iRNA抑制人黑素瘤M14细胞生存素的表达

目的 通过构建生存素(survivin)的小干扰RNA(siRNA)表达质粒,研究其对人黑素瘤M14细胞生存素表达的抑制作用,为后续研究奠定基础.方法 设计有小发夹结构的生存素siRNA对应模板DNA序列,克隆至pRNAT-H1.1/neo质粒,构建重组质粒pRNAT-H1.1/neo-survivin,转染人黑素瘤M14细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹检测生存素表达.结果 酶切及测序结果 证实重组质粒pRNAT-H1.1/neo-survivin构建成功.将重组质粒及空载体(阴性对照)转染M14细胞48 h后,siRNA处理组M14细胞生存素表达较空白对照组显著下降,表达抑制率在mRNA和蛋白水平分别为62.3%±1.5%和53.6%±0.9%.结论 生存素siRNA表达质粒pRNAT-H1.1/neo-survivin可抑制人黑素瘤M14细胞生存素的表达.     

RNA干扰下调PLK1基因对恶性黑素瘤细胞侵袭和失巢凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰技术下调PLK1基因对恶性黑素瘤细胞侵袭的影响和可能机制。 方法 用PLK1小干扰核糖核酸分子（siRNA）转染人恶性黑素瘤A375细胞后,分别用实时定量PCR和 Western 印迹法检测PLK1mRNA和蛋白表达,Transwell方法检测细胞侵袭能力,以平板集落形成方法了解癌细胞集落形成情况,分别用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL方法检测癌细胞失巢凋亡情况。 结果 恶性黑素瘤A375细胞经PLK1 siRNA转染后,PLK1 mRNA和蛋白表达明显下调;siRNA转染组癌细胞生长明显受到抑制。与空白对照组和脂质体对照组比较,siRNA细胞转染组侵袭性明显下降。失巢凋亡检测发现,琼脂糖凝胶电泳出现明显的梯度图谱。TUNEL结果显示,PLK1 siRNA可诱导恶性黑素瘤A375细胞凋亡,siRNA细胞转染组较空白对照组和脂质体对照组凋亡指数明显升高［3.86% ± 0.35%（3.125 nmol/L siRNA组）,7.35% ± 0.36%（6.250 nmol/L siRNA组）,17.56% ± 0.38%（12.500 nmol/L siRNA组）比1.15% ± 0.25%和1.18% ± 0.22%）,均P < 0.01］。 结论 PLK1 siRNA可抑制恶性黑素瘤细胞的侵袭,其机制可能与诱导失巢凋亡有关。     

生存素小分子干扰RNA对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生存素基因表达及生物学功能的影响

目的 探讨生存素小分子干扰RNA（siRNA）对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生存素基因表达及细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭力的影响。方法 培养的A431细胞分为3组：生存素siRNA组、阴性对照组和空白对照组,分别用50.0 nmol/L脂质体包裹的生存素基因序列特异性siRNA、无关序列siRNA阴性脂质体及预制囊泡转染。实时定量反转录-聚合酶链反应（RT?PCR）、Western印迹法分别检测A431细胞生存素mRNA及蛋白的表达。采用MTT比色法检测细胞增殖,流式细胞仪膜联蛋白Ⅴ/碘化丙锭双染法检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭力,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果 转染后48 h,生存素siRNA组、阴性对照组、空白对照组A431细胞中生存素mRNA水平分别为0.56 ± 0.15、0.88 ± 0.37、0.90 ± 0.43,蛋白表达水平分别为0.59 ± 0.04、0.86 ± 0.05、0.91 ± 0.07,差异均有统计学意义（F = 276.67、243.61,均P < 0.001）,且生存素siRNA组生存素mRNA和蛋白表达水平均显著低于阴性对照组和空白对照组,差异均有统计学意义（P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（均P > 0.05）。重复测量方差分析显示,转染生存素siRNA能抑制A431细胞增殖（F = 13.19,P = 0.004）,且生存素siRNA组A431细胞增殖抑制率明显高于阴性对照组和空白对照组（均P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组比较,差异无统计学意义（P > 0.05）。转染后24 h, 3组间A431细胞凋亡率差异有统计学意义（F = 83.97,P = 0.002）,且生存素siRNA组A431细胞凋亡率显著高于阴性对照组（P < 0.05）和空白对照组（P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（P > 0.05）。转染后48 h,生存素siRNA组G2/M期细胞比例显著高于阴性对照组（P < 0.05）和空白对照组（P < 0.05）,而生存素siRNA组A431细胞迁移数及侵袭数均显著低于空白对照组（均P < 0.05）和阴性对照组（均P < 0.05）。结论 生存素序列特异性siRNA能抑制A431细胞生存素基因表达和细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,提示生存素可成为皮肤鳞状细胞癌基因治疗的靶点。     

非转移性黑素瘤糖蛋白B对黑素瘤细胞增殖、迁移及黑素形成的影响北大核心CSCD

目的探讨非转移性黑素瘤糖蛋白B（GPNMB）对黑素瘤细胞增殖、迁移及黑素形成的影响。方法以人原代黑素细胞、黑素瘤细胞系M14、G-361为研究对象,采用免疫荧光法检测GPNMB表达量。细胞分为三组,实验组加入GPNMB—siRNA,阴性对照组加入阴性对照-siRNA,空白对照组为未经处理的细胞。实时定量逆转录（RT）-PCR检测GPNMB—siRNA的转染效率,以噻唑蓝法和Transwell小室法分别检测细胞的增殖及侵袭能力,并用分光光度计检测黑素水平,结果进行t检验分析。结果GPNMB—siRNA转染下调了GPNMBmRNA及蛋白的表达水平,并显著抑制黑素瘤细胞的增殖和迁移能力。其中黑素瘤M14细胞和G361细胞的增殖能力分别降低35％和40％,迁移能力分别降低49％和51％;同时,黑素细胞、黑素瘤M14细胞和G361细胞黑素形成分别降低73％、82％和69％。结论GPNMB缺失能抑制黑素瘤的增殖、迁移以及黑素瘤中黑素的形成,表明GPNMB在黑素瘤的发生发展中起重要作用。     

RNA干扰趋化因子受体CXCR7基因对黑素瘤M14细胞侵袭和迁移的影响

目的 探讨靶向沉默趋化因子受体CXCR7基因对黑素瘤细胞株M14侵袭和迁移能力的影响。方法 采用Western印迹实验检测黑素瘤M14和A375细胞CXCR7蛋白的表达,选取高表达CXCR7蛋白的M14细胞作为研究对象。将M14细胞分为实验组、阴性对照组和空白对照组：实验组转染CXCR7-siRNA,阴性对照组转染阴性对照siRNA,空白对照组不做任何处理。采用实时定量PCR和蛋白质印迹法分别检测CXCR7 mRNA和蛋白在M14细胞中的表达水平, Transwell小室法及细胞划痕法检测干扰前后细胞侵袭及迁移能力的变化。 结果 实验组M14细胞CXCR7 mRNA及蛋白相对表达量分别为0.412 ± 0.023、0.144 ± 0.005,明显低于阴性对照组（1.211 ± 0.117、1）以及空白对照组（1.000 ± 0.102、1.016 ± 0.004）,差异均有统计学意义（F值分别为30.068、11 485.5,P值分别为0.001、0.000）。实验组M14细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数为（20.617 ± 1.503）个,明显少于阴性转染对照组［（42.000 ± 6.018）个］和空白对照组［（43.627 ± 2.152）个］,3组间比较差异有统计学意义（F = 32.416,P = 0.001）。划痕实验中,实验组每高倍视野（× 200）下细胞迁移数为15.00 ± 1.10,明显少于阴性对照组（44.90 ± 2.20）和空白对照组（45.30 ± 2.30）,3组间比较差异有统计学意义（F = 2 411.945,P = 0.000）。 结论 靶向沉默CXCR7能显著抑制黑素瘤M14细胞的侵袭和迁移,有望为皮肤黑素瘤提供潜在的治疗靶点。     

生长抑制因子4对人黑素瘤细胞株M14凋亡的调控

目的探讨生长抑制因子4对人黑素瘤细胞株M14凋亡的调控及其作用机制。方法构建人生长抑制因子4基因的真核表达质粒,并将其转导入M14细胞,采用流式细胞术及TUNEL法检测细胞的凋亡情况,同时采用蛋白印迹法分析凋亡通路的活化及通路相关蛋白的表达情况。结果转染外源生长抑制因子4基因后,M14细胞出现了明显的凋亡峰并伴有G2/M期阻滞,凋亡率及凋亡指数也明显高于转染空载质粒及未转染M14细胞,差异有显著性意义(P<0.01)。还发现转染外源生长抑制因子4基因后,M14细胞凋亡通路活化,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调,而促凋亡蛋白Bax表达上调,凋亡执行蛋白Cyt-c表达增加而caspase3表达下降。结论生长抑制因子4可能通过活化凋亡通路,进而促进M14细胞凋亡。这可能也是ING4抑制M14细胞增殖的机制之一。     

生长抑制因子4对黑素瘤M14细胞增殖的影响

目的 构建人生长抑制因子4基因的真核表达质粒,并将其转染入黑素瘤M14细胞,观察生长抑制因子4对M14细胞增殖的影响。方法 通过RT-PCR法从人正常胃黏膜组织获得目的基因片段,将其克隆入空载质粒pCDNA3.1,构建真核表达载体pCDNA3.1-ING4,采用PCR及基因测序等方法进行鉴定。将其转染入黑素瘤M14细胞,检测生长抑制因子4的表达情况及对M14细胞增殖的影响。结果PCR所得产物为约750 bp的DNA片段,与预测大小相符,DNA序列测定与报道结果一致。蛋白印迹及免疫细胞化学法均显示转染外源生长抑制因子4基因的M14细胞有更高的生长抑制因子4（ING4）表达,细胞活力及生长速度明显低于转染空载质粒的M14细胞和未转染的M14细胞。结论 成功构建了重组人生长抑制因子4基因表达质粒pCDNA3.1-ING4,转染的外源生长抑制因子4基因可在细胞内表达并对M14细胞的增殖起抑制作用。     

RNA干扰神经突起导向因子 Netrin-1表达下调对鳞状细胞癌SCL-1细胞的影响

目的 探讨神经突起导向因子 Netrin-1表达下调对皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）SCL-1细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法 脂质体2000将Netrin-1 siRNA和对照siRNA转染皮肤鳞癌SCL-1细胞。将细胞分为对照1组（未处理组）、对照2组（siRNA对照组）、实验组（Netrin-1 siRNA组）。Western印迹检测转染Netrin-1 siRNA后SCL-1细胞Netrin-1蛋白的表达。人胆囊收缩素/缩胆囊素8肽（CCK-8）ELISA试剂盒分析细胞增殖的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。Western 印迹检测caspase-3、caspase-9及MMP-2的表达。结果 Netrin-1 siRNA明显下调SCL-1细胞中Netrin-1蛋白的表达。Netrin-1表达下调明显抑制SCL-1细胞的增殖和诱导细胞凋亡,增加caspase-3和caspase-9的表达,同时可显著抑制MMP-2的表达。结论 Netrin-1表达下调可介导鳞癌细胞增殖抑制、增高细胞凋亡率和降低细胞迁移能力。     

BRAFV600E突变基因对人黑素瘤细胞侵袭能力影响的研究

目的 探讨BRAFV600E突变基因对黑素瘤细胞侵袭能力的影响。方法　用构建成功的质粒载体转染人黑素瘤细胞株A375,在体外干扰BRAFV600E突变基因,用Transwell小室检测肿瘤细胞侵袭能力,用明胶酶法检测基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的变化,采用RT-PCR和Western印迹检测MMP-2和血管内皮细胞生长因子（VEGF）mRNA和蛋白表达。结果　特异性短发卡RNA抑制人黑素瘤细胞MMP-2和VEGF mRNA和蛋白的表达,MMP-2 mRNA和蛋白表达分别减少35%和80%,VEGF则减少45%和14%。转染特异性质粒的黑素瘤细胞穿过Metrigel的数目下降69%。结论 BRAFV600E突变增强黑素瘤细胞的侵袭能力,特异性shRNA可以使瘤细胞的侵袭性下降。     

RNAi沉默c-Met基因对黑素瘤A375细胞生物学行为的影响

目的探讨c-MetshRNA表达载体对人黑素瘤A375细胞增殖、侵袭能力的影响。方法以pGenesil-1质粒为载体,以c-Met为靶基因,构建shRNA表达载体,并将其转染至体外培养的人黑素瘤A375细胞中。倒置相差显微镜下观察经干扰后瘤细胞的形态学变化;采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法分别检测转染细胞c-Met基因和蛋白的表达水平;四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测转染后细胞的生长活力;Transwell小室法测定转染细胞体外侵袭能力。结果构建了pGenesil-1-c-MetshRNA重组质粒,并成功转染A375细胞。转染后A375细胞缩小,变圆。RT-PCR显示转染后c-Met mRNA的表达显著降低,以48h为著,下降近64%;Western blot证实转染后蛋白的表达下降近65%;MTT法显示细胞的活力降低为(68.25±4.4)%;Transwell小室测定转染细胞体外侵袭能力明显下降。结论 pGenesil-1-c-MetshRNA重组质粒明显下调c-Met在黑素瘤细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞增殖及其侵袭能力。     

UBA3在黑素瘤细胞的表达及其影响黑素瘤细胞生物学行为的研究

【摘要】 目的 探讨UBA3在黑素瘤细胞中的表达,初步观察干扰UBA3对黑素瘤细胞生物学行为的影响。 方法 用RT-PCR技术观察3株黑素瘤细胞中UBA3的表达,并利用siRNA技术对M14细胞中UBA3的表达进行干扰,检测转染后细胞内UBA3、连接态NEDD8以及p53的表达,并观察转染前后细胞的凋亡及迁移能力的改变。 结果 在A375、M14及MV3中UBA3的表达均较正常黑素细胞上调,其中M14细胞上调最明显,成功干扰M14中UBA3的表达后,细胞内连接态NEDD8的表达下降,p53的表达明显增加,同时M14细胞凋亡增加、迁移能力下降。 结论 构建的质粒可干扰UBA3的表达,影响细胞的Nedd化进程,从而影响细胞的生物学行为。     

InnVit基因对B10BR细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的 分析InnVit基因的抑制和过表达对永生化黑素细胞株B10BR细胞增殖、周期及凋亡的影响,探讨InnVit基因的生物学功能及其对白癜风中黑素细胞缺失的影响。方法 化学合成InnVit基因特异性siRNA片段以及构建过表达质粒载体P3XF-P120,lipofectamineTM 2000脂质体方法转染B10BR细胞。半定量RT-PCR法检测InnVit基因mRNA水平;Western印迹检测该蛋白水平变化;MTT法测定细胞增殖情况;流式细胞技术分析细胞周期和凋亡的变化。结果 InnVit基因抑制后mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组,InnVit基因过表达质粒组mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组;转染后24、48、72 h抑制组的细胞存活量极显著下降（P < 0.01）,过表达质粒组的细胞存活量在48和72 h极显著增加（P < 0.01）。转染后48 h基因抑制组的早期凋亡率从（10.24 ± 1.00）%升至（37.34 ± 3.26）%,过表达质粒组早期凋亡率从（14.58 ± 1.49）%降至（8.43 ± 0.86）%,与对照组比较,差异均有统计学意义（P < 0.01）;转染48 h基因抑制组的G1期细胞由（56.11 ± 5.46）%增至（69.76 ± 6.08）%（P < 0.05）,过表达质粒组的G1期细胞由（55.14 ± 5.65 ）%降至（29.33 ± 3.01）%（P < 0.01）。结论 InnVit基因抑制使细胞增殖能力下降,促进细胞凋亡;InnVit基因的过表达增强了细胞的增殖能力,抑制细胞凋亡。其增殖能力的改变可能是通过细胞周期的调控调节的。     

siRNA抑制生存素基因对恶性黑素瘤细胞A375凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制恶性黑素瘤细胞株A375生存素基因表达后,对A375细胞凋亡的影响。方法 构建针对凋亡抑制基因生存素的siRNA真核表达载体pU-生存素-siRNA,用电穿孔法转染A375细胞,采用蛋白质印迹技术检测生存素的表达,并用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果 转染pU-生存素-siRNA后,生存素在A375细胞中的表达(0.24±0.02)较对照组(0.98±0.21)明显下降,试验组细胞的凋亡率(83%)较对照组(28%)明显增加。结论 通过RNA干扰技术可抑制生存素的表达,诱导A375细胞的凋亡增加。     

下调垂体瘤转化基因对皮肤鳞状细胞癌细胞SCL-1细胞增殖及迁移能力的影响

目的 研究下调垂体瘤转化基因（PTTG）的表达对皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）细胞SCL-1细胞增殖及浸润转移能力的影响,探讨其相关的分子机制。方法 将SCL-1细胞分为三组（未处理组、转染对照siRNA组及转染PTTG siRNA组）,首先利用CCK-8试剂盒研究下调PTTG对SCL-1细胞增殖能力的影响,并利用Boyden chamber研究三组细胞的浸润转移能力,通过实时荧光定量PCR和Western印迹方法检测MMP-2和MMP-9在三组细胞中的表达。结果 与未处理组和转染对照siRNA组相比,转染PTTG siRNA后能明显抑制SCL-1细胞增殖（P < 0.05）。此外,实时荧光定量PCR结果显示,转染PTTG siRNA后,PTTG、MMP-2和MMP-9的表达均明显下降,表达水平分别是对照组的0.8%、23.2%和21.3%。Western印迹结果表明,转染PTTG siRNA后,PTTG、MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平也明显下降（P < 0.05）。转染PTTG siRNA组的细胞穿膜数（51.38 ± 4.71）明显低于未处理组（131.33 ± 6.12）及转染siRNA对照组（127.72 ± 5.20）（P < 0.05）。结论 抑制PTTG的表达能显著抑制SCL-1细胞增殖及迁移,且可下调MMP-2和MMP-9表达。     

HINT1对人黑素瘤A375细胞裸鼠皮下异种移植瘤模型肿瘤生长及凋亡的影响

目的 探讨组氨酸三聚体核苷结合蛋白1（HINT1）对人黑素瘤A375细胞裸鼠皮下异种移植瘤模型肿瘤生长及凋亡的影响。方法 三组裸鼠随机皮下接种HINT1-A375、neo-A375及未转染的A375细胞,观察各组移植瘤的生长情况,计算成瘤率。组织病理切片观察移植瘤组织形态学改变,并应用TUNEL法检测移植瘤组织中细胞凋亡情况。结果 三组裸鼠皮下异种移植瘤成瘤率均为100%。HINT1组移植瘤生长速度慢,接种后18 d移植瘤生长速度显著低于neo组及A375细胞组（P < 0.01）。HINT1组、neo组及A375细胞组肿瘤重量分别为（0.04 ± 0.00） g、（0.23 ± 0.00） g、（0.29 ± 0.03） g;肿瘤体积分别为（0.06 ± 0.04） cm3、（0.34 ± 0.15） cm3、（0.43 ± 0.19） cm3。HINT1组肿瘤重量及体积均显著低于neo组及A375细胞组（P值均 < 0.01）。组织病理结果显示,与neo组及A375细胞组相比,HINT1组肿瘤团块较小,细胞异形小,病理性核分裂象少见,瘤团内未见大片坏死灶。HINT1组中平均凋亡细胞百分比为12.87% ± 1.18%,显著高于neo组（3.22% ± 0.49%）及A375细胞组（3.00% ± 0.53%）（P值均 < 0.01）。结论 高表达HINT1可显著抑制A375细胞裸鼠皮下异种移植瘤模型肿瘤的生长,促进其凋亡,提示HINT1基因可能是人黑素瘤的抑癌基因之一。     

CD147 siRNA转染对银屑病患者外周血T淋巴细胞CD147的表达及细胞增殖、活化的影响

目的 探讨转染CD147 siRNA对寻常性银屑病患者外周血T淋巴细胞中CD147的表达及细胞增殖、活化的影响。方法 将化学合成的CD147 siRNA通过电转染至寻常性银屑病患者外周血T淋巴细胞中，采用半定量RT-PCR方法检测细胞在转染96 h内CD147 mRNA的表达变化。采用噻唑蓝法检测转染CD147 siRNA对T淋巴细胞增殖的影响。采用流式细胞仪检测转染CD147 siRNA对T淋巴细胞活化标记分子CD25表达的影响。结果 与未转染组比较，转染CD147 siRNA 24 h后，T淋巴细胞的CD147 mRNA表达水平显著下降（P ＜ 0.05），至转染后48 h降低最为明显（P ＜ 0.01），而转染后96 h恢复至接近转染前水平（P ＞ 0.05）；转染CD147 siRNA 24 h、48 h、72 h后，T淋巴细胞的增殖水平显著下降，抑制率分别为（44.5 ± 3.13）％、（50.7 ± 3.5）％、（53.98 ± 4.15）％（P值均 ＜ 0.01），CD25的表达也明显降低（P值均 ＜ 0.01）。结论 CD147分子与银屑病外周血T淋巴细胞的增殖、活化能力相关，可能是一种新的银屑病治疗靶分子。