金叶败毒制剂对人巨细胞病毒感染人胚肺成纤维细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨中药金叶败毒制剂(简称中药)对人巨细胞病毒(HCMV)感染人胚肺成纤维细胞(HEL)增殖及凋亡的影响。方法:用HCMVAD169感染人胚肺成纤维细胞,分别用金叶败毒制剂和更昔洛韦(GCV)干预后,采用MTT法检测HCMV感染及药物干预后HEL细胞的增殖活性,并采用流式细胞术检测HEL、HCMV感染及药物干预后细胞凋亡指数。结果:在HCMV感染48h内,细胞增殖及凋亡指数与细胞对照组无明显差异。HCMV感染72h后,细胞增殖明显受抑制,凋亡指数明显增高;而两种药物干预后,72h后明显促进细胞增殖,抑制细胞凋亡。结论:金叶败毒制剂可能通过促进HCMV感染细胞的增殖,抑制感染细胞的凋亡而发挥抗病毒作用。     

MTX与RU486对输卵管妊娠绒毛表达NF-kB及HB-EGF的影响

目的:探讨氨甲喋呤(MTX)、米非司酮(RU486)对输卵管妊娠绒毛表达核因子kB(NF-kB)、肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)的影响。方法:利用免疫组化法和计算机图像分析系统检测NF-kB、HB-EGF在输卵管妊娠绒毛表达。结果:NF-kB表达于绒毛滋养细胞的胞浆、胞膜及部分细胞核,MTX治疗组NF-kB的表达较对照组明显减弱,差异有显著性(P<0.01),RU486治疗组NF-kB的表达较对照组减弱,差异有显著性(P<0.05)。HB-EGF表达于绒毛滋养细胞的胞浆、胞膜,MTX治疗组HB-EGF的表达较对照组差异无显著性(P>0.05),RU486治疗组较对照组HB-EGF的表达明显减弱,差异有显著性(P<0.01)。结论:输卵管妊娠绒毛滋养细胞分泌NF-kB、HB-EGF,对滋养细胞的增殖、分化及侵袭等起重要调节作用;MTX主要抑制NF-kB表达,RU486主要抑制HB-EGF表达,因此MTX、RU486联合用药治疗输卵管妊娠效果较好。     

巨细胞病毒感染对人早孕绒毛及蜕膜组织的内分泌影响

目的:探讨人巨细胞病毒(humancytomegalovirusHCMV) 感染对人早孕绒毛及蜕膜组织的内分泌影响。方法: 采用体外培养早孕绒毛及蜕膜组织技术, 给予HCMV感染建立体外HCMV感染早孕绒毛及蜕膜模型, 采用放射免疫法检测HCMV感染后早孕绒毛及蜕膜组织培养上清液中hCG和PRL的水平。结果: ①正常早孕绒毛培养液中hCG分泌峰值在培养后第7天。给予高浓度HCMV干预后, hCG水平显著下降(P<0 .01 ), 给予中浓度HCMV干预后, hCG水平明显下降(P<0. 05 ),给予低度HCMV干预后, hCG水平于培养的第1~3天有所下降, 与正常对照组无显著差别(P>0 .05)。②正常蜕膜培养液中PRL分泌峰值在培养后第5天达峰值, 给予高浓度HCMV干预后, PRL水平显著下降(P<0 .001), 给予中浓度HCMV干预后,PRL水平明显下降(P<0 .01), 给予低度HCMV干预后, PRL水平于培养的第1~5天明显下降(P<0. 05) 后渐恢复至正常水平。结论: HCMV感染可影响早孕绒毛及蜕膜组织的hCG和PRL的分泌, 导致不良妊娠结局。     

姜黄素对人宫颈癌SiHa细胞株增殖、凋亡和COX-2表达的影响

目的:体外研究中药姜黄素(Cur)对子宫颈癌SiHa细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用及与环氧合酶(COX-2)表达的关系。方法:以不同浓度的姜黄素(10～30μmol/L),分12～72 h四个时间点处理SiHa细胞,光镜观察细胞形态变化;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖抑制率;用DNA梯状电泳(DNA ladder)检测凋亡的发生;Western blot检测COX-2蛋白的表达;用放射免疫法检测细胞PGE2释放水平。结果:姜黄素可抑制SiHa细胞增殖,作用呈明显的时效和量效关系,差异有统计学意义(P<0.01);姜黄素可诱导SiHa细胞凋亡,DNA ladder呈梯状条带;姜黄素可明显抑制COX-2的表达,差异有统计学意义(P<0.01),并呈浓度依赖性;姜黄素明显抑制SiHa细胞PGE2释放水平,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:姜黄素体外对SiHa细胞具有增殖抑制作用和促进凋亡作用,其机制可能与抑制COX-2蛋白表达、降低PGE2释放水平有关。     

β-胡萝卜素和VC对K562细胞c-myc基因表达的影响

目的研究β-胡萝卜素和维生素C对白血病细胞中c-myc癌基因表达的影响.方法体外培养白血病细胞株K562,分别添加不同浓度的β-胡萝卜素和VC,培养24h、48h、72h后,利用台盼蓝拒染法检测两种微营养素对细胞增殖的抑制作用;同时取作用24h的细胞利用Northern印迹杂交检测细胞中c-myc基因的表达.结果VC(5、10、100μmol/L)对K562细胞增殖具有显着的抑制作用(P<0.05),而且低浓度的VC(5μmol/L)对K562细胞的抑制作用出现较早.β-胡萝卜素3个剂量组(10、50、100μmol/L)均可抑制K562细胞增殖,具有显着性差异(P<0.05).VC(5μmol/L)和β-胡萝卜素(50μmol/L)均能诱导K562细胞凋亡.VC(5μmol/L)对K562细胞内c-myc的表达没有明显作用(P>0.05).β-胡萝卜素(50μmol/L)对K562细胞内c-myc的表达有显着促进作用(P<0.05).结论VC抑制K562细胞增殖的效应与c-myc的表达无关.β-胡萝卜素可能通过上调c-myc基因的表达,进一步诱导白血病细胞凋亡,从而抑制白血病细胞增殖.     

Kiss-1、E-cadherin在胎盘部位滋养细胞肿瘤中的表达及相关性

目的:探讨肿瘤抑制蛋白Kiss-1和黏附分子E-cadherin在胎盘部位滋养细胞肿瘤中的表达及相关性。方法:采用免疫组化PowerVision二步法检测20例正常早孕绒毛、15例葡萄胎、15例绒癌、10例胎盘部位滋养细胞肿瘤(PSTT)中Kiss-1和E-cadherin的表达情况及相关性。结果:Kiss-1、E-cadherin在正常早孕绒毛、葡萄胎、PSTT、绒癌中表达呈下降趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。Kiss-1、E-cadherin在正常早孕绒毛和葡萄胎的表达差异无统计学意义(P>0.05);在PSTT中表达低于正常早孕绒毛和葡萄胎中表达,差异有统计学意义(P<0.05);PSTT和绒癌的表达差异无统计学意义(P>0.05)。Kiss-1和E-cadherin在正常早孕绒毛、葡萄胎、PSTT、绒癌中表达呈正相关(r=0.627,P<0.05)。结论:Kiss-1和E-cadherin低表达或表达缺失可能在PSTT的浸润和转移过程中发挥重要作用,二者具有协同作用。     

MMP-9调控绒毛外滋养细胞sFasL表达的研究

目的:探讨基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在绒毛外滋养细胞对可溶性Fas配体(sFasL)表达的调控。方法:化学合成针对MMP-9的siRNA,通过脂质体转染绒毛外滋养细胞株(TEV-1),运用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RealTimeRT-PCR)和ELISA法检测MMP-9siRNA转染前后细胞中MMP-9、FasLmRNA及其蛋白分泌表达的变化。结果:转染后24h,MMP-9siRNA组的MMP-9mRNA表达较对照组明显降低(P<0.05),而FasLmRNA表达较对照组无明显变化(P>0.05)。转染后48h,MMP-9siRNA组的MMP-9蛋白及FasL蛋白的分泌表达较对照组均显著降低(P<0.05)。结论:MMP-9siRNA能特异高效沉默TEV-1的MMP-9mRNA表达,MMP-9蛋白分泌减少的同时也降低了sFasL蛋白的分泌。绒毛外滋养细胞表达的MMP-9可调节sFasL的表达,从而影响内皮细胞凋亡,可能参与早期胎盘血管的重建过程。     

来曲唑对体外培养的子宫内膜异位症患者在位内膜细胞增殖的影响

目的:探讨来曲唑对体外培养的子宫内膜异位症患者在位内膜细胞增殖的影响。方法:MTT比色法检测来曲唑对在位内膜细胞(Eutopic Endometrium,EE)/正常内膜(normal endometrium NE)抑制情况,并采用蛋白印迹法与RT-PCR方法检测芳香化酶及其转录调节因子SF-1的蛋白与mRNA表达情况。结果:NE细胞用药组与对照组比较无显著性差异(P>0.05);EE细胞在来曲唑作用下呈现较强的抑制增殖效应,抑制作用随浓度增加而加强,细胞增殖活力明显降低,有显著性差异(P<0.01),不同浓度的来曲唑均可明显抑制细胞内芳香化酶及其转录调节因子SF-1的蛋白与mRNA表达,且呈剂量依赖性,有显著性差异(P<0.01)。结论:芳香化酶抑制剂——来曲唑对子宫内膜异位症患者在位内膜细胞具有抑制其增殖作用,明显抑制EE细胞内芳香化酶及其转录调节因子SF-1的蛋白与mRNA表达。     

MK-siRNA对人乳腺癌细胞的生长、粘附及迁移能力的影响

目的:探讨siRNA MK转染对乳腺癌MCF-7细胞增殖和转移能力的影响。方法:构建特异性抑制Midkine基因siRNA片段,转染至乳腺癌MCF-7细胞中,CCK-8法比较细胞增殖能力的改变,体外迁移实验比较细胞运动能力的改变,基质胶粘附实验比较细胞粘附率的变化。结果:MK表达下调后,MCF-7细胞的增殖能力明显降低(P<0.05),体外迁移能力显著降低(P<0.05),siRNA细胞对基质胶的粘附率明显降低(P<0.05)。结论:MK基因表达下调能降低乳腺癌细胞迁移运动和降低细胞对基质胶的粘附率,并降低肿瘤细胞的增殖,提示MK在乳腺癌恶性进展中起重要作用。     

NF-KB在人巨细胞病毒感染人胚肺成纤维细胞中的表达及意义

目的:探讨核转录因子(NF-KB)在人巨细胞病毒(HCMV)感染宿主细胞中的表达及意义.方法:用HCMV AD169株感染人胚肺成纤维细胞(HEL),采用免疫组化和原位杂交方法检测HEL细胞不同时相NF-kB和bcl-2蛋白的表达及NF-KB P 65 mRNA的表达,同时用流式细胞术检测细胞凋亡指数.结果:HCMV感染后48 h细胞核表达NF-KB蛋白阳性数最多,96 h后逐渐减少,120 h无阳性细胞,NF-KBp 65 mRNA表达水平在24h达到最高,bd-2的表达与NF-kB的活性改变一致.HCMV感染在72 h前抑制宿主细胞凋亡,在120 h可诱导宿主细胞凋亡.结论:NF-KB在宿主细胞中的动态表达与HCMV的生活周期及致病有关.     

金叶败毒颗粒抑制人巨细胞病毒vMIA蛋白表达及作用的实验研究

目的:通过研究金叶败毒颗粒对人巨细胞病毒vMIA蛋白表达及作用的调节,探讨金叶败毒颗粒体外对HCMV感染的预防、阻断和治疗效应及其机制。方法:采用细胞形态观察测定病毒的感染性。应用免疫荧光检测vMIA蛋白在病毒感染过程中表达的规律,在病毒感染不同阶段(病毒吸附前、吸附时和吸附后)应用金叶败毒颗粒,观察药物对HCMV vMIA蛋白表达水平的影响。转染pcDNA UL37xl质粒,经G418筛选,Western blot鉴定vMIA的表达。应用流式细胞术检测药物对TNFα+CHX攻击后细胞凋亡指数的影响。结果:HCMV感染后4 h vMIA开始表达,在病毒感染48h表达最显著。金叶败毒颗粒可显著抑制HCMV vMIA蛋白的表达,其作用较更昔洛韦弱。金叶败毒颗粒可以恢复被vMIA抑制的TNFα诱导的凋亡,但更昔洛韦无此功效。结论:金叶败毒颗粒可显著抑制HCMV vMIA蛋白的表达及其作用,这可能是金叶败毒颗粒抗HCMV效应的主要作用机制之一。     

习惯性流产孕妇巨细胞病毒pp65抗原检测的临床意义

目的:探讨人巨细胞病毒(HCMV)活动性感染与习惯性流产(RPL)的关系。方法:采集习惯性流产孕妇和正常产前体检孕妇外周血,分离外周血单个核细胞(PBMCs)和血浆,分别用免疫荧光法和实时定量PCR检测HCMV pp65抗原和HCMV-DNA,并比较2种方法的一致性。结果:46例RPL患者HCMV pp65抗原有14例阳性,阳性率30.4%,50例正常体检孕妇HCMV pp65抗原有4例阳性,阳性率8%,2组孕妇HCMV活动性感染率有显著性差异(2χ=6.76,P<0.01)。孕妇HC-MV pp65抗原阳性率升高,孕妇流产几率增加(2χ=6.39,P<0.01)。免疫荧光法和实时定量PCR有较好的一致性(93.5%)。结论:习惯性流产孕妇HCMV活动性感染率显著高于正常孕妇,HCMV pp65抗原检测可作为RPL早期诊断指标之一。     

Optimized recombinant dense bodies of human cytomegalovirus efficiently prime virus specific lymphocytes and neutralizing antibodies without the addition of adjuvant

Control of human cytomegalovirus (HCMV) infection correlates with the reconstitution of antiviral T lymphocytes in haematopoietic stem cell transplant recipients. A vaccine to foster this reconstitution and to ameliorate the severe consequences of HCMV reactivation is yet unavailable. This work focused on providing a rationale for the amendment of the yields and the antigenic composition of a vaccine, based on subviral dense bodies (DB) of HCMV. Modified DB were generated that contained the HLA-A2 presented IE1 model peptide TMYGGISLL, integrated at different positions in the major DB protein pp65. Insertion at position W175 of pp65 allowed efficient formation of recDB in the cytoplasm of infected cells and resulted in considerable yields of these particles. Even in the absence of adjuvant, these particles proved to be highly immunogenic with respect to CD8 and CD4 T cell and neutralizing antibody responses.     

人正常早孕滋养细胞体外培养株的系统鉴定

目的 建立人早孕滋养细胞株（HPT-8）的系统鉴定方法。方法 通过光镜、扫描电镜、透射电镜、免疫组化和免疫荧光激光共聚焦的方法对体外培养出的HPT-8进行系统鉴定评价。结果 电镜下可见细胞表面微绒毛丰富；胞质丰富；内质网扩张明显，细胞间紧密的桥粒样结构连接；检测细胞胞浆中角蛋白18和波形蛋白均为阳性，细胞胞浆中角蛋白7为阳性，细胞膜上移动相关蛋白为阳性。表皮生长因子受体、滋养细胞趋化因子和胎盘碱性磷酸酶结果均阳性，而人绒毛促性腺激素和胎盘催乳素结果均为阴性。结论 通过多种方法对HPT-8进行形态、超微结构、蛋白骨架和功能指标的综合评价，可以较全面的确定体外传至72代的细胞株HPT-8为具有部分内分泌功能的滋养细胞株，为进一步开展实验研究建立细胞模型。     

人巨细胞病毒蛋白IE1及pp65在HEL细胞中表达的时空特性

目的研究HCMV感染HEL细胞后,病毒蛋白IE1及pp65在不同时间点的亚细胞分布及其表达量-时效变化相关性。方法HCMV感染HEL细胞后,吸附2h,维持培养0、2、4、6、10、22及46h后,用病毒蛋白IE1的单克隆抗体及蛋白pp65的单克隆抗体做免疫细胞化学染色,检测此两种蛋白的胞内分布;同时运用图像分析系统对此检测结果进行灰度值测定,并利用方差分析分析此测定结果。结果IE1蛋白仅在核内检测到;表达趋势是4~6hp.i.呈表达上升趋势,6~8hp.i.又下降。pp65首先于仅在核内被检测到,之后也分布于胞浆中。pp65表达于2~8hp.i.表达增多,8~24hp.i.呈胞内稳定表达,24~48hp.i.表达降低。结论IE1蛋白及pp65表达的亚细胞分布具有时空特异性;两种蛋白的表达量上都表现为量-时效相关性;本研究间接反映了病毒复制增殖的连续过程。     

产前诊断先天性人巨细胞病毒感染安全性和可靠性分析

目的:探究宫内取材进行先天性人巨细胞病毒(HCMV)感染产前诊断的安全性和可靠性。方法:联合应用酶联免疫吸附试验(ELISA)、巢式PCR(N-PCR)和逆转录PCR(RT-PCR)分析武汉、上海和沈阳三地6723例育龄妇女和孕妇HCMV感染状况及妊娠结局。结果:育龄妇女活动性HCMVIgM检出率为6·11%,其中孕妇和非孕妇间无显著性差异。活动性感染孕妇绒毛、脐血HCMV感染率分别为51·52%、66·18%,明显高于对照组。先天性感染儿发生异常妊娠结局的危险性明显高于非感染儿。宫内取材所致妊娠丢失率均无显著增加,其检查结果与出生后的诊断一致。结论:宫内采集绒毛、羊水、脐血进行产前诊断,安全性和可靠性良好,可为胎儿的取舍提供依据。     

婴幼儿人巨细胞病毒感染的临床表现和糖蛋白B基因分型

目的:了解婴幼儿人巨细胞病毒(HCMV)活动性感染的临床表现,以及与糖蛋白B(gB)基因型的关系。方法:ELISA法检测HCMV-IgM确定的HCMV阳性的婴幼儿51例,对其不同临床症状进行分析。对其中43例患儿使用套式PCR(nPCR)法加限制性长度多态性分析(RFLP)进行HCMV gB基因分型。结果:在51例HCMV感染患儿中全身性感染和单脏器感染分别占25.49%和74.51%,HCMV包涵体病和肝炎分别占25.49%和21.57%。43例患儿HCMV gB的基因分型结果为,gBI型20例,gB II型7例,gB III型9例,gB I、II混合型4例,gB I、III混合型2例,gB II、III混合型1例,未发现gB IV型。gB I型占46.51%。结论:婴幼儿HCMV感染临床表现种类多样;HCMV感染者以gB I型HCMV占多数。     

人巨细胞病毒pp65DNA疫苗诱导小鼠免疫效应的研究

目的探讨人巨细胞病毒pp65 DNA疫苗免疫小鼠产生的细胞免疫应答及相关的细胞因子变化,分析该疫苗是否具高度免疫性。方法将40只健康Balb/c小鼠随机分成A、B两组,每组20只。A组(对照组):注射生理盐水;B组(实验组):注射pp65 DNA疫苗;采用流式细胞仪检测CD3+、CD4+及CD8+;采用双抗体夹心ELISA法检测小鼠血清中的IFN-γ;采用放射免疫法检测小鼠血清中的IL-2。统计学处理用SPSS 10.0统计学软件,组间比较用t检验,P0.05为差异有统计学意义。结果B组小鼠T细胞亚群CD4+、CD8+、CD3+及细胞因子IFN-γ,IL-2水平明显高于A组,差异均有统计学意义(P0.01)。结论本研究表明HCMV pp65 DNA疫苗能诱导Balb/c小鼠产生一定的细胞免疫应答及细胞因子的变化。     

产前诊断先天性巨细胞病毒感染的两种方法比较

目的:对比两种取材方法进行先天性人巨细胞病毒(HCMV)感染产前诊断的准确率。方法:选取外周血HC-MV-IgM阳性的孕妇,联合运用显微操作技术、引物延伸预扩增法(Primed extension preamplification,PEP)及聚合酶链反应(PCR)分别检测羊水和孕妇外周血中胎儿有核红细胞(FNRBC)的HCMV基因,将检测结果与胎儿实际感染情况对比。结果:运用羊水产前诊断HCMV感染的检出率为57.14%(4/7),准确率为65.38%(17/26);运用FNRBC诊断胎儿HCMV宫内感染的检出率为83.33%(15/18),准确率为92.86%(39/42)。结论:通过孕妇外周血中胎儿有核红细胞产前诊断巨细胞病毒感染优于传统方法-羊水,可能为胎儿的取舍提供更充分的依据。