采用比较基因组杂交方法分析原发性食管癌染色体异常

背景与目的:有研究表明原发性食管癌常有染色体的改变,包括染色体基因组异常扩增和缺失.比较基因组杂交技术可以显示这些染色体的异常变化.本实验采用比较基因组杂交技术研究和分析原发性食管癌染色体基因组的变化特点及其与预后的关系.方法:采用比较基因组杂交技术检测16例食管癌组织中染色体的异常改变,并分析染色体异常与预后的关系.研究的病例中7例食管癌术后2年内死亡(对照组),9例术后生存3年以上(生存组).结果:食管癌患者中多数染色体基因组发生改变,最常见的染色体基因组高扩增频率发生在1q/p,2q/p,3q,5q/p,8q/p,9q/p,11q/p,17和20q/p染色体区段上,在染色体1q/p,4p,9p,18q和xp中常见染色体基因缺失.染色体7q/p和19扩增频率和染色体4q/p和18q缺失频率,生存组与对照组间存在显著性差异.结论:食管癌患者染色体区段基因易发生异常扩增和缺失,生存组与对照组存在明显差异.     

人食管癌细胞系中缺失的新基因片段在食管癌发生中的可能意义

目的寻找食管癌的抑癌基因,揭示食管癌的遗传易感性和癌变原理。方法采用Ｓｏｕ－ｔｈｅｒｎ杂交和ＰＣＲ方法,检测食管癌细胞系中缺失的三个ＤＮＡ片段（１２Ｈ２、３３Ｂ２和３３Ｂ３）,在２０例食管癌组织和相应的癌旁组织及三个高危家族成员外周血中的缺失情况。结果在癌和癌旁组织标本中,１２Ｈ２的缺失频率最高,癌组织为６１．１％,癌旁组织为２２．２％,淋巴结转移阳性率为４５．４％;３３Ｂ２分别为３０．０％、１０．０％和５０．０％;３３Ｂ３分别为２０．０％、１０．０％和２５．０％。１２Ｈ２和３３Ｂ３在三个高危家族中未发现种系改变和先证者的体细胞纯合缺失。３３Ｂ２在一个家系的先证者中存在体细胞纯合缺失,但未发现种系改变。结论１２Ｈ２、３３Ｂ２和３３Ｂ３可能为新的食管癌候选抑癌基因,且与食管癌的进展和转移相关。     

辐射所致残存染色体易位与放射敏感性关系研究

目的：应用荧光原位杂交（FISH）方法研究人肿瘤细胞放射敏感性与染色体残存易位关系及临床应用的可行性。方法：采用3种放射敏感性不同的人肿瘤细胞系：鼻咽鳞癌（CNE）、肺腺癌（SPC）和乳腺腺癌（MCF-7）。通过克隆形成方法测定2Gy,4Gy,6Gy和8GyX线照射剂量下肿瘤细胞的存活率。采用常规染色体片过程和2号染色体涂染探针及FISH方法。测定2Gy,4Gy和6GyX线照射24h后，肿瘤细胞2号染色体内在和诱导的畸变量。结果：未照射的对照细胞2号染色体存在不同程度的内在畸变，2Gy,4Gy和6Gy照射后24h,CNE、SPC和MCF-7细胞诱导生成的残存染色体畸变与剂量关系一致，能够反映细胞的放射敏感性，所有细胞系诱导2号染色体生成的畸变与细胞存活率均存在良好相关性（rs=0.96)。结论：诱导的残存染色体畸变与照射剂量呈线性关系，采用FISH方法计数照射诱导的残存染色体畸变，可以预测肿瘤细胞间的放射敏感性差异并具有重要的临床意义。     

高转移人肺癌细胞系遗传稳定性研究

染色体畸变分析为肿瘤细胞遗传学研究的常规方法。近年来，有研究表明癌细胞长期培养并不会引起额外特征性染色体改变。ＰＧ癌系为我室建立的具有高转移性入肺癌细胞系，在体外已传统代数年。最近，我们从ＰＧ母系中分离出多个亚克，工并具有相同的生物学特性。     

EMP-1基因对人食管癌细胞系生长的影响

背景与目的：本室曾用正常食管粘膜上皮细胞和食管癌细胞进行微阵列分析,得到一批在正常食管粘膜上皮细胞和食管癌细胞中差异表达的基因,其中包括上皮膜蛋白－1（EMP－1）基因,EMP－1基因的mRNA水平表达差异有6倍。本文进一步研究EMP－1基因在食管癌发生发展中的作用;方法：构建人EMP－1基因的真核表达载体,并转染人食管癌细胞系,Western blot检测转染效果,RT－PCR检测转染后EMP－1的表达情况,绘制生长曲线,流式细胞检测细胞周期的变化;结果：EMP－1基因成功转入人食管癌细胞系EC9706,EMP－1基因表达量变高,细胞生长变慢,S期减少;结论：EMP－1基因与食管癌发生有一定关系。     

人食管癌相关基因4在食管癌细胞系EC9706中表达缺失的机制

目的 探讨人食管癌相关基因4(ECRG4)在食管癌中表达缺失的机制.方法 采用聚 合酶链反应-单链构象多态(PCR-SSCP)和DNA测序的方法检测80对配对食管鳞状细胞癌(ESCC)肿瘤组织和癌旁正常上皮中ECRG4的外显子突变;采用DNA亚硫酸氧盐修饰和序列特异性聚合酶链反应(ssPCR)检测EC9706细胞系ECRG4基因启动子CpG岛甲基化状态;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测去甲基化药物5-氮杂-2-脱氧胞苷或三氧化二砷(As2O3)处理后ECRG4 mRNA的重新表达.结果 80对ESCC配对标本中,ECRG4的4个外显子编码区均未发现突变.EC9706细胞系ECRG4基因核心启动子区16个CpG岛中,有11个呈高甲基化状态,ECRG4 mRNA不表达.EC9706细胞处理前ECRG4 mRNA不表达,去甲基化药物处理后,ECRG4 mRNA均重新表达.结论 甲基化表观遗传学机制是导致ECRG4基因在食管癌细胞系EC9706中表达缺失的一个机制.

Abstract：

Objective To investigate the mechanism of loss of human esophageal cancer-related gene 4 (ECRG4) expression in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC.) Methods PCR-SSCP and DNA sequencing analysis were used to detect the mutation of ECRG4 exons in esophageal cancer and matched adjacent normal tissues of 80 patients. DNA bisulfite-modifying ssPCR sequencing assay was used to examine the methylation status of ECRG4 promoter in human esophageal squamous cell carcinoma EC9706 cells. The re-expression of ECRG4 mRNA was examined by RT-PCR in EC9706 cells, after treatment with either demethylation drug 5-aza-2'-deoxycytidine or arsenic trioxide. Results No mutation in the four ECRG4 exons was found in all the ESCC and matched normal adjacent tissues. RT-PCR showed that 11 of 16 CpG islands of ECRG4 promoter were hypermethylated, while ECRG4 mRNA expression level was undetectable in the EC9706 cells. The ECRG4 mRNA was re-expressed after treatment with either demethylation drug 5-aza-2'-deoxycytidine or arsenic trioxide. Conclusion The epigenetic mechanism of methylation is a reason of loss of ECRG4 gene expression in the ESCC cell line EC9706.     

食管癌患者及其一级亲属染色体脆性部位研究

分析了３６例食管癌患者，３１例患者子女及３０例正常人的外周血淋巴细胞染色体畸变率（ＣＡＲ）和脆性部位（ＦＳ）的变化。发现（１）食管癌患者及患者子女的ＣＡＲ、ＦＳ都显著增高，说明染色体不稳定和个体患癌易感性增加密切相关，是食管癌发生的遗传物质基础。（２）食管癌患者及其患者子女ＦＳ与癌基因、癌断点一致符合率明显高于对照组（Ｐ〈０．０１）提示：ＦＳ与癌基因、癌断点有一定相关性。这有助于揭示癌变的发生机理     

永生化人食管鳞状上皮细胞系的建立及其染色体不稳定性的研究

[目的]建立永生化人食管鳞状上皮细胞系，并研究细胞永生化过程中以及食管肿瘤细胞染色体的不稳定性。[方法]用人乳头状瘤病毒16型E6／E7（HPV16E6／E7）转染正常人食管鳞状上皮细胞，连续传代培养，检测HPV16E6／E7基因的整合情况及其表达，并对不同代次永生化细胞及食管肿瘤细胞进行端粒荧光原位杂交（FISH）检测和分裂后期细胞形态分析。[结果]HPV16E6／E7基因转染至人食管鳞状上皮细胞后，增殖旺盛，已传至第75代。在细胞危机期（第13和第17代），TTAGGG端粒缺失数为6．0±1．2和4．7±1．5（缺失率分别为6．7％和5.3％）．细胞间桥的出现率为28．0％～30．9％。细胞永生化以后（第47代），端粒缺失数减至2．6±0．7（缺失率3％），细胞间桥出现率降至3．6％，与危机期的比较差异有统计学意义，而与肿瘤细胞的分裂异常相一致。在细胞永生化过程中，细胞间桥的出现率与端粒的缺失率呈正相关性。[结论]HPV16E6／E7基因可以导致人食管鳞状上皮细胞永生化，在此过程中存在较多端粒缺失和细胞间桥，表明染色体的不稳定性在细胞永生化和恶性转变过程中起到重要作用。     

膀胱癌患者染色体畸变及SCE的研究

作者对19例膀胱癌患者和16例正常人外周血淋巴细胞染色体畸变和SCE进行了研究。结果表明膀胱癌患者染色体总畸变率、断裂及裂隙、脆性位点的表达、四倍体、着丝粒后期相以及SCE率都明显高于正常人。对以脆性位点表达率和SCE率为指标检测群体中,尤其是高危群体中肿瘤易患性个体的可能性进行了讨论。     

膀胱移行细胞癌的分子细胞遗传学研究

目的　分析膀胱移行细胞癌的染色体畸变。方法　采用 7,9,11,17号染色体着丝粒探针对 34例膀胱移行细胞癌患者尿液、30例膀胱冲洗液的脱落细胞核进行荧光原位杂交 (fluorescenceinsituhybridization ,FISH )研究 ,并同时做了细胞学检查。结果　 (1)膀胱癌患者尿液脱落细胞核中 7,9,11,17号染色体数目畸变阳性率分别为 2 3.5 %、38.2 %、14.7%和 11.8% ;冲洗液中各号染色体畸变阳性率分别为 30 .0 %、5 0 .0 %、2 6 .7%和 16 .7%。其中 9号染色体畸变率较高 ,但与膀胱癌分级、分期无明显关系 ;7号染色体数目畸变与膀胱癌的分期密切相关 ;11,17号染色体数目畸变与膀胱癌分级、分期无显著相关性。 (2 )膀胱癌患者尿液组中尿细胞学、FISH阳性率分别为 2 9.4%和 5 5 .9% ,两种方法联合后阳性率达 6 7.6 % ;膀胱冲洗液组中阳性率则分别为 2 7.6 %和 73.7% ,两种方法联合后阳性率达 80 .0 %。结论　膀胱癌的发生发展与染色体的畸变有关。FISH检测膀胱癌患者尿液、冲洗液脱落细胞间期核染色体数目畸变 ,有可能作为膀胱癌诊断、预后判断的一项辅助方法。     

新基因1A6定位及在肿瘤中的双色荧光原位杂交分析

目的 了解定位新基因1A6在不同组织来源肿瘤中的状态。方法 用单色FISH法将载于质粒的1A6基因小片段cDNA定位于C组某一染色体长臂,根据该基因测序结果设计8对引物,通过PCR在PAC文库中筛选目的的基因的基因组DNA。用切口翻译法分别用红绿荧光直接标记12号α－卫星重复序列和1A6基因组DNA,采用双色荧光共杂交的方法定位1A6基因,并对其及12号染色体进行了数量分析。结果 1A6基因定位于12q23.2-23.3。1A6基因在乳腺癌、卵巢癌及胃癌细胞株中双色FISH的绿红信号比（R值）为0．96－1．01,在胃癌组织印片中R值为0．93－1．11。12号染色体在乳腺癌细胞株BMI中的双体率87．7％,三体率7．4％;在卵巢癌细胞株SKOV3中的多体率100％,其中五倍体67．6％;在胃癌细胞株BGC823中的多体率为83．1％,其中三体率为71％。在实体瘤胃癌组织印片中,86．4％（19／22）的病例12号染色体以双拷贝为主。结论 1A6基因在实体瘤胃癌组织及肿瘤细胞株（BGC823、SKOV3、BMI）中均无明显扩增和缺失,推测其在肿瘤中的作用方式不是扩增或缺失。12号染色体数目在不同组织来源肿瘤细胞株中各异,意义有待探讨。     

人乳头状瘤病毒16在食管癌不同人群中的检出率

背景与目的中国河南省安阳地区是食管癌高发区,有研究发现人乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)的感染是安阳地区食管癌的重要发病因素。本文研究HPV16型在中国北方不同地区食管癌患者中的感染率及其表达水平,以进一步明确HPV16与食管癌发病的相关性。方法用地高辛标记的HPV16E6探针做原位杂交(insituhybridization,ISH),检测河南省安阳食管癌高发区的食管癌患者(43例)、北京肿瘤医院散发食管癌患者(43例)和内蒙古自治区蒙古族食管癌患者(33例)的食管癌组织中HPV16的感染情况。结果ISH检查结果显示安阳、北京、内蒙古3个地区食管癌患者HPV16感染率分别为81.4%(35/43)、69.8%(30/43)和63.6%(21/33);安阳食管癌患者HPV16感染水平明显高于北京(H=3.91,P<0.05)和内蒙古(H=4.22,P<0.05)的食管癌患者。安阳食管癌患者中HPV16表达呈阳性、强阳性的比例明显高于北京和内蒙古食管癌患者(H=3.95,P<0.05)。结论HPV16在不同地区的食管癌患者中均有较高感染率。安阳食管癌高发区的患者感染HPV16的程度较严重。     

食管癌组织中MTS1/p16基因的缺失

目的 研究ＭＴＳ１／ｐ１６基因在人食管组织及相应癌旁组织中的变化。方法 采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和和方法检测了６０例人食管组织标本（包括３０例食管癌和３０例相应癌旁上皮组织）中Ｐ１６基因的缺失情况。结果 在３０例癌旁上皮组织中未检测到Ｐ１６基因缺失,而在３０例食管癌组织中,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测有７例标本Ｐ１６基因杂交阴怀,ＰＣＲ扩增证实其中有５例标本Ｐ１６基因缺失;Ｐ１６基因在食管癌组织中的缺失频     

应用原位杂交和细胞遗传学方法检测淋巴瘤患者的染色体畸变

目的 检测淋巴瘤患者的染色体畸变。方法 运用细胞遗传学方法检测１５淋巴瘤初发病人的外周血淋巴细胞。运用原位杂交技术检测２１例淋巴瘤患者的病变淋巴结７号三体（＋７）和１２号三体（＋１２）的发生率,其中１２例与外周血染色体标本为同一患者。结果外周血染色体分析表明：自然状态下和丝裂霉素Ｃ诱导下,淋巴瘤组的染色体为断裂率和细胞畸变率均比正常对照组高。原位杂交检测发现２１例中５例有＋（７（２３．８％）、３     

辐射诱导鼻咽癌细胞系凋亡及其相关基因的研究

目的Ｘ线诱导人鼻咽癌细胞系ＣＮＥ和ＣＮＥ－２凋亡及其相关基因的研究。方法应用ＤＮＡ荧光染料Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、免疫组化、ＲＴ－ＰＣＲ、ＤＮＡ杂交等方法进行观察和检验。结果一定剂量照射后,ＣＮＥ凋亡指数与时间、剂量有相关性,ＣＮＥ和ＣＮＥ－２两种细胞系存在明显不同的凋亡反应。免疫组化方法检测,ＣＮＥ的ｂｃｌ－２蛋白呈强阳性,而ＣＮＥ－２为阴性;进一步采用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测,发现ＣＮＥ－２存在ｐ５３ｍＲＮＡ扩增产物,而ＣＮＥ却不存在。ＣＮＥ和ＣＮＥ－２的ｐ５３及ｂｃｌ－２基因的ＤＮＡ杂交结果均为阳性,但ＣＮＥ细胞ｐ５３基因的２．８ｋｂ片段较５．６ｋｂ片段明显减弱,说明在ＣＮＥ中存在ｐ５３基因的部分缺失。结论人鼻咽癌细胞系的凋亡指数有时间、剂量相关性;ＣＮＥ、ＣＮＥ－２两种细胞系的凋亡指数有明显差异,可能与ＣＮＥ中抗凋亡基因ｂｃｌ－２的过度表达及ｐ５３基因部分缺失密切相关。     

大肠癌新相关基因HSU17714的染色体定位研究

目的确定大肠癌新相关基因ＨＳＵ１７７１４的染色体定位。方法采用强化荧光原位杂交技术（ＦＩＳＨ）,以生物素化酪胺强化荧光原位杂交信号。结果８０．０％（１２８／１６０）的间期细胞和５９．８％（１０４／１７４）的中期分裂相可见到明显集中的ＨＳＵ１７７１４基因的杂交信号,相应荧光Ｒ带分析中,８５．１％（４０／４７）在２２号染色体上１区３带处有杂交信号。结论ＨＳＵ１７７１４基因定位于２２ｑ１３。     

原发性食管小细胞癌临床分析

目的探讨原发性食管小细胞癌的临床特点、治疗及预后.方法回顾性分析20例原发性食管小细胞癌患者的临床资料.结果局限期患者单纯手术、单纯化疗、单纯放射治疗、手术 化疗、化疗 放射治疗的中位生存时间分别为14,14,6,18,16个月;广泛期患者单纯化疗(2例)、化疗 放射治疗(2例)中位生存时间分别为6和8个月.全组的中位生存期为12个月,生存最长者已达72个月.而未治疗的广泛期患者仅存活2个月.结论对于原发性食管小细胞癌,应采用以化疗为主的综合治疗.     

人子宫颈鳞状细胞癌细胞系HCC-0214的建立及其生物学特性

目的 建立人子宫颈鳞状细胞癌细胞系HCC-0214,为子宫颈癌研究提供实验模型。方法 无菌切除人子宫颈癌的手术标本,用组织块贴壁法体外培养,连续传代稳定生长后,绘制细胞生长曲线。采用光镜、电镜观察细胞形态,并进行细胞周期和染色体核形分析。用免疫组化法测定细胞系肿瘤标记物的(ER、PR、Keratine、PCNA)表达情况。结果 组织块贴壁法体外培养获得人子宫颈鳞状细胞癌细胞系HCC-0214(简称H),细胞维持培养16个月,传代131代,生长稳定,群体倍增时间为35．48h,细胞呈上皮镶嵌状贴壁生长,趋向复层生长,无接触抑制。超微结构显示,具有典型的桥粒结构和较多的张力原纤维。染色体数目35—156条,主流范围58—80条(64．8％),结构为人类染色体。细胞的肿瘤标记物(ER、PR、Keratine、PCNA)检测呈高表达,DNA指数为1．931。裸鼠移植瘤组织病理形态学与患者原始肿瘤一致,无血清培养成功。结论 通过组织块贴壁法体外培养建立的人子宫颈鳞状细胞癌细胞系HCC—0214,与原发癌保持相同的生物学特性,体外连续传代16个月以上,细胞形态不变,生长周期恒定,可望作为一个稳定的细胞系。     

p16基因抑制食管癌细胞生长的研究

目的 探讨ｐ１６基因对食管癌细胞生长的抑制作用,为食管癌致癌机理的研究和基因治疗提供理论基础。方法 我们采用基因转染技术,将全长野生型ｐ１６ ｃＤＮＡ转染到经亚硝胺诱发的人胎儿食管癌细胞系中,该细胞内源性ｐ１６基因已发生纯合性缺失。结果 转染ｐ１６基因的食管癌细胞生长受到抑制,其在软琼脂上克隆形成能力降低了大约４倍。对细胞周期分析表明,处在Ｇ０￣Ｇ１期的细胞由３３．７％增加到６８．６％。经Ｄｏｔ