直接转导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对大肠肿瘤的杀伤作用

目的 通过单纯疱疹病毒胸苷酶（ＨＳＶ－ｔｋ）基因对荷大肠癌裸鼠肿瘤的直接转导及杀伤作用研究,建立有效的自杀基因抑制大肠肿瘤的治疗方法。方法 脂质体法将含ＨＳＶ－ｔｋ基因的逆转录病毒载体ＬＮｔｋ及空载体Ｇ１Ｎａ、ＰＡ３１７包装细胞中进行交叉包装、收获病上清。４０只ＢＡＬＢ／Ｃ裸鼠分成４组并皮下注射ＬｏＶｏ细胞成瘤,将含ｔｋ和Ｇ１Ｎａ的病毒上清分别直接注射到２组大肠肿瘤部位并予以腹腔注射３００ｍｇ／ｓ     

单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷系统对膀胱癌体内杀伤作用的研究

目的：探讨逆转录病毒介导的单纯疤疹病毒胸苷激酶／丙氧鸟苷(HSV-TK／GCV)系统对膀胱癌的体内杀伤作用。方法：用逆转录病毒载体感染鼠源性膀胱癌细胞株T739，体外观察其对GCV的敏感性。在鼠源性T739膀胱癌动物模型中，以逆转录病毒单次或重复感染方法介导TK基因转移，观察GCV治疗前后肿瘤体积大小及动物存活时间变化。结果：TK基因导入T739后获得了GCV敏感性，体内肿瘤生长受到抑制，动物存活时间延长，但单次和重复感染组之间无差别。结论：逆转录病毒成功介导膀胱癌体内基因转移，HSV-TK／GCV系统在体内对膀胱癌有杀伤作用，其可望对膀胱癌作为基因治疗。     

逆转录病毒载体介导的CD基因对小鼠胃癌的原位杀伤作用

目的　探讨自杀基因的旁观者效应及引发的抗肿瘤免疫对胃癌的治疗作用。方法　将含有ＣＤ基因的重组逆转录病毒载体ｐＣＤ２ 在ＰＡ３１７ 细胞中进行包装后,收获病毒上清;将此上清直接注射接种于６１５ 小鼠皮下并已成瘤的ＭＦＣ小鼠前胃癌的肿瘤部位,再腹腔给予前药５ＦＣ 进行治疗。治疗结束后,检测ＮＫ、ＬＡＫ细胞活性以判断机体免疫活性。结果　在前药治疗阶段中,转ＣＤ基因肿瘤较未转基因肿瘤的生长明显受抑,且有部分肿瘤消失（ Ｐ＜０ ．０１ ,ｎ＝１０） 。在成瘤对照组中,ＮＫ、ＬＡＫ 活性受到抑制,低于正常对照组,而ＣＤ／５ＦＣ组的ＮＫ、ＬＡＫ活性明显增高。肿瘤消失小鼠在远离原肿瘤部位再接种ＭＦＣ细胞,９０ 天后均未见肿瘤生长且长期存活。结论　在胃癌肿瘤部位直接转导ＣＤ 基因不仅可以对肿瘤产生强效的杀伤作用,由此引发的抗肿瘤免疫反应对阻止肿瘤复发有重要意义。     

经腺病毒介导释放单纯疱疹病毒胸苷激酶基因以杀伤胰腺癌细胞

应用经腺病毒介导释放的单纯疱疾病毒胸苷激酶（HSV－TK）基因作为胰腺癌基因洽疗的工具。选用人体胰腺癌细胞系B×PC－3、ASPC－1、HPAF和Panc－1，注入Balb／C裸鼠腹腔内制成胰腺癌模型。HSV－TK表达能致敏细胞至核着同类物ganciclovir（GCV），后者是抗病毒剂。选择性致敬可由病毒胸苷激酶基因使GCV一磷酸化作用而成。细胞激酶进一步将药物磷酸化形成三磷酸盐，结合至初生DNA，从而抑制DNA合成和最终导致细胞死亡。为了分析基因转移的效率，重组编码有已知基因的腺病毒媒介物。按Feng法感染重组腺病毒媒介物100菌斑形成单…     

联合应用胸苷激酶基因和胞嘧啶脱氨酶基因对MCF-7细胞的杀伤作用

目的研究双自杀基因(胞嘧啶脱氨酶基因CD和胸苷激酶基因HSV-tk)的应用对乳腺癌细胞的杀伤作用和旁观者效应。方法脂质体法将CD和HSV-tk双自杀基因转染入PA317细胞，用其病毒上清转染乳腺癌细胞MCF-7，G418筛选出阳性细胞MCF-7／CD tk，然后加入不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-Fc)或／和丙氧鸟苷(GCV)，MTT法观察其杀伤作用；将不同比例的MCF-7／CD tk和MCF-7细胞混合，联合应用5-Fc和GCV杀伤，观察其旁观者效应。结果单独应用5-Fc或GCV均能对MCF一7／CD tk细胞产生明显的杀伤效应，联合应用可以在较小的剂量下产生更大的杀伤作用；当阳性细胞比例达到20％时即可对半数混合细胞产生杀伤作用。结论双自杀基因的应用对乳腺癌细胞具有明显的杀伤作用．其旁观者效应明显。     

脂质体介导的单纯疱疹胸苷激酶基因在人前列腺癌细胞中的表达

目的：提取并鉴定已构建的EB病毒表达载体pDR2-TK，利用脂质体介导的基因转染技术将pDR2-TK转染人前列腺癌细胞并对单纯疱疹胸苷激酶（HSV－TK）表达状况进行检测。方法：采用DNA大量制备及纯化系统提取pDR2-TK，酶切和DNA测序进行鉴定，采用阳离子脂质体法将pDR2-TK导入激素非依赖性人前列腺癌细胞系PC－3m，逆转录PCR（RT－PCR）法和SABC免疫组化法检测TK mRNA和蛋白的表达。结果：扩增提取的质粒经PstⅠ和EcoR Ⅴ酶切后各获得4个及2个片段，与原基因酶切图谱一致；所提取质粒PCR产物经DNA测序，与NCBI公布的HSV－TK基因序列对照，证实所提取质粒含目的基因序,旨质体法转染PC－3m细胞后，mRNA和蛋白均有HSV－TK的表达，其蛋白表达率约为22％。结论：pDR2-TK质粒含有目的的基因HSV－TK，阳离子脂质体法可将pDR2-TK导入人前列腺癌细胞并获得较高效率的表达。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因和更昔洛韦对膀胱癌细胞的旁观杀伤效应

目的：探讨单纯疮疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因和更昔洛韦（GCV）对膀胱癌细胞的旁观者效应和机制。方法：将转染HSV-tk基因的膀胱癌细胞HTB9与HTB9细胞混合培养，在GCV作用下，观测细胞的存活率。HTB9-tk细胞条件培养基，经不同孔径的滤膜过滤，将滤液及0.22μm滤膜上的物质重新加入HTB9细胞，观察细胞存活率。结果：当HTB9-tk细胞50％时，共培养细胞对GCV的敏感性近100％，表明每个表达HSV-tk基因的细胞至少杀死1个不含HSV-tk基因的膀胱癌细胞。HTB9-tk细胞的条件培养液过滤后直径大于0.22μm的某种物质对HTB9细胞具有细胞毒性作用。结论：HSV-tk/GCV对膀胱癌细胞具有明显旁观者效应的毒性作用，直径大于0.22μm的某种物质对HTB9细胞具有细胞毒性作用，其旁观杀伤效应机理可能是HTB9对HTB9-tk细胞凋亡囊泡的吞噬。     

联合应用胸苷激酶基因和胞嘧啶脱氨酶基因对胆囊癌细胞的杀伤作用

目的研究双自杀基因的应用对胆囊癌细胞的杀伤作用和旁观者效应。方法脂质体法将CD和HSV-tk双自杀基因转染人PA317细胞，用其病毒上清转染胆囊癌细胞GBC-SD，G418筛选出阳性细胞(GBC-SD/CD tk，应用不同浓度的5-FC或(和)GCV，MTT法观察其杀伤作用；将不同比例的GBC-SD/CD tk和GBC-SD细胞混合，联合应用5FC和GCV杀伤，观察其旁观者效应。结果单独应用5FC或GCV均能对转染阳性的GBC-SD／CD tk细胞产生明显的杀伤效应，联合应用可以在较小的剂量下产生更大的杀伤作用；当阳性细胞比例达到20％时即可对半数细胞产生杀伤作用。结论双自杀基因的应用对胆囊癌细胞具有明显的杀伤作用，其旁观者效应明显。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因导入T细胞克隆治疗溃疡性结肠炎大鼠

目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因导人T细胞克隆治疗溃疡性结肠炎（UC）大鼠的作用。方法将HSV-TK基因导人T细胞克隆回输至27只UC大鼠，观察刺激指数（SI）、CD4^＋、CD8^＋及白细胞介素（IL）-13和IL-4水平的变化，并比较治疗前后结肠病变的情况。结果UC大鼠结肠壁病变于tk^＋细胞克隆回输治疗2-3d出现炎性反应吸收改变，7-10d后结肠炎性反应基本消失；回输前SI值为7．39±1．24，回输后为2．67±0．87（P〈0．05），CD4^＋、CD8^＋水平、IL-13和IL-4水平明显下降，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论T细胞克隆疫苗诱导和tk基因导入后杀伤效应的双重作用导致结肠自身抗原特异性免疫耐受的最终形成，HSV-TK自杀基因导入T细胞克隆回输方案是UC基因治疗研究和靶点设计的有效手段。     

腺病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对雄激素非依赖性前列腺癌细胞的杀伤作用

目的 观察腺病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因对雄激素非依赖前列腺癌细胞的杀伤作用,探讨雄激素非依赖性前列腺癌( AIPC)基因治疗的可行性.方法 制备携带HSV-TK的重组腺病毒载体(AdTK),AIPC细胞PC-3细胞加入AdLacZ,滴度(MOI)分别为50、100、150、200、250.48 h后计算各滴度AdLacZ转染PC-3细胞的细胞感染率(％).转染后使用更昔洛韦(GCV)处理,浓度为10 mg/L,噻唑蓝(MTT)比色法观察AdTK/GCV对PC-3细胞的体外杀伤效应.结合电镜技术、流式细胞仪检测探讨AdTK/GCV对PC-3细胞的杀伤机制.结果 对体外培养的PC-3细胞杀伤实验表明,随着AdTK MOI增加及GCV剂量增加,细胞存活率逐渐降低.AdTKMOI为150和250时,GCV的半数致死最(IC50)分别为7.75 mg/L和5.00 mg/L.电镜和流式细胞仪检测证实细胞死亡有细胞凋亡机制参与.AdTK/GCV处理后非转染PC-3细胞出现死亡,存在旁观者效应,效应强弱与AdTK转染、未转染细胞混合比例相关.结论 AdTK/GCV能有效杀伤雄激素非依赖前列腺癌PC-3细胞.     

单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦系统联合化疗药物治疗前列腺癌

目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶／更昔洛韦（HSV-TK／GCv）系统联合几种临床常用的化疗药物对激素非依赖性人前列腺癌（HRPC）细胞PC-3m的杀伤效应。方法将HSV-TK基因导入PC-3m细胞，采用活细胞拒染法、四甲基偶氮唑盐酶反应比色法（MTT法）检测单独给予GCV（10μmol／L）和顺铂（CDDP，10μmol／L）、足叶乙甙（VP-16，10μmol／L）、长春新碱（VCR，135nmol／L）、氨甲喋呤（MTX，5nmol／L）、5-氟尿嘧啶（5-Fu，1μmol／L）及苏拉明（100μmol／L）等物质，以及GCV联合上述药物对PC-3m细胞的体外杀伤效应，并用流式细胞术（FCM）检测GCV联合5-Fu或苏拉明后细胞坏死和凋亡状况。结果HSV-TK／GCV联合VP-16、VCR、5-Fu和苏拉明后杀伤PC-3m细胞的效应增强，联合CDDP后杀伤效应降低，联合MTX后则杀伤效应无明显改变。FCM检测显示，GCV联合5-Fu和苏拉明后72h出现较大比例的细胞凋亡和细胞坏死。细胞凋亡比例分别为36．38％和35．51％，细胞坏死比例分别为33．05％和28．87％。结论HSV-TK／GCv系统联合某些化疗药物后可对前列腺癌（PCa）细胞发挥协同的杀伤效应。     

腺病毒介导的HSV-tk/GCV自杀基因系统体内外旁观者效应的观察

目的　观察腺病毒介导的HSV tk/GCV自杀基因系统的体外、体内接触及体内远端旁观者效应。　方法　采用向体外培养的tk阴性人肝癌BEL 74 0 2细胞中加入不同比例tk阳性同种细胞 ;向荷tk阴性BEL 74 0 2瘤小鼠瘤体内注射不同数量tk阳性同种细胞 ;向双侧荷瘤小鼠一侧瘤体内注射重组腺病毒 ,GCV作用后用不同方法来观察不同情况下的旁观者效应。　结果　体外组中观察到明显旁观者效应 ,当tk阳性细胞占 10 %时 ,混合细胞存活率为 36 6 % ;体内接触组中也观察到旁观者效应 ,实验组瘤体生长明显受到抑制 (P <0 0 5 ) ;体内远端组中 ,未观察到旁观者效应 (P >0 0 5 )。结论　腺病毒介导的HSV tk/GCV自杀基因系统在体外及体内接触时均存在旁观者效应     

胸苷激酶基因系统联合大蒜素诱导膀胱癌细胞凋亡的研究

目的　探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV TK) /更昔洛韦 (GCV)系统联合大蒜素对膀胱癌细胞的协同杀伤效应及对细胞凋亡的影响。方法　通过脂质体将胸苷激酶 (TK)基因转入膀胱癌BIU87细胞构建BIU87TK细胞,观察GCV(1mg/L)、大蒜素(5mg/L)及GCV+大蒜素(浓度同前)共同作用对BIU87TK细胞形态学、细胞凋亡率及细胞周期变化的影响,检测bcl 2、bax、半胱天冬蛋白酶(caspase 3)表达变化及caspase 3活性变化。结果　药物作用 72h,GCV+大蒜素对BIU87TK细胞的抑制率为 72 50%,高于GCV作用后的 35 00%和大蒜素作用后的 37 00%,二者可发挥协同抑瘤作用; (F=6 46,P<0 05)。GCV+大蒜素联合作用前期凋亡率高于单独作用细胞,细胞周期阻滞在S和G2 期,与单独作用比较阻滞时效提前;二者可抑制bcl 2表达并可促进caspase 3表达及活化。结论　HSV TK/GCV系统联合大蒜素可通过共同诱导凋亡发挥协同作用,抑制膀胱癌细胞生长。细胞周期阻滞,相关凋亡基因表达及活性的变化可能发挥了重要的作用。     

Pancreatic carcinoma cell killing via adenoviral mediated delivery of the herpes simplex virus thymidine kinase gene.

OBJECTIVE: Use of adenoviral mediated delivery of the herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) gene as a gene therapy strategy for carcinoma of the pancreas. SUMMARY BACKGROUND DATA: Expression of HSV-TK selectively sensitizes cells to the nucleoside analog ganciclovir (GCV). This strategy has been used to treat other compartmentalized tumor models. Therefore, the containment of pancreatic carcinoma makes it amenable to this gene therapy approach. METHODS: A recombinant adenoviral vector encoding the HSV-TK gene was used to induce GCV sensitivity and test the potential bystander effect in established pancreatic carcinoma cell lines and patient-derived tumor material. Additionally, Balb/C nude mice were injected intraperitoneally with human pancreatic carcinoma cells and treated with GCV (50 mg/kg per day) for 14 days. RESULTS: Expression of the HSV-TK gene elicited a significant bystander effect in the presence of GCV. Pancreatic tumor cells injected intraperitoneally into nude mice resulted in significant tumor formation. Treatment of animals with AdCMVHSV/HSV-TK and GCV induced a dramatic decrease in overall tumor burden for up to 8 weeks post-GCV treatment. CONCLUSIONS: Pancreatic carcinoma cells are highly susceptible to transduction with recombinant adenoviral vector and elicit a potent bystander effect on neighboring tumor cells. Additionally, in vivo treatment of tumor-bearing animals results in dramatic reduction of overall tumor burden, thus providing the rationale for molecular chemotherapy of pancreatic carcinoma.     

CD/5-FC系统对胰腺癌裸鼠移植瘤的抗血管形成作用的初步探讨

目的　探讨自杀基因系统对胰腺癌裸鼠移植瘤的微血管形成的抑制作用。方法　构建含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 (cytosinedeaminase ,CD)基因的腺病毒穿梭载体 pAdTrack CMV CD ,与骨架载体pAdEasy 1在细菌内重组为 pAd CD ,经 2 93细胞包装、扩增 ,氯化铯密度梯度离心制备纯化高效的CD腺病毒液 ,建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型 ,观察CD基因的原位治疗及微血管形成抑制情况。结果　含CD基因腺病毒载体经酶切鉴定正确 ,包装纯化后 ,检测病毒滴度为 2× 10 11pfu/ml,体内实验显示CD基因原位转导对裸鼠胰腺癌移植瘤的微血管形成具有较明显的抑制效应。结论　腺病毒介导CD/ 5 FC自杀基因系统 ,不仅可以直接杀灭癌细胞 ,而且还可通过抑制移植瘤微血管的形成来抑制胰腺癌细胞的生长 ,可作为胰腺癌基因治疗的有效方法。     

逆转录病毒载体介导的人IL－2基因在膀胱肿瘤细胞T_（24）中的表达

报道逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ在人源性膀胱肿瘤细胞Ｔ２４中的表述，ＩＬ－２ｃＤＮＡ插入到真核表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ中，构建成ＩＬ－２ｃＤＮＡ的表达载体ｐＤＯＲＩＬ－２，磷酸钙沉淀法将其导入Ｔ２４细胞中，经Ｇ４１８选择，转染阳性率约为２０％；原位杂交技术检测ＩＬ－２ｃＤＮＡ可转录ＩＬ－２ｍＲＮＡ，细胞培养上清中ＩＬ－２活性２４小时每１０５细胞为８～３４Ｕ／ｍ１。表明ＩＬ－２基因在Ｔ２４细胞中已表达，为研制膀胱肿瘤转基因瘤苗及开展膀胱肿瘤基因治疗打下了基础。     

腺病毒介导的胸苷激酶基因治疗肝癌的研究进展

肝癌是我国常见的恶性肿瘤,针对肝癌的传统治疗方法疗效欠佳、患者预后较差.近10余年来,随着分子生物学技术的发展,肝癌的基因治疗成为该领域新的研究方向和热点,其中以腺病毒为载体的单纯疱疹病毒胸苷激酶自杀基因系统（ADV-tk）对肝癌的治疗研究开展得最早也最为广泛.其原理是把单纯疱疹病毒胸苷激酶基因通过腺病毒导入细胞内,利用其产生的酶将无毒的药物前体更昔洛韦（GCV）转变成细胞毒性产物,从而杀死肝癌细胞.多项动物实验和临床研究结果表明：ADV-tk/GCV系统是治疗肝癌的有效方法.本文总结近年来ADV-tk/GCV系统在肝癌治疗中取得的研究进展,分别从载体的发展过程、基因的作用机制、导入方式、增强杀伤效力、降低肝毒性以及相关动物模型的改进等几个方面进行综述.     

单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷自杀基因系统对胆囊癌细胞的体外作用

目的 探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)自杀基因系统对体外胆囊癌细胞的杀伤效果。方法 将含有tk自杀基因的重组逆转录病毒载体PLtkSN经脂质体介导转染胆囊癌细胞,并测定不同浓度的GCV对转基因细胞GBC-SD/tk的生长抑制率;将GBC-SD/tk与未转基因细胞GBC-SD按不同的比例混合,噻唑蓝(MTT)法测定GCV对不同混合比例细胞的杀伤率,观察旁观者效应。结果 GCV对体外GBC-SD/tk细胞有明显的杀伤作用。与对照组比较差异有非常显著性(P<0.01),并呈现剂量依赖性的特点。当GCV浓度为1、10、50、100、500mg/L时,杀伤率依次为6.8％、25.2％、54.5％、66.3％、89.3％;在混合细胞中,当GBC-SD/tk细胞所占比例分别是0、10％、20％、50％、70％、100％时,GCV对混合细胞的杀伤率依次为0、19.7％、40.3％、77.7％、88.0％、93.5％,提示存在旁观者效应。结论 HSV-tk/GCV自杀基因系统有望成为治疗胆囊癌的有效手段之一。