一株特殊功能的抗人CD40单克隆抗体的获得及其生物学特性分析

目的：研制功能性抗人ＣＤ４０单克隆抗体,从而探讨其对Ｂ细胞、ＤＣｓ表达的ＣＤ４０分子激发所产生的生物学效应。方法：采用细胞融合、单克隆抗体筛选、荧光标记、免疫印迹和竞争抑制等方法获得鼠抗人ＣＤ４０ｍＡｂ,以细胞增殖、分化抗原表达观察ＣＤ４０ｍＡｂ对Ｂ细胞和ＤＣｓ的作用诳应。结果：经表型分析、Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定和竞争抑制试验,证实５Ｃ１１是识别人ＣＤ４０分子的特异性单抗;５Ｃ１１与转     

鼠抗人OX40功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

目的：研制功能性鼠抗人OX40单克隆抗体。方法：以转人OX40的转基因细胞L929-OX40为免疫原，常规免疫6—8周龄的雌性BALB／c小鼠；采用B淋巴细胞融合技术，将免疫小鼠脾脏细胞与SP2／0融合，以L929-OX40转基因细胞及PHA活化的T细胞为抗体筛选阳性细胞，经免疫荧光标记分析对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养；采用快速定性试纸法及竞争抑制结合试验分析了该单抗的亚类及抗原识别位点；采用MTT法分析单抗在体外对T细胞的促增殖效应以及ELISA分析活化T细胞分泌的细胞因子。结果：获得1株持续、稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为7E11)，该单抗能特异性地识别人OX40分子和介导有效的共刺激信号，体外促进活化的T细胞增殖和细胞因子的分泌。结论：成功研制成一株能分泌功能性鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤，该抗体特异性地识别人OX40分子并具有在体外协同刺激T细胞的作用。     

5株鼠抗人CD28单克隆抗体的研制及生物学特性的研究

目的：制备鼠抗人CD28分子功能性单克隆抗体，研究其对T细胞活化、增殖及信号转导等方面的生物学效应。方法：以天然高表达CD28分子的人多发性骨髓瘤细胞株U266和小鼠淋巴瘤细胞转人CD28基因细胞株CD28-T分别作为免疫原和检测细胞株，采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行单抗的研制；以快速定性试纸法鉴定单抗亚类；腹水诱生法和免疫亲和层析法进行单抗的制备和纯化；经间接免疫荧光法分析单抗对不同细胞膜表面CD28分子的识别；采用竞争抑制法分析单抗识别的抗原位点；利用^3H-TdR掺入法分析单抗对PBTC的刺激效应和免疫荧光法分析PBTC活化前后的表型变化。结果：成功获得5株鼠抗人CD28功能性单克隆抗体，分别命名为2D5、2F5、3136、3F8和8G8，其中2D5为IgG2a亚类，其余均为IgG1亚类；流式细胞仪分析结果显示，5株单抗均能良好识别CD28-T、U266、XGI和Jurkat细胞表面的CD28分子；竞争抑制试验表明，2D5和8G8能完全阻断标准抗人CD28单抗与U266膜CD28分子的结合，其余3株为部分阻断；^3H-TdR掺入法实验结果表明，单抗8G8联合激发型CD3单抗能明显促进PBTC的增殖，刺激指数为7．4，活化细胞CD4、CD25、ICOS、4IBB及OX40分子的表达上调。结论：5株单抗均为抗人CD28单克隆抗体，具有重要的基础研究及潜在的临床应用价值。     

一株特殊功能的抗人CD40单克隆抗体的获得及 其生物学特性分析①

目的研制功能性抗人CD40单克隆抗体，从而探讨其对B细胞、DCs表达的CD40分子激发所产生的生物学效应。方法采用细胞融合、单克隆抗体筛选、荧光标记、免疫印迹和竞争抑制等方法获得鼠抗人CD40mAb，以细胞增殖、分化抗原表达观察CD40mAb对B细胞和DCs的作用效应。结果经表型分析、Western blotting鉴定和竞争抑制试验，证实5C11是识别人CD40分子的特异性单抗；5C11与转导CD32的L细胞（LCD32）联合IL-4能使扁桃体B细胞扩增并形成集落；5C11能介导树突状细胞（DCs）的扩增和分化成熟。结论用5C11与LCD32建立的CD40培养体系，能使B细胞长期生存和增殖，为体外研究B细胞提供有效手段；5C11诱导外周单核细胞分化成熟为树突状细胞，这一发现为体外大规模扩增可用于治疗的DCs提供了新的手段，因而5C11是一株具有特殊功能和重要应用价值的单克隆抗体。     

两株鼠抗人PD-1单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的: 制备鼠抗人PD-1单克隆抗体(mAb)及鉴定其生物学特性.方法: 以基因转染细胞PD-1/L929为免疫原, 免疫BALB/c小鼠;采用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合, 经选择性克隆化培养及流式细胞术(FCM)分析, 筛选分泌鼠抗人PD-1分子mAb的杂交瘤细胞株;采用Ig亚型快速定性试纸法、染色体核型分析、 Western blot、竞争结合抑制试验及肿瘤细胞株测定等方法对mAb进行生物学特性鉴定.结果: 获得了2株持续稳定分泌鼠抗人PD-1mAb的杂交瘤细胞株, 命名为1F2和5F10.对其生物学特性的鉴定结果表明, 均为条带相对分子质量在(Mr)55 000左右的免疫球蛋白, 具有不同的PD-1结合位点;1F2 mAb可识别SKHep-1和7721细胞株表面的PD-1分子, 而5F10可识别Raji细胞株的PD-1分子.结论: 成功获得了2株鼠抗人PD-1杂交瘤及其分泌的mAb.     

鼠抗人OX40L功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

目的　鼠抗人OX4 0L分子功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定。方法以高表达人OX4 0L分子的转基因细胞L92 9/OX4 0L为免疫原 ,常规免疫BALB/c小鼠 ,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合 ,并以L92 9/OX4 0L为阳性抗体筛选细胞 ,L92 9/mock为阴性抗体筛选细胞 ,经免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养 ,筛选出特异分泌鼠抗人OX4 0L分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ;采用Westernblot、Ig亚型快速定性试纸法、间接免疫荧光法、竞争结合抑制试验和3 H TdR增殖试验等对单抗进行生物学特性的鉴定。结果　成功获得 3株持续、稳定分泌鼠抗人OX4 0L单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,命名为 9H10、4C12和 1G1。对单抗的生物学功能的研究结果表明 ,3株单抗均能识别活化B细胞和成熟DC表达的OX4 0L分子 ,且能抑制成熟DC对T细胞的促增殖作用 ,并与阻断型抗人B7 1单抗具有协同作用。结论　获得的 3株分泌鼠抗人OX4 0L功能性单克隆抗体的杂交瘤 ,所分泌的抗体具有特异性地识别人OX4 0L分子并能阻断OX4 0 /OX4 0L共刺激信号及抑制DC对T细胞的激发作用。     

鼠抗人CD28分子单克隆抗体的研制及生物学特性研究

目的 制备鼠抗人CD28分子的单克隆抗体（mAb),研究其在T细胞的活化、增殖及信号传导中的作用。方法 以小鼠淋巴瘤细胞转染人CD28基因的细胞株（CD28-T）为免疫原,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,获取分泌特异性mAb的杂交瘤细胞株,以体内诱生法生产腹水,并以免疫亲和层析法对其纯化,以快速定性试纸法鉴定mAb的Ig亚类,竞争抑制法分析mAb识别的抗原表位,3H-TdR掺入法研究mAb对T细胞的刺激效应,结果 成功地获得了5株分泌特异性抗入CD28mAb的杂交瘤细胞株,鉴定的1株（克隆18G8）属IgG2a,腹水效价（流式细胞仪分析）达1：2400以上,该mAb能60%阻断标准鼠抗入CD28抗体与相应抗原的结合,提示其识别的抗原表位与标准mAb不完全相同,mAb18G8可取代B7-1分子介导的协同刺激信号,促进人外周血T细胞增殖（ST=7）。结论 18G8是12株功能性mAb,具有重要的研究和应用价值。     

一株抗人BLys单克隆抗体的制备及其生物学功能研究

研究以稳定高表达BLys的基因转染细胞L-BLys为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,L-BLys细胞和天然表达BLys的HL60细胞为抗体筛选阳性细胞株,经免疫荧光标记分析反复筛选和以有限稀释法反复克隆化培养。将获得的克隆4F7培养细胞注射入经致敏的小鼠体内,-抽取的腹水经Protein G亲和层析柱纯化。将纯化所得的抗体作用于经BLys分子刺激的扁桃体B细胞,3H-TdR检测细胞的增殖效率。结果获得1株持续、稳定分泌鼠抗人BLys单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该细胞株所分泌的抗体能阻断膜型和可溶性BLys分子对扁桃体B细胞的促增殖作用。对这株单克隆抗体生物学功能的研究表明,这株单抗能特异性识别人BLys分子及阻断膜型和可溶性BLys发挥生物学活性。     

CD40和CD40配体的研究进展

ＣＤ４０是一种存在于Ｂ淋巴细胞、树突状细胞、造血前体细胞、上皮细胞及某些癌细胞表面的跨膜糖蛋白。由２７７个氨基酸组成，分子量为４５～５０ＫＤａ，是ＴＮＦ－Ｒ超家族成员。人ＣＤ４０基因定位于２０号染色体ｑ１１－３，小鼠基因位于２号染色体上。ＣＤ４０配体（ＣＤ４０Ｌ）由２６１个氨基酸构成，分子量为３４ＫＤａ，是ＴＮＦ超家族成员。基因位于ｘｑ２４。主要存在于活化的ＣＤ４＋Ｔ细胞表面，在ＣＤ８＋、嗜碱／肥大细胞表面也有表达。ＣＤ４０与ＣＤ４０Ｌ间的反应与Ｂ细胞活化、增殖、抗体的产生、生发中心的形成有关。反应的中断可导致免疫耐受，ＣＤ４０Ｌ缺陷可造成性联高ＩｇＭ综合征（ＨＩＭ）。     

抗人CD20单克隆抗体诱导Daudi细胞凋亡的功能研究

目的　观察由基因重组抗原制备的抗人CD2 0单克隆抗体 (CD2 0 McAb) 1- 2 8对B淋巴瘤细胞的促凋亡作用 ,并探讨其作用机理。方法　利用流式细胞术测定所获 1- 2 8单抗对标准CD2 0 FITC单抗的竞争抑制作用及对胞内游离钙的影响 ;通过电镜观察其诱导Daudi细胞凋亡后形态上的改变 ,免疫印迹实验显示Daudi细胞凋亡后功能上的变化。结果　 1- 2 8能明显竞争标准CD2 0 FITC单抗与Daudi细胞表面CD2 0分子的结合。电镜结果证实了 1- 2 8能够促进Daudi细胞发生凋亡的结论 ;实验结果显示Daudi细胞与 1- 2 8作用后胞内游离钙浓度明显升高 (P <0 .0 5 ) ,细胞内Bcl 2蛋白和caspase酶原的表达量下降 ,而Bax蛋白和caspase酶原降解的活性产物表达增加。结论　 1- 2 8能竞争结合Daudi细胞表面的CD2 0分子并诱导其发生凋亡     

CD40L/CD40轴的生物学功能及其与疾病的关系研究进展

CD40L／CD40为体内免疫反应系统中一对重要的共刺激分子,参与机体的体液和细胞免疫反应。CD40L主要表达在CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞和B细胞,CD40主要表达于B细胞、活化的单核／巨噬细胞、树突状细胞（DC）、上皮细胞等。CD40L／CD40轴对B细胞的活化、增殖、细胞因子的分泌及免疫球蛋白的类别转换起到了非常重要的作用。CD40L／CIMO相互作用也对细胞毒性T细胞前体的活化,维持调节性T细胞的动态平衡及诱导辅助性T细胞的分化等方面起重要作用。CIMOL／CIMO轴还参与多种免疫相关疾病的致病过程,如自身免疫性疾病、肝炎等,且在抗肿瘤免疫中起到重要作用。多种动物模型的建立为探究疾病病因、研究CIMOL／CIMO轴在疾病发生过程中的作用提供了重要的平台。     

两株新的鼠抗人OX40L单克隆抗体的研制及其生物学功能的初步研究

目的:鼠抗人OX40L分子功能性单克隆抗体(mAb)的研制及其生物学特性的鉴定。方法:以高表达人OX40L分子的基因转染细胞L929/OX40L为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,经流式细胞术(FCM)分析和多次克隆化培养,筛选出特异分泌鼠抗人OX40L分子mAb的杂交瘤细胞株;采用Westernblot、Ig亚型快速定性试纸法、染色体核型分析、竞争结合抑制试验、间接免疫荧光法和MTT增殖试验等对单抗的生物学特性进行鉴定。结果:获得2株持续、稳定分泌鼠抗人OX40LmAb的杂交瘤细胞株,分别命名为4D6和5C2。对mAb生物学功能的研究结果表明,2株mAb均能识别成熟DC细胞以及Jurkat、SHI-1、U937等白血病细胞株表面的OX40L分子。对其中SHI-1白血病细胞株增殖影响的实验显示,这2株抗体对SHI-1的增殖都具有一定的抑制作用。结论:成功地获得了2株鼠抗人OX40L功能性mAb杂交瘤,其所分泌的抗体能特异地识别人OX40L分子,并影响表达OX40白血病细胞株的体外增殖,为进一步研究OX40/OX40L的生物学功能奠定了基础。     

Characterization and application of two novel monoclonal antibodies against CD40L: epitope and functional studies on cell membrane CD40L and studies on the origin of soluble serum CD40L

CD40 ligand, a 33-kDa cell membrane molecule, a member of the tumor necrosis factor superfamily, is an important costimulatory molecule during immune response. Here, we report on two functional mouse anti-human CD40L monoclonal antibodies 1B1 and 4F1 characterized by flow cytometry, Western blotting, and competition assay. The antibodies bound to distinct CD40L epitopes and therefore resulted in different bioactivity. Both antibodies could induce CD4+ T-cell alloantigenic hyporesponsiveness ex vivo. The antibodies were matched to develop a two-site enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for soluble CD40L (sCD40L). Using this ELISA assay, we found major differences between plasma and serum sCD40L levels. Because the count of platelet sharply decreased in aplastic anemia (AA) and idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP), we further analyzed the sCD40L concentration in the plasma of AA and ITP patients. The results showed that the sCD40L in serum was much lower than that of healthy subjects. These data demonstrate that platelets seem to be a major contributor to sCD40L, though not the only source of sCD40L in serum.     

阻断型CD154抗体和CD80抗体生物学作用的研究

为比较阻断型抗人CD154单克隆抗体(1B1)和抗人CD80单克隆抗体(3H8)的单独及联合应用在调节CD4+T细胞对同种抗原的初次和再次免疫应答中的作用。采用免疫磁珠阴性选择法分离获得人外周血CD4+T细胞、将纯化的CD4+T细胞与刺激细胞体外共培养,通过检测培养上清IL-2、IFN-γ水平以及CD4+T细胞的增殖来评价1B1和3H8的生物学作用。结果显示,1B1和3H8单独或联合应用能不同程度地抑制混合淋巴细胞反应中CD4+T细胞对同种抗原刺激的增殖,下调CD4+T细胞分泌IL-2和IFN-γ,并且在再次反应中能有效诱导CD4+T细胞对同种抗原的免疫低反应性。因此,1B1和3H8的单独及联合应用在移植排斥的免疫干预及同种抗原免疫耐受的诱导中具有潜在的应用前景。     

The role of CD40 and CD154/CD40L in dendritic cells

In this review, we focus on the function of CD40–CD40L (CD154) interactions in the regulation of dendritic cell (DC)–T cell and DC–B cell crosstalk. In addition, we examine differences and similarities between the CD40 signaling pathway in DCs and other innate immune cell receptors, and how these pathways integrate DC functions. As research into DC vaccines and immunotherapies progresses, further understanding of CD40 and DC function will advance the applicability of DCs in immunotherapy for human diseases.     

抗人CD100单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的：研制可识别天然CD100分子的单克隆抗体（mAb)。方法：采用真核表达的CD100分子免疫BALB/c小鼠，以间接ELISA法筛选阳性杂交瘤，并分别用人急性T淋巴细胞性白血病细胞系MOLT-4，猿T淋巴细胞系MLA-144及猴EB病毒转化的B淋巴细胞系（BLCL），进行间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定mAb的特异性。结果：共获得7株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株。所有mAb均可识别人和猴细胞系的膜表面天然CD100分子，其中6株可识别猿细胞系膜表面的天然CD100分子，结论：成功地制备了7株抗CD100分子的特异性mAb。为研究人和猿，猴CD100分子的结构与功能提供了新的手段。     

一株识别肿瘤细胞上CD40突变体分子的单克隆抗体的研制及其生物学功能研究

目的:以本科室发现肿瘤细胞上表达的CD40 787AA突变为基础,研制识别肿瘤细胞上CD40突变体分子的单克隆抗体(mAb),并对其生物学特性作初步分析.方法:以转人CD40突变体转基因细胞L929-CD40mu为免疫原,免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠;采用B淋巴细胞融合技术,将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2/0融合,以L929-CD40mu转基因细胞为抗体筛选阳性细胞,免疫荧光标记法对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养;采用快速定性试纸法及竞争抑制结合试验分析该mAb的亚类及抗原识别位点;免疫印迹法对该mAb进行鉴定;采用MTT法分析mAb在体外对肿瘤细胞的抑制增殖效应以及PI-annexin V方法进行细胞凋亡测定.结果:获得1株稳定分泌鼠抗人CD40mu mAb的杂交瘤细胞株(命名为10C5),该mAb能特异性地识别人肿瘤细胞株H08910表达的CD40突变体分子,而不识别正常扁桃体B淋巴细胞及血管内皮细胞表达的CD40分子,并且能够在体外促进肿瘤细胞凋亡.结论:成功地研制出1株特异性识别肿瘤细胞上CD40突变体分子的mAb,该mAb具有体外抑制肿瘤细胞生长并促进其凋亡的作用.     

CD40/CD40L交联在CD4+T细胞诱导肿瘤细胞凋亡中的机制研究

目的探讨CD40/CD40L交联在CIK细胞中CD4 T细胞(CD4 CIK)诱导肿瘤细胞凋亡中的作用机制.方法体外扩增CIK细胞并纯化CD4 T细胞亚群,AnnexinV染色法观察CD4 CIK诱导肿瘤细胞凋亡的作用;半定量PCR、流式细胞法及ELISA法比较CD4 CIK激活前后CD40L的表达变化;将转染质粒pIRES2-EGFP-sCD40L的CHO细胞(CHO-sCD40L)与乳腺癌细胞T47D共孵育,监测24小时后其表面分子Fas的表达变化及对Fas介导凋亡的敏感性.结果CD4 CIK细胞可诱导肿瘤细胞凋亡,凋亡率随孵育时间和效靶比的升高而增加,且肿瘤细胞表面分子Fas水平升高,可从1.98%±0.23%升高到31.62%±7.07%;CD4 CIK细胞被激活后,CD40L表达水平均较激活前明显增加;成功转染的CHO-sCD40L细胞与T47D共培养后,T47D表面分子Fas可被诱导升高,加入CH-11 24小时后可观察到明显T47D细胞的凋亡.结论CD4 CIK可能通过CD40/CD40L交联提升肿瘤细胞表面功能性Fas表达来诱导其凋亡.     

抗B7-1和抗CD40L单抗延长小鼠皮肤移植物存活实验研究

将C57BL/6小鼠腹部全层皮肤移植于BALB/c小鼠中段背部,实验分组(每组7只小鼠):1.B7-1功能性单抗(4E5)治疗组;2.抗CD40L单抗(4F1)治疗组;3.4E5+4F1治疗组,各单抗以20㎎/㎏的剂量注入腹腔内;4.空白对照组,只注射同等量的生理盐水。注射时间为移植后0﹑1﹑3﹑5d,观察移植皮肤排斥情况。于术后第6天分别杀死各组受体和供体鼠,取受体脾细胞与供体作混合淋巴细胞反应(MLR)。收集培养6d的初次反应细胞,检测再次MLR。结果发现,与对照组相比,各单抗治疗组皮肤移植物存活时间延长(P<0.05﹚;与各单独应用4F1和4E5相比,联合使用4F1和4E5产生一定的协同作用,但未能进一步延长移植物的寿命(P>0.05)。初次单向MLR:4F1﹑4E5和4F1+4E5治疗组受体T淋巴细胞在MLR中表现对供体淋巴细胞特异性低反应性,能有效抑制T细胞对同种异体抗原的初次应答。再次单向MLR:4F1﹑4E5﹑4F1+4E5对供体淋巴细胞在再次反应中仍保持着对同种抗原的反应性,与对照组无显著差异,未能诱导特异性免疫耐受。综上结果证实,anti-CDB7-1mAb(4E5)和anti-CD40LmAb(4F1)作为新型免疫抑制剂,在一定程度上抑制细胞免疫应答,干预排斥反应。     

一株识别CD40分子新位点的单克隆抗体研制及生物学特性鉴定

目的：研制识别CD40分子新位点的单克隆抗体（mAb）。方法：以转人CD40转基因细胞L929-CD40为免疫原，常规免疫6—8周龄的雌性BALB／c小鼠；采用B淋巴细胞融合技术，将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2／0融合，以L929-CD40转基因细胞为抗体筛选阳性细胞，经免疫荧光标记分析对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养；采用快速定性试纸法及竞争抑制结合试验分析了该mAb的亚类及抗原识别位点；采用MTT法分析mAb在体外对肿瘤细胞的促增殖效应、ELISA法测定细胞因子分泌以及PI染色分析细胞周期。结果：获得1株持续、稳定分泌鼠抗人CIM0mAb的杂交瘤细胞株（命名为286），该mAb能特异性地识别人CD40分子并较好的识别肿瘤细胞株H08910表达的CD40分子并能够体外促进肿瘤细胞增殖。结论：成功地研制1株识别CD40新位点mAb，该mAb能够很好地识别肿瘤细胞表达的CD40分子并具有体外促进肿瘤细胞生长的作用。