是融合蛋白将IL2靶向表达OC183B2抗原的卵巢癌细胞表面化的同时,又能刺激IL2依赖细胞株的增殖,从而诱发局部有效的抗肿瘤反应。既提高了融合蛋白的穿透组织能力和肿瘤组织部位的浓聚,又避免了大剂量全身应用细胞因子引起的副作用。结论真核表达系统表达的融合蛋白具有很好的生物学活性。