恶性疟原虫乳酸脱氢酶活性测定及在药物疗效监测方面的初步观察

目的 探讨疟原虫乳酸脱氢酶（Plasmodium lactate dehydrogenase,pLDH)活性与原虫密度，培养时间的关系。以及在监测药物疗效等方面的作用。方法 利用酶比色法对不同原虫密度不同培养时间以及药物治疗前后患者的血样进行pLDH活性检测。结果 pLDH的活性随恶性疟原虫感染率的提高，培养时间的增加而明显地升高，最大活性是在虫体培养36-48h之间，虫体主要处在裂殖体期和滋养体期；混合感染（恶性疟原虫和间日疟原虫）患者经药物治疗后血液中pLDH活性明显降低，治疗5d后已检测不到pLDH的活性。结论 pLDH活性检测对于疟原虫克隆株鉴定，药物的疗效监测等方面具有一定的应用价值。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶活性的初步检测

以３－乙酰吡啶（ＡＰＡＤ）作为辅酶而设计的数量酶比色法检测恶性疟原虫乳胶脱氢酶活性。结果显示：ＰＬＤＨ的ＯＤ值随恶性疟原虫率的提高而明显升高,特别是当原虫率达１％以上时,ＰＬＤＨ的ＯＤ值更显著,但在低原虫率（０．４％以下）时,阳性血样与阴性血样ＯＤ值有时错位或不能区别。同时显示,同样的原虫率血样裂殖体（Ｓ）和大滋养体（Ｔ）期比环状体（Ｒ）期ＰＬＤＨ的ＯＤ值明显升高。     

重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶的纯化及免疫活性测定

目的:研究恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)重组蛋白纯化和复性的最佳条件。方法:重组质粒PGEX-4T-1-LDH在E.coli BL21中表达，表达产物用酶裂解法洗涤、变性、复性、Q-Sepharose High Performance离子交换层析方法纯化。结果:获得具有生物活性的蛋白，其纯度达到95％。结论:此方法操作简便，纯化效果好。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其特性鉴定

为制备抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶（LDHp）单克隆抗体（McAb）,并对其特异性进行鉴定,用纯化的LDHp重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,筛选出分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,ELISA、Westen blotting试验分析其特导性。结果,制备出2A5和 1H10两株能稳定分泌抗LDHp　McAb的杂交瘤细胞株,两株单抗均为IgG2b,2A5和1H10培养上清的ELISA效价分别为1:512和1:256,腹水效价分别为1:25600和1:12800,两株单抗与间日疟、红细胞、弓形虫、日本血吸虫等抗原均不发生交叉反应,能识别恶性疟原虫的33Kda虫源蛋白。证明制备的抗LDHp杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗。     

用乳酸脱氢酶为靶分子的免疫层析技术检测恶性疟原虫

目的建立一种免疫胶体金层析(GICA)法用于恶性疟原虫的检测。方法采用杂交瘤技术制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDHpf)单抗，利用筛选出来的单抗制成诊断恶性疟原虫的免疫层析条，以镜检和PCR法为对照，用GICA条检测门诊“四热”病人血样，评价其敏感性和特异性，并对其稳定性进行了初步研究。结果筛选出4株抗LDHpf单抗．间接ELISA表明4株单抗仅与恶性疟原虫发生反应，而与间日疟原虫、红细胞蛋白、刚地弓形虫和日本血吸虫不发生交叉反应。Western—blot结果显示4株单抗能识别恶性疟原虫相对分子质量约为33000处的虫源蛋白。以镜检法和PCR法为标准，CICA条检测恶性疟原虫的敏感性分别为88.37％和86．67％．DICA与镜检法的符合率均为91．55％。结论GICA检测恶性疟原虫简易快速、灵敏度高，无需特殊仪器设备，有望成为一种恶性疟原虫快速免疫诊断试剂盒。     

间日疟原虫乳酸脱氢酶的表达、纯化及免疫活性的鉴定

目的 在大肠杆菌中表达间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白,对重组蛋白进行纯化并测定其免疫活性.方法 将构建的LDH/pGEX-4T-1重组菌BL21接种于LB培养基中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,ELISA检测血清效价,Western-blotting鉴定其免疫活性.结果 重组质粒在大肠杆菌中表达PvLDH与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白,表达产物主要以包涵体形式存在,经复性、纯化后免疫小鼠,能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,ELISA法测效价为1:51200,Western-blotting结果显示该血清能特异性与间日疟和恶性疟患者全血发生反应,而不能与正常人起交叉反应.结论 PvLDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性和免疫原性.     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶（GDH）与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白，测定重组蛋白的免疫活性。方法：采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫（海南株）GDH基因，双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达，重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清，并用琼脂双向扩散法检测效价，ELISA、Westernblotting检测重组抗原的免疫活性。结果：获到了重组表达的抗原蛋白，表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应，并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答，免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1：16。结论：恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

用乳酸脱氢酶为靶分子的免疫层析技术检测恶性疟原虫

目的 建立一种免疫胶体金层析(GICA)法用于恶性疟原虫的检测。方法 采用杂交瘤技术制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDHpf)单抗,利用筛选出来的单抗制成诊断恶性疟原虫的免疫层析条,以镜检和PCR法为对照,用GICA条检测门诊"四热"病人血样,评价其敏感性和特异性,并对其稳定性进行了初步研究。结果 筛选出4株抗LDHpf单抗,间接ELISA表明4株单抗仅与恶性疟原虫发生反应,而与间日疟原虫、红细胞蛋白、刚地弓形虫和日本血吸虫不发生交叉反应。Western-blot结果显示4株单抗能识别恶性疟原虫相对分子质量约为33000处的虫源蛋白。以镜检法和PCR法为标准,GICA条检测恶性疟原虫的敏感性分别为88.37%和86.67%,GICA与镜检法的符合率均为91.55%。结论 GICA检测恶性疟原虫简易快速、灵敏度高,无需特殊仪器设备,有望成为一种恶性疟原虫快速免疫诊断试剂盒。     

儿童恶性血液血清免疫抑制酸性蛋白及乳酸脱氢的测定

采用单向琼脂免疫扩散法，检测小儿恶性血液病患者、正常儿童血清免疫抑制酸性蛋白及ＬＤＨ水平。结果表明：恶性血液病患者血清ＩＡＰ及ＬＤＨ明显升高。ＩＡＰ、ＬＤＨ异常率分别为：ＡＬＬ组９０％、７３．３％；ＡＮＬＬ组８９．４％、７８．９％；淋巴瘤组８０％、１００％。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白,测定重组蛋白的免疫活性。方法采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫(海南株)GDH基因,双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,并用琼脂双向扩散法检测效价,ELISA、Western blotting检测重组抗原的免疫活性。结果获到了重组表达的抗原蛋白,表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1∶16。结论恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的研制与胶体金免疫层析方法的建立

目的 制备抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)的单克隆抗体(McAb),将其标记胶体金,建立一种诊断恶性疟的胶体金免疫层析方法。方法 用基因重组的GDH蛋白免疫Balb/C小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备McAb,测定其免疫球蛋白亚类及其亲和力。用protein-G亲和层析纯化抗体并用胶体金标记,建立胶体金免疫层析方法,选择最佳反应模式对疟疾血样进行检测。结果 筛选出6株能稳定分泌抗GDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株,单抗亚类均为IgG₁,亲和常数(κ)介于1×10^-8~2.82×10^-10。以镜检法为参照,建立的胶体金免疫层析方法检测恶性疟的敏感性为86.66%,特异性为96.43%。结论 建立的胶体金免疫层析方法检测恶性疟快速、简便、可靠,有望开发成为恶性疟快速诊断试剂盒。     

恶性疟原虫体外抑制实验方法的改进

以恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9免疫兔血清为待测血清,将起始原虫率从1%降至0.2%～0.5%,采用2种方法作对比,即一组每24 h更换培养液、加入免疫血清,另一组72 h内不更换培养液也不加免疫血清试验方法.培养至72 h,涂片,油镜下计数,计算原虫感染率和抑制率.结果2组的抑制率相近,经统计分析无显著差异.测定不同剂量抗原免疫血清的抑制率,结果显示抑制率与免疫血清中特异抗体滴度呈正相关,2种方法的结果无显著差异.研究表明通过降低起始原虫率可将常规体外抑制实验由需每天换液改为72 h不换液.     

云南高疟区抗疟药物临床研究中适宜恶性疟原虫密度范围的观察

通过对云南一恶性疟暴发点病人血液中无性体和有性体的观察发现,当地恶性疟无性体密度初发者几何平均值为1798/μl,95％可信限为1141～2836/μl,复燃者的几何平均密度为6540/μl.95％可信限为4230～10097/μl;初发者的无体密度比复燃者的低,复燃者高密度居多。有性体密度初发者几何平均值为158/μl,95％可信限为102～247/μl;初发者有体性密度比复燃的高。初发者有性体率为57.69％,复燃者仅为9.1％。原虫无性体与有性体密度间不存在统计相关。建议在选择无服抗疟药史者为观察对象.以有服抗疟药史者为观察对象,以及两类病人同时均作为观察对象时,宜分别以1000～3000/μl,4000～10000/μl和1000～10000/μl为无性体密度的适宜范围。而观察有性机体时,则以100～300/μl为其适宜密度范围。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶融合蛋白复性及纯化的研究

目的建立恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)融合蛋白质的复性和纯化方法。方法将含有恶性疟原虫GDH全长基因的融合蛋白表达质粒GDH/ pGEX-4T-1转化到宿主菌BL21,该GDH/GST融合蛋白在IPTG的诱导下获得高水平的表达,经SDS-PAGE分析表达产物主要为不溶性的包涵体。经超声酶解法、离心、变性剂/去污剂洗涤后获得包涵体。包涵体经8 mol/L尿素变性后分别采用分子筛柱层析、透析和稀释3种方法复性,并通过浊度分析、非还原SDS-PAGE等方法比较、优化复性方法和条件。复性后的GDH/GST融合蛋白经过不同柱层析方法进行纯化。结果经SDS-PAGE分析表明,GDH/GST融合蛋白表达量可占到菌体总蛋白的25%左右;浊度分析表明:稀释复性法优于其它两种方法,同时20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、pH8.5及GSSG/GSH=1∶10为该融合蛋白稀释复性的最佳条件,其复性回收率可达90%以上。复性产物采用二步阴离子交换层析可获得较好的纯化效果。结论通过稀释复性,二步阴离子交换层析可获得高纯度、具有天然空间构象的重组GDH/GST融合蛋白。     

恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的 了解恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）谷氨酸脱氢酶（GDH）基因全编码区核苷酸序列变异情况。方法 PCR扩增恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）GDH基因全编码区,产物经EcoRI SalI酶切后,定向克隆至pGEX-4T-1质粒,采用Sanger双脱氧链末端终止法测序,与其它生物GDH进行同源性分析。结果 成功扩增了恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）GDH编码基因,大小为1410bp,无内含子,与Thailand株GDH基因相比,两有2个碱基不同,推导的氨基酸序列完全相同;与蓝氏贾第鞭毛虫,克鲁氏锥虫和梭状芽孢杆菌GDH的同源性分别为57.90%(260/449),56.51%(243/430),42.05%(164/390);与人的GDH-1,GDH-2的同源性分别为29.02%（101/348）,28.73%(100/348)。结论 FCC1/HN株与Thailand株GDH高度同源,疟原虫GDH明显不同于其它生物GDH。     

恶性疟原虫体外培养的同步化方法

本文就恶性疟原虫体外培养的同步化方法加以综述,主要对恶性疟原虫的同步化方法,如传统的浓度分离法、渗透压分离法、Percoll梯度法、温度周期法、阿非迪霉素法,及近几年发展起来的磁性分离法及流式细胞分析仪法进行了介绍.