组织工程骨血管化的监测

组织工程化人工骨修复骨缺损的关键环节是它的血管化，组织工程骨血管化的监测应当遵循灵敏、可定量、无创、无辐射、低成本的原则。本文对目前常用的一些监测方法进行综述，通过对比不同方法的优缺点，认为磁共振灌注法是监测组织工程骨血管化为适宜的方法下一步研究的方向。     

恒河猴体内组织工程骨血管化监测的实验研究

目的探讨不同方法监测组织工程骨血管化的优缺点,寻找较好的监测方法。方法在13只成年恒河猴的25侧胫骨上制备2cm的骨膜与骨缺损模型,根据骨缺损充填材料不同随机分为五组(每组5侧),A组：β-磷酸三钙(β-TCP) 骨髓基质下细胞(BMSCs) 血管束；B组：β-TCP 血管束；C组：β-TCP BMSCs；D组：β-TCP；E组：空白对照。术后4、8、12周行磁共振灌注成像检查并计算信号强度-时间(SI-T)曲线的最大线性斜率(SS_(max))和基线值(SI_(baseline)),拍摄恒河猴胫骨X线片并计算其透光度,行放射性核素骨显像检查并计算摄取比值,同时进行组织学检查。结果术后4、8、12周A组的SS_(max)值最高,术后8周与4周相比SS_(max)有较大幅度的提高(P=0．003)。术后12周A组5个样本的SS_(max)与X线片透光度呈负相关(rs=～0．892,P=0．042),与血管面积比值呈正相关(rs=0．894,P=0．041)。结论SI-T曲线的SS_(max)能够准确地反映组织工程骨的血管化情况,磁共振灌注成像检查具有无创、无辐射、高灵敏度和定量分析的优点。     

组织工程骨血管化策略的研究进展

骨组织工程的发展为大段骨缺损的修复提供了新的途径,众多的动物实验研究和逐渐兴起的临床应用研究已充分显示出其巨大的应用前景。然而,组织工程骨细胞支架复合物在植入体内后,尤其植入血供不佳的受区时,因不能及时地与机体建立起血供连接,使得成骨效果不稳定。近年来的研究表明,组织工程骨的血管化已成为构建大段组织工程骨的一个关键因素。我们对组织工程骨血管化策略的研究进展进行综述。     

显微外科技术预构组织工程骨血管化的比较

目的 比较3种带血管蒂组织瓣预构组织工程骨血管化的效果,探讨其影响血管化的方式.方法 设计以膝最下血管为蒂的股骨骨膜瓣包裹、贯穿,腹壁浅血管为蒂的筋膜瓣包裹体外培养的磷酸三钙(β-TCP)+骨髓间充质干细胞(MSCs)复合物等3种组织工程预构骨动物模型,以β-TCP+MSCs复合物和单纯β-TCP皮下埋放为对照,通过墨染透明标本、墨染苏木素-伊红(HE)切片、第8因子相关抗原免疫组织化学染色、铸型标本扫描电镜观察等指标,分析带血管蒂组织瓣对组织工程预构骨血管化的影响.结果 新生血管自组织瓣与材料结合的界面向材料内部生长,组织瓣处理各组的血管化指标均显著优于非组织瓣处理组(P＜0.05),前者中血管化的优劣递次为A、B、C组(P＜0.05);材料内部的孔隙中亦可观察到散在的血管,复合了MSCs的D组血管化优于单纯材料的E组(P＜0.01).结论 影响带血管蒂组织瓣组织工程预构骨血管化的因素有:(1)与材料复合的组织瓣血供及其与材料接触面积的大小;(2)提供给材料内部促进血管发生的细胞及细胞因子的种类及密度(包括内源性和外源性的);(3)材料本身的特性,如组织相容性、是否有贯通的微孔等.     

组织工程骨血管化的研究进展

组织工程骨具有巨大的临床需要及应用前景,用组织工程骨（tissue engineering bone,TEB）修复骨缺损的研究方兴未艾.目前大部分的研究都停留在小动物（如鼠、兔）体内原位或异位成骨,修复部位大都为非负重骨缺损,新生的骨组织还不能满足临床应用的需要.目前应用大块TEB修复大段骨缺损时,其核心部位往往发生缺血坏死,使修复归于失败,其主要原因在于未能很好解决TEB的血管化问题。     

活性维生素D促组织工程骨血管化

目的探讨以1,25-(OH)2D3为活性因子,与人骨髓间质成骨细胞(human marrow stromal osteoblast,hMSO)、脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,hUVEC)、珊瑚羟基磷灰石人工骨(coral hydroxyapatite,CHA)联合构建组织工程骨的异位成骨能力和体内快速血管化能力。方法体外分离、培养hMSO和hUVEC。hMSO以5×105/ml,hUVEC以2.5×105/ml按2∶1比例接种至经1,25-(OH)2D3处理过的CHA上,为实验组;相同比例hMSO和hUVEC接种于单纯CHA作为对照组。体外培养3d后,18只裸鼠背部皮下其中6只双侧均植入实验组组织工程骨1块,6只双侧均植入对照组组织工程骨1块,余6只植入实验组及对照组组织工程骨每侧1块。术后4、8、12周后取材,行大体观察、常规组织学、扫描电镜观察,并行植入物成骨的定量判断和新生血管定量分析。结果组织学观察可见,4周时,各组原始类骨组织均长入支架材料内部,实验组有大量不成熟骨组织伴随众多微血管出现;8周,骨组织成熟与微血管相伴出现;12周,各组均有成熟骨组织出现,实验组有典型骨单位。对照组在各时间点微血管量均少于实验组。扫描电镜观察:4周,实验组大量细胞外基质将细胞包埋,材料表面可见大量微血管并有部分穿入材料内部;对照组虽然细胞外基质也较丰富,但微血管量少;8周,实验组部分材料表面出现了束状条索样的类骨质结构,细胞外基质丰富,可见大量微血管相伴出现;对照组微血管量少,骨组织成熟度亦差。植入物成骨的定量判断,8周实验组为3.10±0.52,对照组为2.30±0.59;12周实验组为4.63±0.55,对照组为3.53±0.62;两时间点两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。新生血管定量分析,4周实验组为28.74%±7.81%,对照组为19.52%±4.57%;8周实验组为24.66%±7.38%,对照组为17.84%±5.22%;两时间点两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论1,25-(OH)2D3作为活性因子通过加强hMSO与hUVEC之间的相互作用,增强了构建的组织工程骨的异位成骨能力和快速血管化能力。     

组织工程化人工骨血管化研究

目的 比较三种促进组织工程化人工骨体内血管化方法的效果及研究血管化与成骨的相关关系。方法 将HA/β-TCP与PDLLA形成复合支架材料，再复合Ⅰ型胶原、rhBMP-2，与成骨细胞联合培养，仿生制备成组织工程化人工骨，采用包裹带血管蒂筋膜，复合血管内皮细胞或两者联合的促血管化手段。将人工骨修复兔桡骨干骨膜-骨完全缺损，手术后4、8、12周，观察移植物组织学，体视学方法观察血管化，成骨作用及其两者的关系。结果 3种方法均有促血管作用。其优劣依次为；材料包裹带血管蒂筋膜及复合血管内皮细胞大于材料单纯复合血管内皮细胞，后者又大于材料单纯包裹带血管蒂筋膜，术后4周为快速血管化阶段。4-8周间血管化有平缓发展，12周完全血管化，血管化与新骨生成数量成正相关。结论 促血管化手术对组织工程化人工骨移植修复骨缺损的效果起重要促进作用。     

CT灌注成像在组织工程骨材料修复缺损早期血液灌注及血管化检测的应用

[目的]探讨CT灌注成像在组织工程骨材料植入早期血液灌注及血管化监测中的应用.[方法]层层自组装方法制备肝素-壳聚糖涂层脱细胞骨基质材料并测定其体外释放肝素抗凝效果;取30只新西兰大白兔依据观察时间不同随机分为6组(1、3、7、14、21、28 d),在桡骨中段(60侧)制作15 mm的骨膜与骨缺损模型;一侧植入复合肝素/壳聚糖脱细胞基质材料;另一侧植入单纯脱细胞骨基质材料进行自身对照.分别于术上述各时间点行CT灌注成像检查,并计算血容量(Blood volume BV)、血流量(Blood flow BF);标本取材行常规切片,HE染色组织学观察,计数新生血管数.[结果]术后各时间点复合材料组的BV及BF值均显著高于单纯材料组(P<0.05);复合材料组术后3～7 d材料微孔间出现新生血管并呈逐渐增多趋势;而单纯材料组2周后见周围有少量血管,材料逐渐吸收并纤维包裹.材料植入3 d后,CT灌注成像BV变化与组织血管数成正相关(r=0.78).[结论]CT灌注成像能够及时地反映组织工程骨植入后初期血液灌注及血管化情况,且具有无创、动态和可定量分析的优点.抗凝处理可显著改善材料植入后初始阶段的血液灌注及早期血管化.     

组织工程骨血管化机理及策略的研究进展

1前言 组织工程学是应用生命科学和工程学的原理和方法，研究、开发用于修复、增进或改善人体各种组织或器官损伤后功能和形态的生物替代品的一门新兴科学。于19世纪80年代兴起，由Langer和Vacanti首先提出，尽管起步较晚，却已成为生命科学中的一大热门研究。但近期的一项调查结果显示组织工程在“缩水”。有人通过对全球知名组织工程科研机构的非连续4年的相关数据做了比较：     

低强度脉冲超声波促进组织工程骨血管化重建的研究进展

组织工程骨修复骨缺损过程中血管化构建一直是骨科领域的一个难题,随着对骨折修复分子生物学机制的深入研究,以及对骨折愈合机制认识的不断加深,发现血管化是制约组织工程骨修复骨缺损速度与程度的重要因素[1].构建组织工程骨血管化的方法很多,如血管束植入、血管蒂筋膜瓣包裹术或肌肉瓣预制术等均不十分令人满意.     

低温保存对组织工程骨特性影响的实验研究

目的 了解不同低温保存方法对组织工程骨支架生物特性和成骨细胞功能的影响。方法 组织工程骨分别在4℃和-196℃环境下保存3，6个月，以未行保存的组织工程骨和单纯生物衍生骨作为对照。实验分为7组，组织工程骨4℃保存3个月为A3组，保存6个月为A6组，-196℃保存3个月为B3组，保存6个月为B6组，未行保存的组织工程骨为C组，单纯生物衍生骨组为D组，新鲜人体骨为S组（仅作生物力学）。观察细胞的黏附与生长，并行材料的生物力学、碱性磷酸酶活性（ALP）、细胞表面的整合素α2β1表达量、Ⅰ型胶原、钙化能力和成骨细胞成活率等检查。结果 所有组织工程骨各组均可见成骨细胞在材料表面黏附，细胞在材料孔隙内生长、分化和增殖；材料的力学性能检测显示A3、A6、B3、B6、D组各组间最大载荷比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；A3、A6、B3、B6、D组分别与S组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；各组成骨细胞ALP活性、细胞表面的整合素α2β1表达量、Ⅰ型胶原、钙化能力和成骨细胞成活率依次为C组〉B3组〉B6组〉A3组〉A6组。结论 4℃保存方法和-196℃保存方法对生物衍生骨的生物力学性能无明显的影响。4℃保存方法和-196℃保存方法对细胞的存活率和细胞的生物活力有明显的影响，但均能在一定程度上保存细胞的存活率和的细胞的生物活力。-196℃保存方法优于4℃保存方法，但4℃保存方法操作简单、方便和经济。     

组织工程骨修复兔颅骨缺损的实验研究

目的　探讨组织工程化骨修复骨缺损实用价值。方法　将自体成骨样细胞即刻种植在胶原包埋的聚羟基乙酸（PGA）基质材料上,然后将该复合体或单纯基质材料移植到兔颅骨的一侧全层骨缺损区,作为实验侧Ⅰ或实验侧Ⅱ。对侧设对照,不作任何植入。将40只新西兰兔分别于术后2、6、8、12w处死,标本行大体组织学检查,X线摄片及灰量测定检查。结果　术后2w实验侧I缺损区可见骨小梁形成,且各期成骨面积明显优于实验侧Ⅱ及对照侧,另外,植入材料内的灰量测定结果及X线摄片结果也表明实验侧I成骨量明显大于实验侧Ⅱ（p<0.01）,而对照侧为纤维组织修复。结论　应用胶原包埋PGA加成骨样细胞复合体移植可修复自体的兔颅骨缺损,为组织工程化骨在颅面外科及整形外科领域的临床应用奠定了基础。     

组织工程骨-80 ℃低温保存的初步研究

目的：了解不同冻存方法对组织工程骨生物活性的影响。方法：以骨髓基质干细胞（marrow stromal cells，MSCs）复合部分脱蛋白骨培养制备组织工程骨，实验分为：A组，组织工程骨用添加冻存保护荆的保存液保存；B组，组织工程骨用不添加冻存保护荆的保存液保存；C组，组织工程骨未行低温保存；D组。单纯MSCs培养。A组和B组的组织工程骨于-80℃深低温保存3个月，3个月后复温冻存的组织工程骨。扫描电镜观察MSCs的黏附和分布情况，MTT法检测细胞活力，对硝基苯磷酸法检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AIP）活性，流式细胞仪分析细胞周期。结果：MSCs在材料表面和孔隙内均可黏附和分布，黏附于材料的细胞活力大小依次为C组〉A组〉B组（P〈0．01，P〈0．05）。黏附于材料的细胞AIP活性大小依次为C组〉A组〉B组（P〈0．01）。各组细胞周期未见明显变化，未见异倍体细胞。结论：选择适宜的冻存保护荆对组织工程骨的生物活性有一定的保护作用。     

组织工程化骨修复胸壁缺损的实验研究

目的　探索利用组织工程化骨修复胸壁缺损的可行性。方法　实验借助组织工程的基本原理和方法 ,利用猪骨脱细胞基质作为可降解支架材料 ,同时体外扩增自体骨髓间质干细胞作为种子细胞 ,体外构建组织工程化骨组织修复实验用北格犬双侧胸壁各 5cm× 5cm缺损 ,同时在构建的组织工程化骨组织中设计“辅助灌流系统” ,定时注入DMEM培养液、BMP等细胞因子和自体骨髓间质干细胞 ,即保证组织工程化骨中细胞早期营养 ,又维持了局部成骨微环境 ,并同时保证了种子细胞来源。结果　 5只实验动物胸廓未见反常呼吸 ,病理切片证明局部骨组织形成 ;单纯材料对照组可降解支架材料基本吸收 ,伴纤维组织形成。结论　组织工程化骨具有良好的生物相容性 ,并具有一定的强度 ,可防止反常呼吸 ,是一种理想的胸壁缺损修复材料     

组织工程骨联合外固定修复大鼠股骨节段性骨缺损

目的 观察以外固定器固定,骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 联合双相磷酸钙(BCP)修复大鼠股骨节段性骨缺损的效果.方法 A组:BMSCs与BCP复合植入缺损区;B组:BCP植入缺损区;C组:空白组.定期摄X线片,术后12周取材.结果 A组随时间延长X线评分递增,12周时平均为4.17分,B组为1.18分,C组为1.08分,差异有统计学意义(P<0.05).组织学检查见A组缺损区有大量的新生骨生成,而B、C组无新生骨生成.A组的抗压刚度和扭转刚度分别为(8.09±2.42)N/mm、(1.89±0.72)Nmm/deg;B组为(1.75±0.90)N/mm、(0.40±0.21)Nmm/deg,差异有统计学意义(P<0.05).结论 组织工程骨联合外固定可以修复节段性骨缺损.

Abstract：

Objective To evaluate the efficacy of bone mesenchymal stem cells (BMSCs) combined with biphasic calcium phosphate (BCP) repair of segmental bone defect, which was stabilized with an adaptable external fixation system.Methods In group A, the femoral defect was filled with BCP combined with BMSCs; In group B, the femoral defect was filled with BCP, and in group C, defects were left empty. Animals were sacrificed 12 weeks post-operation.Results In group A, radiographic scores were average 4.17, significantly (P<0.05) greater than in group B (1.18) and group C (1.08). Histological evaluations displayed the bridging of the defect in group A, with remarkable new bone formation. In contrast, group B and group C showed no formation of new bone. The mechanical testing revealed that axial stiffness was (8.09±2.42) N/mm and torsional stiffness was (1.89±0.72) Nmm/deg in group A, and those in group B were (1.75±0.90) N/mm and (0.40±0.21) Nmm/deg respectively. There was significant difference in biomechanical tests between group A and group B (P<0.05).Conclusion External fixator combined with tissue engineered bone can repair segmental bone defect.     

体外构建与体内构建组织工程骨的血管化研究

目的比较骨髓基质干细胞(BMSCs)与生物衍生骨体内、体外复合所构建的组织工程骨修复山羊胫骨大段骨-骨膜缺损的血管化进程以及血管化与成骨的关系,以探讨修复大段负重骨缺损的最佳途径。方法22只山羊制备成胫骨中段20mm的骨-骨膜缺损,随机分为2组,分别植入BMSCs与生物衍生骨体外构建和体内构建的组织工程骨,常规钢板螺钉内固定,在2、4、6、12周时间点分别用墨汁灌注透明标本、血管面积图像分析和X线片观察血管化过程及成骨情况。结果体外构建组与体内构建组血管化进程无明显区别,各时间点血管面积差异无显著性意义(P>0.05),12周均能达到完全血管化,但X线片见体外构建组新骨形成较快,缺损区密度高,体内构建组以上各变化较前者慢大约2～4周。结论BMSCs与生物衍生骨体外构建和体内构建的组织工程骨均能快速血管化并成骨,但是体内构建方式成骨较体外构建慢。     

丝素蛋白/羟基磷灰石组织工程化骨修复兔桡骨节段性骨缺损

目的 探讨丝素蛋白/羟基磷灰石(SF/HA)组织工程化骨的成骨作用,以期为临床治疗骨缺损提供新的人工骨材料.方法 将SF/HA与成骨诱导的兔骨髓基质干细胞(BMSCs)复合,构建组织工程化骨.取54只兔于左侧桡骨中上段制备15 mm节段性骨缺损.实验分3组(A、B组各24只,C组6只):A组:植入SF/HA组织工程化骨,B组:单纯植入SF/HA;C组:骨缺损区不植入任何材料.于术后4、8、12及16周摄X线片,并于16周行螺旋CT扫描重建,观察骨缺损修复及骨塑形情况,参照Lane-Sandhu X线评分标准对各组骨缺损的骨修复程度评分.骨痂标本行 HE染色组织学观察,按照Lane-Sandhu组织学评分法比较12周和16周时各组的骨修复情况. 结果 术后16周,X线片示A组髓腔通畅,新骨塑形好,骨皮质连续;B组缺损区有缩小,两断端不连接;C组缺损区无明显骨痂生长.16周时螺旋CT扫描重建显示:A组骨塑形明显,骨缺损完全修复;B组有部分皮质骨形成,缺损区不能完全修复;C组骨缺损基本无修复.每组术后4、8、12、16周不同时间点的放射学评分差异均有统计学意义(P＜0.05).术后12、16周时3组间Lane-Sandhu组织学评分差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 SF/HA组织工程化骨具有良好的节段性骨缺损修复能力,但SF/HA本身缺乏骨诱导作用,单独修复节段性骨缺损作用有限.     

复合血管内皮祖细胞的组织工程骨在修复大段骨缺损实验中的血管化评价

目的 评价复合了血管内皮祖细胞(EPCs)的组织工程骨在修复兔桡骨大段骨缺损实验中的血管化情况.方法 自体骨髓通过不同方法的体外培养,获得EPCs及经成骨诱导的骨髓基质干细胞(BMSCs),与脱钙骨基质(DBM)构建组织工程骨修复兔桡骨大段骨缺损.用墨汁灌注、放射性核素骨显像、血管内皮细胞生长因子和Ⅷ因子相关抗原的免疫组化方法观察术后不同时期实验组(EPCs+BMSCs+DBM)、自身对照组(BMSCs+DBM)、阴性对照组(DBM)的骨组织血管化情况.结果 各组手术后2周骨缺损区新生血管数量增加,血流量开始升高,4周和8周时达到峰值,12周后开始下降.实验绀的新生血管数量和局部血流量在术后2、4、8周明显高于自身对照组和阴性对照组,血管排列更整齐.结论 复合EPCs的组织工程骨在修复大段骨缺损时,能促进早期血管化,从而进一步促进成骨.