婴幼儿轮状病毒VP7基因cDNA文库构建

[目的]分离与培养婴幼儿轮状病毒,并克隆婴幼儿轮状病毒外壳蛋白VP7基因,导入pMD18-T载体,成功构建VP7基因cDNA文库,为构建轮状病毒基因工程疫苗奠定基础. [方法]提取婴幼儿轮状病毒总RNA,通过RT-PCR扩增,获得目的基因片段VP7,进行分离纯化与回收,最后纯化的VP7基因与pMD18-T载体进行连接,进行质粒抽提与鉴定. [结果]提取的婴幼儿轮状病毒总RNA比较完整,28S、18S,5S条带清晰可见,成功扩增VP7基固,连接pMD18-T载体,转化感受态菌(DH5α),通过蓝白斑筛选得到DNA阳性重组子(载体+VP7基因片段).[结论]通过对婴幼儿轮状病毒培养、VP7基因扩增、基因片段回收、连接、转化、鉴定等一系列技术,初步确定婴幼儿轮状病毒外过壳蛋白VP7基因已导入pMD18-T载体,成功构建VP7基因cDNA文库,为进一步研制轮状病毒基因工程疫苗奠定了基础.     

克里米亚-刚果出血热病毒特征核酸序列克隆载体的构建

目的构建含有克里米亚-刚果出血热病毒特征序列的克隆载体。方法设计RT-PCR引物及反应体系,从克里米亚-刚果出血热病毒RNA中扩增获得目的序列,进行分离纯化和回收,将纯化的扩增片段与pMD18-T载体进行连接,进行酶切鉴定与测序鉴定。结果确定检测克里米亚-刚果出血热病毒一步法RT-PCR的反应条件及体系,引物终浓度为400 nmol/L,反应条件为:50℃30 min,94℃4 min,94℃30s,57℃30 s,72℃30 s,35cycles.成功将CCHF的特征序列片段克隆,pMD18-T载体经DNA测序鉴定正确。结论构建的pMD18-CCHF质粒,可用于克里米亚-刚果出血热病毒RT-PCR实验的阳性对照。     

人轮状病毒结构蛋白VP7基因毕赤酵母表达质粒的构建

[目的]构建人轮状病毒结构蛋白VP7基因重组酵母表达质粒VP7-pPICZαA. [方法]从VP7-pET32a质粒中PCR扩增轮状病毒VP7基因,EcoR I、Xba,I双酶切VP7基因产物和酵母表达载体pPICZαA,T4 DNA连接酶连接目的基因片段和pPICZαA,转化到大肠杆菌Top10中,Zeocin筛选转化子并进行PCR、酶切和测序鉴定. [结果]阳性克隆菌经酶切和PCR和测序鉴定,结果与预期相符,目的基因正确插入pPICZαA中. [结论]成功构建轮状病毒结构蛋白VP7基因重组酵母表达质粒VP7-pPICZαA,为轮状病毒结构蛋白VP7基因的酵母表达奠定了重要的实验基础.     

重组乳酸杆菌中A组轮状病毒VP7基因表达

目的 扩增A组轮状病毒VP7基因,构建pEDM27/5-VP7重组质粒,转化乳酸杆菌并分析VP7蛋白的表达及活性.方法 通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得目的 基因VP7,纯化后与pEDM27/5载体进行连接,转化乳酸杆菌,乳糖进行诱导表达,分别于4,8,12 h后,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹技术(Western blot)对产物进行分析测定.结果 A组轮状病毒经RT-PCR扩增后,1%琼脂糖电泳检测可见一条约1.0 kb的特异性条带,与预期目的 基因(VP7基因)大小相符;SDS-PAGE和Western-blot杂交分析发现,经乳糖诱导4,8,12 h后分别可见一条分子量约为28 kD蛋白带表达,经扫描分析,诱导后表达蛋白分别约占菌体总蛋白的2.30%,5.12%,5.38%,且随着时间变化而持续表达增加,并能与抗A组轮状病毒VP7蛋白特异结合.结论 重组乳酸杆菌持续表达免疫活性A组轮状病毒VP7蛋白,为进一步研究乳酸杆菌作为轮状病毒基因工程疫苗的表达载体提供了基础依据.     

白色念珠菌hsp60基因克隆

目的:克隆白色念珠菌hsp60基因。方法:通过RT-PCR技术扩增白色念珠菌hsp60基因片段,纯化后与pMD18-T载体连接,转化并通过Amp、x-Gal、IPTG进行蓝白筛选,白色克隆提取质粒,SacⅠ和HindⅢ双酶切及PCR鉴定,基因测序。结果:RT-PCR扩增得到1701bp片断,重组质粒pMD18-T-hsp60双酶切后在2692bp和1701bp处可见到酶切片段,测序结果与GenBank中白色念珠菌hsp60基因比较,同原性达99%。结论:成功克隆白色念珠菌hsp60基因,为进一步研究其免疫保护机制及制备白色念珠菌疫苗奠定基础。     

nm23-H1基因实时荧光定量PCR标准质粒的构建

目的：制备用于nm23-HI基因raRNA实时荧光定量PCR检测的质粒标准品。方法：通过PCR扩增出目的片断，纯化后T-A连接至pMD18-T载体，转化宿主菌E.coliDH5α，获得阳性克隆；通过PCR扩增、双酶切鉴定和测序分析，确认重组质粒完整正确；大量抽提重组质粒，测定其拷贝浓度，10倍稀释成梯度标准品，并进行荧光定量PCR检测分析。结果：nm23～H1基因目的片段成功重组至pMD18-T载体上，获得的重组质粒保持了目的片段的特异性和序列完整性。梯度浓度标准质粒的荧光定量PCR结果显示，循环阈值（Ct）与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系。结论：成功构建了nm23-H1基因实时荧光定量PCR质粒标准品。     

H5N1亚型禽流感病毒聚合酶酸性蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建甲型禽流感病毒H5N1亚型聚合酶酸性蛋白(PA)的真核表达载体,并表达其编码蛋白PA。方法采用RT-PCR法扩增PA基因,克隆至pMD18-T载体中构pMD18-T-PA质粒。双酶切pMD18-T-PA质粒与pXJ40-HA质粒后,胶回收并连接目的片段,构建真核表达载体pXJ40-HA-PA,鉴定后转染293T细胞。采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组PA蛋白的表达。结果成功构建了禽流感病毒H5N1亚型PA基因的真核表达载体,并在真核细胞中成功表达出分子量为75kD的重组蛋白。结论成功构建禽流感病毒H5N1亚型PA基因的真核表达载体,为后期进一步研究PA蛋白的功能奠定了基础。     

周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶基因的扩增、克隆及序列分析

[目的]克隆周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease of periodic Brugia malayi,BmCP）基因到原核载体中,测定其序列,为进一步的研究奠定基础.[方法]从周期型马来丝虫虫体中抽提总RNA,以mRNA为模板,采用RT-PCR法体外扩增出BmCP基因序列,扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pMD18-T载体,转化大肠杆菌（E. coli）DH5α,筛选阳性克隆,进行双酶切及PCR扩增签定,获得阳性重组质粒pMD18-T-BmCP,经测序验证,并进行同源性比较.[结果]RT-PCR扩增出一条约1 201 bp大小的特异性条带,重组质粒双酶切和以质粒为模板的PCR结果与预期相符,DNA序列分析与GeneBank已知的基因序列同源性为99%.[结论]成功构建了周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶重组质粒pMD18-T克隆载体,为进一步研究该基因的功能提供了条件.     

轮状病毒SA11衣壳蛋白VP7的毕赤酵母重组表达及IgY的制备

目的 真核重组表达轮状病毒(rotavirus,RV)SA11株VP7衣壳蛋白并制备、纯化其卵黄抗体(IgY).方法 将SA11标准株在MAl04细胞中增殖,收集病毒液.从病毒液中提取RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增获得SA11株衣壳蛋白VP7的长度为978 bp的编码基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体上,进行测序.将重组体哑克隆到分泌表达载体pPICZαB中,再将重组体转化人大肠杆菌Top10中,用BstXI线性化酶切重组质粒后电转入毕赤酵母X-33中,进行测序.转染成功的菌落再用甲醇诱导表达,亲和层析法纯化重组蛋白抗原,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blotting)鉴定,用重组蛋白免疫罗曼母鸡,收集鸡蛋,Western blotting鉴定、纯化IsY.结果 细胞增殖液中提取的RNA银染可见11个条带,成功构建了含pPICZαB-SA11 VP7的毕赤酵母X-33,毕赤酵母X-33分泌的融合蛋白被收集、纯化.毕赤酵母X-33表达的SA11 VP7的衣壳蛋白经Western blotting验证与预测蛋白相对分子质量40 200相符.从鸡蛋中提取的鸡的IgY验证为抗VP7的抗体.纯度可达到95%,1个鸡蛋能产10.2 mg的IgY.结论 抗重组RV SA11衣壳蛋白VP7和IgY的成功制备为疫苗和诊断试剂的开发奠定了基础.     

甲型流感病毒SwH1N1血凝素蛋白HA1真核表达载体的构建与表达

目的构建甲型流感病毒SwH1N1血凝素蛋白(HA1)的真核表达载体,并表达其编码蛋白HA1。方法利用RT-PCR技术扩增HA1基因,克隆至pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T-HA1质粒。双酶切pMD18-T-HA1与PXJ40后回收并连接回收片段,构建PXJ40-HA1真核表达载体,鉴定后转染293T细胞,用免疫印迹法(western-bolt)鉴定重组HA1蛋白的表达。结果实验成功构建HA1基因的真核表达载体,并在真核细胞中表达出分子量为40kD的重组蛋白。结论成功构建的甲型流感病毒SwH1N1HA1基因的真核表达载体,可为后期的流感快速检测及基因工程疫苗的制备奠定良好的基础。     

汉坦病毒S基因在原核细胞中高效表达的研究

目的通过基因工程的方法从鼠肺中扩增出汉坦病毒的S基因，并实现其蛋白的体外表达。方法应用RT—PCR方法扩增汉坦病毒汉城型（SEO）的YZG-Changchun株S基因，然后克隆到pMD18-T载体中，经序列分析后，定向克隆入原核表达载体pET-28a中，转化大肠埃希菌Rosetta用IPTG诱导表达后，将全菌裂解，用SDS-PAGE和Westem—blot检测重组菌中外源蛋白的表达情况和免疫反应性的分析。结果S基因在原核细胞中得到了高效表达，表达的蛋白占菌体蛋白总量的37％，且具有良好的免疫反应性。结论汉坦病毒S基因蛋白可通过基因工程手段获得体外高效表达，这将对其功能的研究及为汉坦病毒疫苗的研究提供基础。     

甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白真核表达载体的构建与表达

[目的]构建甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白真核表达载体,并在293T细胞中表达.[方法]采用RT-PCR技术,从甲型流感病毒H1N1毒株提取的病毒总RNA中,扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-NS1质粒,双酶切pMD18-T-NS1与PXJ40-HA后,构建真核表达载体PXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过免疫印迹法鉴定NS1蛋白的表达.[结果]酶切、测序证明重组真核表达载体PXJ40-HA-NS1构建成功,免疫印迹法可见NS1基因编码蛋白表达.[结论]成功构建甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白真核表达载体PXJ40-HA-NS1,并在293T细胞中传染表达,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究提供了材料.     

日本血吸虫pcDNA3．1．（＋）-SjPGK重组质粒的构建及鉴定

目的 构建日本血吸虫中国大陆株磷酸甘油酸激酶基因片段(SiPGK)的真核表达重组质粒，寻找新的预防日本血吸虫病的候选疫苗分子。方法 采用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)技术，从日本血吸虫总RNA中体外扩增SPGK基因片段；克隆人pMD18-T载体中，然后挑取阳性克隆经双酶切分析、PCR鉴定；亚克隆人真核表达载体pcDNA3．1( )中，阳性克隆经鉴定后进行脱氧核糖核酸序列测定；运用Blast程序，将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较。结果 RT-PCR特异性扩增出一条长约830bp大小的条带；重组质粒pMD18-T-SPGK和pcDNA3．1( )-SPGK经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增，均可获得一条与RT-PCR产物一致的DNA片段；脱氧核糖核酸序列测定和分析结果表明：SjPGK基因片段长为830bp，与SmPGK的核苷酸同源性为85％，分值为672；氨基酸同源性为94％，分值为473。结论 成功地构建pcDNA3．1( )-SiPGK重组质粒，为构建其核酸癌苗提供了条件。     

高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白NP真核表达载体的构建、表达与鉴定

目的构建高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白(NP)的真核表达载体,并在哺乳动物细胞中表达、鉴定其编码重组蛋白NP。方法采用RT-PCR法扩增NP基因,T-A克隆到pMD18-T载体中构建pMD18-T-NP质粒。经PCR、双酶切鉴定后,双酶切阳性质粒与pXJ40-HA载体,电泳后胶回收,连接目的片段,构建pXJ40-HA-NP质粒,经PCR、双酶切、测序分析鉴定为阳性的质粒即为NP蛋白的真核表达载体。转染293T细胞后,采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组NP蛋白的表达。结果成功构建了高致病性禽流感病毒H5N1亚型NP基因的真核表达载体,并在293T细胞中成功表达出分子量为56kD的重组蛋白。结论成功构建的NP蛋白真核表达载体为进一步研究其功能,研发高致病性禽流感病毒H5N1亚型的诊断、治疗方法和疫苗奠定了基础。     

人白细胞介素10基因克隆及真核表达

目的建立人白细胞介素-10(hIL-10)真核表达系统并观察其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达。方法用RT—PCR方法自活化的人外周血淋巴细胞扩增hIL-10cDNA，将其克隆至pMD18-T中，测序正确后，再定向插入至真核表达载体pCIneo中，经脂质体介导转染CHO细胞，检测其在细胞内外的表达和分泌并进行活性检测。结果RT—PCR扩增的hIL-10cDNA序列与GenBank中hIL-10cDNA序列一致；构建了真核重组表达载体pCIneO—hIL-10；转染CHO细胞后可检测到具生物活性的hIL-10的转录和表达。结论成功构建了hIL-10真核表达系统，为今后的临床研究及基因工程药物生产打下基础。     

日本血吸虫组织蛋白酶L家族1个新基因的克隆与序列分析

目的克隆与分析日本血吸虫组织蛋白酶L样(SjCLs)基因全长cDNA序列,为进一步研究其功能奠定基础。方法提取日本血吸虫成虫总RNA,经RT-PCR扩增获得cDNA序列;将目的片段连接至pMD18-T Simple载体上,连接产物转化大肠埃希菌,通过酶切和测序鉴定重组质粒;利用生物信息学软件分析序列的开放阅读框、蛋白序列的同源率和功能区。结果以成虫总RNA为模板进行RT-PCR,得到一段长为996 bp的cDNA片段,该片段含有完整读码框,该阅读框编码的蛋白含有331个氨基酸残基,分子量为38.3 kDa,命名为SjCLs;序列比对分析发现该蛋白氨基酸序列与SjCL2同源率最高,达到89.1%;进化树分析发现SjCLs与SjCL2亲缘关系也最近;SjCLs具有类似于SjCL2的N端信号肽,可能经加工后分泌到细胞外;两者所预测的功能基序及三维构象也基本相同。结论 SjCLs具有组织蛋白酶L的基本特征,从而证明研究获得组织蛋白酶L基因家族的一个新成员。