人可溶性补体受体1型双抗体夹心ELISA法的建立及初步应用

摘要：目的：建立定量检测人血清可溶性补体受体1型（sCR1）双抗体ELISA夹心法。 方法：用鼠抗人CD35单克隆抗体(mAb)包被反应板,以兔抗人sCR1抗体（PcAb）为夹心抗体,辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG为检测抗体,纯化后的人sCR1蛋白为标准品,建立定量检测人血清sCR1双抗体夹心ELISA法,并检测50例体检健康者和32例肝硬化患者血清样本中sCR1水平。 结果：建立的双抗体夹心ELISA法检测人血清sCR1的线性范围为15.6～250 ng/mL。低、高浓度批内变异系数（CV）分别为9.3％、7.1％;批间CV分别为11.2％和9.82％;回收率分别为89.5％和92.5％。50例健康人和32例肝硬化患者血清sCR1水平分别为（33.82±5.88） ng/mL和（152.99±9.51） ng/mL,两者比较有统计学差异（t=70.18, P＜0.001）。 结论：成功建立了检测人血清sCR1的双抗体夹心ELISA法,重复性和准确性较好。初步发现肝硬化患者血清sCR1水平显著升高。     

用兔抗人分化抑制因子3抗体建立双抗体夹心ELISA法及初步临床应用

目的 制备兔抗人分化抑制因子3（Id3）多克隆抗体,建立检测血清Id3的双抗体夹心ELISA技术。 方法 用纯化的Id3重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗Id3多克隆抗体,通过多肽亲和层析柱去除非特异性成分,免疫细胞化学染色、免疫双向扩散及间接ELISA法检测抗体特异性和效价。制备辣根过氧化物酶（HRP）标记抗Id3,以纯化Id3重组蛋白为标准抗原制备标准曲线,建立定量检测人Id3的双抗体夹心ELISA法。 结果 免疫细胞化学染色显示,制备的兔抗血清能与人Id3蛋白特异性结合,所得兔抗血清效价分别为1 ∶ 8（琼脂双向扩散）和1 ∶ 8 000（ELISA）。ELISA法的包被抗体和酶标记抗体的工作浓度分别为5 μg/ml和1 ∶ 4 000,标准曲线为Y= 0.079 3+0.018 8X,r=0.997。检测线性范围为2～64 U/ml,平均回收率为98.2%, 批内平均变异系数（CV）为4.4%, 批间平均CV为7.2%。该方法可用于人血清Id3含量的检测。 结论 兔抗人Id3多克隆抗体的制备及夹心ELISA法的建立为今后研究Id3蛋白的功能及其在临床和基础医学中的应用奠定了基础。     

人血清微量sCR1蛋白双抗体夹心ELISA试剂盒的评价与应用

目的对研制的人血清微量sCR1蛋白双抗体夹心ELISA试剂盒的重复性、稳定性进行评价,并了解其实际应用效果。方法选取中、晚期肝硬化患者50例和健康体检者50例分别作为肝病组和正常对照组,以鼠抗人CD35单克隆抗体、兔抗人sCR1多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG为包被抗体、夹心抗体和检测抗体,以纯化后的重组人sCR1蛋白为标准品,建立人血清微量sCR1蛋白双抗体夹心ELISA试剂盒,进行试剂盒重复性和稳定性检验,并应用该试剂盒检测两组血清sCR1蛋白水平。结果双抗体夹心ELISA法检测人血清微量sCR1蛋白的线性范围是15.60~250.00ng/mL;血清sCR1蛋白水平对吸光度值的回归方程为Y=112.10 X2+18.21 X+1.694(r2=0.998);重复性检测中,高、低水平标准品检测值的批内相对标准偏差(RSD)分别为6.20%、7.40%,批间RSD分别为6.70%和7.90%;试剂盒稳定性检测中,RSD均不大于0.01;肝病组血清sCR1表达水平显著高于正常对照组(P0.01)。结论人血清微量sCR1蛋白双抗体夹心ELISA试剂盒线性范围广、重复性好、易于保存,适合于临床和科研检测工作。     

测定人红细胞嘧啶5′核苷酸酶含量的双抗体夹心ELISA方法

为了进一步探讨嘧啶5′核苷酸酶(P5′N)缺乏症的发病机制,我们利用P5'N的特异性底物尿苷一磷酸(UMP)作为配基,制备尿苷一磷酸-己二酰肼-琼脂糖4B(UMP-ADH-Sepharose 4B)亲和层析柱,结合硫酸铵分级分离和沉淀、离子层析及亲和层析等方法提纯人红细胞P5′N.将所得P5′N免疫家兔,获得兔抗人抗体.以兔抗人P5′N抗体为包被抗体,辣根过氧化物酶(HRP)-兔抗人P5′N抗体为显示抗体,经方阵法、抗原阻断试验及抗原替代试验后,建立定量测定人红细胞的P5'N双抗体夹心酶联免疫吸附实验.实验结果显示,所得兔抗人红细胞P5′N抗体效价为14,所建双抗体夹心ELISA法灵敏度为5 ng/ml,其阻断率大于95%,而取代率小于30%.同时,测定正常人红细胞P5′N含量为(71.77±10.98)ng/mg NHP.该法特异性强,敏感性高,可检测最低含量为5-20 ng/ml的P5'N含量,在临床上能适应大样本测定.     

双抗体夹心ELISA测定人血浆可溶性血管内皮钙粘蛋白方法的建立及其应用研究

目的:建立测定人血浆可溶性血管内皮钙粘蛋白(sVE-cadherin)浓度的双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,并探讨其临床应用价值。方法:应用原核表达的人VE-cadherin重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,采用棋盘格滴定法筛选出最佳双抗体组合,其中检测抗体采用辣根过氧化物酶(HRP)标记,建立检测人血浆sVE-cadherin双抗体夹心ELISA方法,并进行方法学评价。同时采用该法检测28名健康体检者和60例肿瘤患者的血浆sVE-cadherin浓度。结果:经筛选共获得6株单克隆抗体,通过筛查配对,成功建立检测人血浆可溶性VE-cadherin的双抗体夹心ELISA方法。该方法的检测限为24.7 pg/ml,批内变异系数(CV)为4.1%-7.7%,批间CV为8.7%-10.8%,平均回收率为96.7%。用该法检测28名健康体检者血浆VE-cadherin浓度为262.1±11.75 pg/ml,而用该方法检测24例白血病患者血浆VE-cadherin浓度为173.9±17.98 pg/ml,显著低于正常人(P0.01),14例胃癌患者血浆VE-cadherin浓度为311.7±25.24 pg/ml(P0.05),11例肺癌患者血浆VEcadherin浓度为206.8±25.01 pg/ml,均低于正常人(P0.05),11例其他肿瘤(9例乳腺癌,1例胶质瘤,1例肝癌)患者血浆VE-cadherin浓度为310.7±11.82 pg/ml(P0.05)。结论:建立的双抗体夹心ELISA试剂盒有较好的灵敏度及特异性,可用于人血浆中可溶性VE-cadherin含量的检测,并可作为肿瘤诊断的一种新检测指标。     

抗人S100A7抗体的制备

目的 制备兔抗人S100A7（hS100A7）多克隆抗体。方法制备原核表达重组人S100A7,用纯化的hs100A7为免疫原免疫新西兰大白兔,制备兔抗人S100A7抗体,并以问接ELISA测定抗体效价,以Westernblot和免疫组织化学法鉴定抗体的特异性。结果成功制备了重组人S100A7及其抗体,ELISA结果显示抗体效价达1：16000,Western blot和组织化学法分析表明该抗体能特异结合hS100A7。结论以纯化的重组人S100A7为免疫原,成功地制备了效价高、特异性强的兔抗人S100A7抗体。     

兔抗人KiSS-1抗体的制备与鉴定

目的 制备兔抗人KiSS-1多克隆抗体.方法 聚合酶链反应（PCR）法扩增出KiSS-1基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠埃希菌BL21（DE3）.采用异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白的表达,采用镍离子螯合琼脂糖凝胶（Ni^2＋-NTA）亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫家兔,制备多克隆抗体,并用酶联免疫吸附测定（ELISA）、Western blot及免疫组织化学法检测抗体.结果 成功构建了KiSS-1原核表达载体pET28/ KiSS-1,高效表达并纯化KiSS-1蛋白,间接ELISA检测所制备抗体的效价为1：6 400.Western blot鉴定制备的抗体与KiSS-1蛋白能特异性结合,免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人卵巢癌组织中的天然KiSS-1.结论 成功制备了效价高、特异性较强的兔抗人KiSS-1抗体,为进一步探讨KiSS-1在卵巢癌的发生、发展过程中的作用奠定了基础.     

人偏肺病毒F1、F2亚单位原核表达系统的构建及多克隆抗体制备

目的 构建人偏肺病毒融合蛋白亚单位F1、F2原核表达系统,初步获得抗F1、F2重组蛋白的多克隆抗体,为相关疫苗的研究奠定基础。 方法 聚合酶链反应(PCR)法扩增F1、F2基因片段,经T-A克隆确保其准确性,双酶切后插入原核表达载体pET32a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),按优化后条件大量诱导表达,纯化后经Western Blot检测特异性。取纯化蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA法检测效价,间接免疫荧光法(IFA)检测多克隆抗体是否能与人偏肺病毒发生特异性反应。 结果 F1、F2基因均正确插入pET32a(+)中,并具有正确的读码框架。0.5 mmol/L IPTG 37 ℃诱导培养5 h可获得大量带His标签的重组蛋白,纯化后浓度分别达到200 g/ml和300 g/ml。Western Blot结果显示,重组蛋白可被抗His标签抗体特异识别;免疫小鼠获得多克隆抗体效价分别为抗pET32a-F1最高1 : 640,抗pET32a-F2最高1 : 40 960。IFA显示抗pET32a-F1、抗pET32a-F2多克隆抗体均可与人偏肺病毒作用产生特异性荧光。 结论 成功构建了F1、F2的原核表达质粒, 并在大肠埃希菌中获得高效表达,该蛋白具有良好的抗原性;免疫小鼠获得特异性多克隆抗体,有利于人偏肺病毒的深入研究。     

纤溶酶-α2-抗纤溶酶复合物单克隆抗体的制备及其应用

目的:制备纤溶酶-α2-抗纤溶酶复合物(plasmin-α2-antiplasmin complex, PAP)的单克隆抗体并建立其酶免疫检测方法.方法:从人血浆中提纯的PAP作为免疫原制备特异性单克隆抗体,通过双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)对该单克隆抗体应用价值进行评估.结果:获得特异针对PAP新抗原的单抗3C10和针对PAP及纤溶酶原(Plg)的单抗2B9,效价均为1.25×10-6,其对PAP的亲和常数分别为4.69×10-10M和5.62×10-9M.以此建立的双抗体夹心ELISA检测PAP在0～160ng/ml范围内呈良好的线性关系,批内CV＜7%,检测敏感度为5ng/ml,与ADI公司的PAP试剂盒相关性良好(r=0.9629).结论:本法可应用于临床评估纤溶系统的激活状态.     

纤溶酶—α2—抗纤溶酶复合物单克隆抗体的制备及其应用

目的制备纤溶酶-α2-抗纤溶酶复合物(plasmin-α2-antiplasmin complex, PAP)的单克隆抗体并建立其酶免疫检测方法.方法从人血浆中提纯的PAP作为免疫原制备特异性单克隆抗体,通过双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)对该单克隆抗体应用价值进行评估.结果获得特异针对PAP新抗原的单抗3C10和针对PAP及纤溶酶原(Plg)的单抗2B9,效价均为1.25×10-6,其对PAP的亲和常数分别为4.69×10-10M和5.62×10-9M.以此建立的双抗体夹心ELISA检测PAP在0～160ng/ml范围内呈良好的线性关系,批内CV＜7%,检测敏感度为5ng/ml,与ADI公司的PAP试剂盒相关性良好(r=0.9629).结论本法可应用于临床评估纤溶系统的激活状态.     

人可溶性CD14检测体系的建立

目的　建立人可溶性CD14双抗体夹心ELISA检测体系。方法　用抗人CD14单抗为捕获抗体 ,加入待测抗原 ,第二抗体为兔抗人CD14多克隆抗体 ,最后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG。结果　本检测体系灵敏度高 ,可达 5ng ml,特异性强 ,测量范围 5～ 12 0ng ml,重复性好 ,各项技术指标与国外同类产品相当。结论　本检测体系能够检测人体液中和细胞培养上清中sCD14 ,适用于临床及基础研究。     

人血小板膜糖蛋白VI胞外区片段的原核表达及多克隆抗体的制备

目的 探讨在原核细胞中表达人血小板膜糖蛋白Ⅵ（GPVI）胞外区片段，制备其多克隆抗体。方法 采用PCR技术扩增人血小板GPVI胞外区片段123aa～268aa的基因序列，构建其原核表达载体，在大肠杆菌中诱导融合蛋白表达。表达产物经亲和层析法纯化及鉴定后，免疫家兔制备多克隆抗体。采用已知单克隆抗体进行ELISA双抗夹心法、Westernblot和流式细胞术鉴定其特异性。结果构建的重组质粒经酶切和测序证实序列正确。经诱导表达在相对分子量为4200处有一条明显融合蛋白条带，Westernblot分析证实与预期值一致。所得的抗血清效价为1：128，ELISA双抗夹心法检测表明，所制抗体识别血小板GPVI分子。Westernblot和流式细胞术检测结果显示所制抗体可与血小板裂解液中及血小板膜表面GPVI分子发生特异性免疫反应。结论利用原核细胞表达的人血小板GPVI分子胞外区片段能有效地诱发动物产生多克隆抗体，所得抗体与人血小板上GPVI分子特异性结合，为深入研究GPVI分子提供了工具。     

1种改良的高效单特异性兔多克隆抗体的制备方法

目的建立1种改良的高效单特异性兔多克隆抗体的制备方法。方法用RT-PCR方法获得bax保守N端1～123位氨基酸基因片段,并将其插入pET42a原核表达载体,诱导表达的Bax融合蛋白组合应用GST、His亲和层析技术获得免疫原(pET42a/Bax融合蛋白),HPLC鉴定纯度达95%。利用改良快速免疫法获得人Bax兔多克隆抗体,并经蛋白A柱亲和层析技术,抗原亲和纯化技术获得高效价高特异性的抗体。间接ELISA检测抗体滴度、Western blot和免疫组化试验检测抗体特异性,并与商业化抗体进行对比。结果通过快速免疫法得到人Bax兔多克隆抗体,经过Protein A柱纯化,再经抗原亲和纯化后,间接ELISA证明,抗体效价均达1:51 200;Western blot显示,只有经过抗原亲和纯化后的抗体特异性高,无其他杂带;免疫组化证明,在原发性肝癌组织中,人Bax兔多克隆抗体能特异地和内源性Bax结合,其高效高特异性已达国外Santa Cruse公司Bax商业化抗体水平。结论快速免疫法与抗原亲和纯化相结合,获得人Bax高效单特异性兔多克隆抗体,建立了1种改良的高效单特异性兔多克隆抗体的制备方法。     

抗人白细胞介素31多克隆抗体的制备及活性鉴定

目的：采用在原核表达系统表达的人IL-31蛋白免疫新西兰兔，制备兔抗人IL-31多克隆抗体。方法：利用IPTG诱导hIL-31在大肠杆菌中表达，纯化hIL-31重组蛋白，免疫新西兰兔制备抗hIL-31多克隆抗体。Western-blot 鉴定抗体的特异性，ELISA法测定抗体效价。荧光定量PCR检测多克隆抗体对IL-31诱导MIP-3β分泌的阻断效应。结果：人IL-31经IPTG诱导后可在大肠杆菌中大量表达，表达量占细菌总蛋白的30%，纯化后的蛋白纯度高；IL-31重组蛋白免疫新西兰兔，通过抗体效价测定，获得了效价达1：2560的多克隆抗体，可阻断IL-31刺激的MIP-3β的分泌。结论：原核表达的hIL-31蛋白能刺激家兔产生抗体，其多克隆抗体的效价高，具有阻断IL-31作用的生物学活性。     

双抗体夹心ELISA检测人胎儿血红蛋白体系的建立

目的建立一种定量检测人胎儿血红蛋白(HbF)的双抗体夹心ELISA方法。方法用抗人HbF单抗作为捕获抗体,加入待测抗原,检测抗体为兔抗人HbF多克隆抗体,最后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG。结果本检测体系灵敏度约为0.039μg/ml,测量范围0.039-24.66μg/ml,特异性强,重复性好,100份血标本的检测结果与高效液相色谱法结果符合率高。结论建立了一种可用于检测人外周血HbF的双抗体夹心ELISA方法,有望为临床上诊断某些与HbF有关的疾病提供帮助。     

Galectin-7多克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备鼠抗重组半乳糖凝集素7(Galectin-7)多克隆抗体及其在膀胱癌组织中特异性鉴定。方法 PCR法从人包皮组织中扩增Galectin-7基因,并构建到pET28a表达载体中,使用IPTG诱导重组蛋白的表达,通过镍柱亲和层析纯化获得Galectin-7蛋白。以纯化的Galectin-7蛋白混合福氏完全佐剂免疫Balb/C小鼠制备抗体,并用ELISA,Western blot及免疫组织化学法检测抗体。结果 成功表达、纯化了Galectin-7重组蛋白,ELISA检测Galectin-7蛋白免疫的小鼠血清效价为1:32 000,Western blot显示该抗体能与天然的Galectin-7特异结合,免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人膀胱肿瘤组织的天然Galectin-7。结论 通过制备重组Galectin-7蛋白为免疫原,免疫家兔,成功地制备了效价高、特异性好的抗Galectin-7多克隆抗体。     

a-N-乙酰半乳糖胺酶多克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的制备a-N-乙酰半乳糖胺酶(NAGA)的高效价高特异性的兔多克隆抗体。方法利用pET22b-NA-GA/BL21(DE3)工程菌株表达NAGA,经Ni2+Sepharose 6 FF亲合层析,Phenyl Sepharose 6 FF疏水层析两步纯化,得到纯度95%的NAGA作为抗原免疫新西兰白兔,获得NAGA的兔抗血清,并经HiTrap rProtein A柱纯化获得高效价高特异性的抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,用Western blotting评价抗体特异性。结果制备得到的NAGA兔多克隆抗体血清效价为1×106,经过rProtein A柱纯化后抗体蛋白纯度95%,效价为1×105;Western blotting显示:该NAGA兔多克隆抗体只与NAGA发生特异性反应。结论获得了NAGA的高效价高特异性的兔多克隆抗体。     

白念珠菌CDRl和CDR2多克隆抗体制备及鉴定

目的：制备特异性白念珠菌外排泵（CaCDRl和CaCDR2）的多克隆抗体,为研究CaCDRl和CaCDR2在介导白念珠菌耐药中的作用奠定基础。方法：利用Pfam网络预测程序和Blastn、Blastx程序设计引物．采用PCR法获得白念珠菌SC5314基因组上486bp长度的CDRl和CDR2目的基因,并将其克隆入pET-28a（＋）质粒,构建重组表达质粒后,转化人大肠埃希菌BL21宿主菌内,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下表达6xHis融合蛋白;经镍柱纯化蛋白后,免疫新西兰兔,制备兔抗多克隆抗体。用ELISA及蛋白印迹法检测该抗体的效价和特异性。结果：ELISA法检测所制备抗体的效价最终定为1：12800,工作浓度定为1：800;蛋白印迹法检测结果显示,抗体能与CaCDRl及CaCDR2蛋白特异性结合。结论：成功获得具有较高效价和良好特异性的CaCDRl、CaCDR2多克隆抗体．可用于白念珠菌CaCDRl、CaCDR2蛋白水平的鉴定。     

血清载脂蛋白A5 ELISA的建立及其初步应用

目的建立人血清中载脂蛋白A5(ApoA5)双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA),并初步观察其在2型糖尿病(T2DM)中的应用价值。方法用棋盘滴定法确定捕获抗体、检测抗体的最佳工作浓度;绘制标准曲线,确定线性范围、检测限;检测该方法的精密度和特异性,并分别检测T2DM患者及健康人血清中ApoA5水平以及其它生化指标。结果本研究建立的方法测定范围为5-640ng/ml,最低检出量2ng/ml,批内和批间变异系数(CV)分别为5.6%和6.7%。T2DM患者血清中ApoA5水平为(494.2±233.1)ng/ml,显著低于健康对照组(668.2±357.0ng/ml,P=0.001);血清ApoA5浓度与HDL-c呈正相关(r=0.16,P=0.031),与TG呈负相关,但是没有达到统计学差异(r=-0.028,P=0.717)。结论本研究建立的人血清ApoA5双抗体夹心ELISA灵敏度高,特异性好,可应用于临床ApoA5的检测;ApoA5可能是T2DM的独立危险因素,监测ApoA5浓度对于T2DM的预防和干预具有一定临床意义。     

双抗体夹心ELISA测定人广泛型线粒体肌酸激酶方法的建立

目的建立测定人血清广泛型线粒体肌酸激酶（uMtCK）浓度的双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）。方法应用原核表达的uMtCK重组蛋白免疫小鼠获得7株单克隆抗体,采用棋盘格滴定法筛选出最佳双抗体组合,其中抗体19F11进行辣根过氧化物酶（HRP）标记作为检测抗体,抗体3C1作为俘获抗体,建立检测人uMtCK双抗体夹心ELISA方法,并进行方法学评价。同时采用该法检测50名健康体检者和85例肿瘤标志物[甲胎蛋白（AFP）或癌胚抗原（CEA）]阳性患者的血清。结果通过筛查获得配对抗体,建立检测人uMtCK的双抗体夹心ELISA方法。该法的检测限为28．8ng／mL,批内变异系数（CV）为4．5％～7．7％,批间CV为8．2％～13．5％,平均回收率为97．1％。用该法检测50名健康体检者血清uMtCK浓度,结果均为阴性;85例肿瘤标志物阳性患者中有15例检出uMtCK,浓度为52．8～1442．2ng／mL。结论建立的双抗体夹心ELISA可以用于测定人血清uMtCK浓度。