小鼠腔前卵泡体外发育研究

目的通过小鼠腔前卵泡(preantral     

获得小鼠初级卵泡进行体外培养的酶解方法比较

目的：对酶解小鼠卵巢,获取初级卵泡的方法进行探讨。方法：卵巢取自性成熟前的昆明系小白鼠,酶液由不同浓度的胶原蛋白酶、脱氧核糖核酸酶和链蛋白酶组成,培养液为Waymouth medium MB752/I,并添加牛血清白蛋白、胰岛素和转铁蛋白。实验共分6组,每组所用酶液组成和处理时间各不相同。结果：由3mg/ml的胶原蛋白酶、100IU／ml的脱氧核糖核酸酶,另加或不加0．02mg/ml的链蛋白酶组成,处理时间为20分钟的两个处理组,卵泡分离效果较好。结论：胶原蛋白酶浓度是影响卵巢中卵泡分离的主要因素,它和消化时间对卵泡分离及分离后卵泡形态、存活能力有影响。     

IGF-Ⅱ对小鼠2-细胞胚胎体外发育的影响

目的研究胰岛素生长因子-Ⅱ对小鼠2-细胞胚胎体外发育的影响。方法在mKSOM培养液中添加不同浓度的IGF—Ⅱ（insulin—like growth factor—Ⅱ）对小鼠2-细胞胚胎进行体外培养,观察囊胚发育率、孵化率和囊胚细胞数的变化。结果（1）培养到72h,实验组囊胚率显著高于对照组。（2）培养到96h,0．1、1、10ng／ml IGF-Ⅱ添加组的孵化率显著高于对照组和100ng／ml IGF—Ⅱ添加组。（3）进行囊胚细胞计数,实验组与对照组比较,差异无显著性;四个实验组之间比较,差异亦无显著性。结论IGF-Ⅱ浓度为0．1、1、10ng／ml时,能促进小鼠2-细胞胚胎的体外发育。     

EGCG对昆明小鼠早胚体外发育的影响

目的观察表没食子儿茶素没食子酸酯(-)(EGCG)对昆明(kunming,KM)小鼠早胚体外发育的影响,为改善小鼠早胚体外培养体系奠定实验基础。方法以空白M16培养液为对照组,M16中添加浓度为0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、20μg/mL EGCG为实验组,收集KM小鼠1-细胞胚进行体外连续培养,计数各组发育至2-、4-细胞胚、桑椹胚和囊胚等各个阶段的数目,并以2-细胞胚为基数,计算各组至不同阶段的发育率。结果添加EGCG实验组发育到桑椹胚和囊胚的比率明显高于对照组,其中以添加浓度为10μg/mL和20μg/mL的EGCG实验组的效果最显著,其桑椹胚发育率分别为77.3%和78.7%,而对照组只有43.2%(P0.01)。10μg/mL和20μg/mL的EGCG实验组的囊胚发育率分别为53.0%和47.3%,也明显高于对照组(19.2%,P0.01)。结论EGCG可以显著提高KM小鼠1-细胞胚体外发育到桑椹胚及囊胚的比率,以10μg/mL和20μg/mL浓度的EGCG效果最显著。     

两种激素对小鼠初级卵泡体外成熟培养的实验研究

目的：探讨卵泡刺激素（FSH）和人绝经期尿促性腺激素（hMG）对小鼠初级卵泡体外培养成熟的作用。方法：从小鼠卵巢组织人工分离所获的初级卵泡，在添加胎牛血清（FBS）以及FSH或hMG的Waymouth medium MB752/1培养液中比较培养。结果：小鼠初级卵泡在添加100 μg/L hMG的培养液中有15.94%（n=69）发育成小囊腔卵泡，在添加300 μg/L hMG的培养液中有28.57%（n=56）发育成大囊腔卵泡；在添加FSH的各培养组中，无囊腔卵泡的形成。结论：培养液中添加适当浓度的hMG比FSH对卵泡的生长有利。     

Rho相关激酶抑制剂Y27632对小鼠腔前卵泡体外发育的作用

目的 探讨Rho相关激酶（ROCK）抑制剂Y27632在小鼠腔前卵泡体外发育中的作用。 方法 取出生12.5 d的小鼠卵巢,机械法收集单枚腔前卵泡,采用超低吸附96孔板模拟3D环境对其进行培养。设置对照组和含有Y27632的实验组,通过形态学观察、卵泡直径的变化、成熟卵泡的数量、成熟卵母细胞纺锤体的变化等来评估卵泡的整体发育情况。采用Real-time PCR技术检测颗粒细胞中卵泡刺激素受体（FSHR）、卵母细胞中骨形态发生蛋白15（BMP15）、生长分化因子9（GDF9）等以及凋亡相关基因（Bad、Bax和Caspase-3）的表达情况,同时,用细胞存活染料检测卵泡发育过程中颗粒细胞的凋亡情况。 结果 ROCK抑制剂Y27632对卵泡直径增长和基本发育指标（存活数、成腔率和成熟率）无明显影响（P>0.05）,但对照组卵母细胞成熟后纺锤体组装出现异常。培养8 d后,与对照组相比,实验组颗粒细胞特异性基因FSHR上调;卵母细胞特异性基因BMP15和GDF9上调,而叉头框O3（FoxO3)下调;凋亡基因Bax、Bad和Caspase3表达下调,实验组卵泡内的颗粒细胞凋亡明显少于对照组。 结论 小鼠卵泡体外发育过程中,ROCK抑制剂Y27632能够抑制颗粒细胞的凋亡,防止卵母细胞纺锤体组装异常,进而提高卵泡体外发育质量。     

人腔前卵泡体外培养研究

目的探讨FSH对人腔前卵泡(preantralfollicle)体外生长的影响.方法培养液中加入不同浓度的FSH,观察卵泡存活天数和卵泡发育增大.结果卵泡体外存活天数对照组为2.80±1.69天,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组(FSH浓度为0.5IU/ml、1IU/ml、2IU/ml)分别为5.36±0.63、5.47±2.50、8.13±4.19天,与对照组相比,分别为P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001.卵泡增大比率对照组为20.00%,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别为35.71%、60.00%、81.25%,与对照组相比分别为P＞0.05、P＜0.05、P＜0.01.结论FSH能使卵泡体外存活天数延长,卵泡发育增大,并大致呈正相关关系.     

阴道超声对卵泡发育的监测

近年来 ,随着不孕症人数的增多以及人工授精和试管婴儿研究的深入开展 ,临床医生迫切需要了解卵泡的发育 ,以便及时掌握排卵时间。目前超声用于不孕症的诊治 ,对卵泡的生长发育观察直接、准确、方便 ,尤其是阴道超声 ,能显示卵泡内部的微细结构 ,观察更加细致。本站于 1998年应用阴道超声 ,对不孕症妇女卵泡发育进行监测 ,现总结如下。资料与方法1 研究对象 :选取不孕症妇女 45人 ,其中原发不孕者10人 ,继发不孕者 35人 ,平均 2 9岁左右。2 方法 :(1)仪器选择 :应用日立ＥＵＢ 40 5超声仪 ,阴道探头颅率 6 .5ｍＨＺ。 (2 )扫查方法 :膀胱截…     

内毒素对去卵透明带2-细胞小鼠胚胎体外发育的影响

目的 观察不同剂量浓度内毒素对去卵透明带2—细胞小鼠胚胎体外发育的影响。方法 获取小鼠2—细胞胚胎，用胰蛋白酶法去除卵透明带后，分别置于含有0，1pg/ml，5pg/ml和10pg/ml内毒素的CZB液滴中培养，此外，用蛋白酶法去除卵透明带，在不含内毒素的CZB液滴中培养，观察胚胎体外发育情况。结果 用胰蛋白酶法去卵透明带的2—细胞小鼠胚胎，其囊胚率随着培养液中内毒素剂量的增加而降低，且5pg/ml和10pg/ml时与对照组(不含内毒素)相比差异显著(P＜0．001)。在有内毒素存在时，停滞在2—细胞或4细胞期的胚胎彼此分离排成列，不再呈球形。部分卵裂球出现空泡或碎裂。另外，用蛋白酶法去除透明带的2—细胞鼠胚的囊胚率为61．7％，显著低于胰蛋白酶法的73．8％(P＜0．001)。结论 微量内毒素即明显抑制去卵透明带2—细胞小鼠胚胎的体外发育，并表现出剂量效应；去卵透明带2—细胞小鼠胚胎试验可应用于培养液的微量内毒素检测；胰酶法去除卵透明带后胚胎的囊胚率优于蛋白酶法。     

同型半胱氨酸对小鼠卵母细胞成熟过程中组蛋白表观遗传修饰的影响

目的 探讨卵母细胞发育过程中同型半胱氨酸（HCY）对组蛋白表观遗传修饰的影响。 方法 首先使用10只2周ICR雌性小鼠建立完整卵泡的体外培养体系,在卵母细胞发育早期,利用免疫组织化学方法,观察HCY对甲基化组蛋白H3K4、H3K9以及乙酰化组蛋白H3K9分布的影响;其次使用10只4周ICR雌性小鼠,利用卵母细胞的体外成熟培养体系,观察HCY对卵母细胞成熟过程的影响,同时利用实时定量PCR方法,观察在此成熟过程中HCY对卵母细胞内组蛋白乙酰化水平的调控酶GCN5和HDAC表达的影响。 结果 HCY明显抑制卵母细胞的体外成熟,在HCY作用下,甲基化组蛋白H3K4、H3K9以及乙酰化组蛋白H3K9的分布没有变化,但是表达强度降低,核呈现去浓缩的趋势。成熟过程中HCY并不改变基因GCN5的表达水平,却明显抑制卵母细胞内HDAC基因的表达。 结论 卵母细胞发育过程中高水平的同型半胱氨酸影响组蛋白的表观遗传修饰,HCY对卵母细胞核内组蛋白甲基化和乙酰化修饰的影响有可能是造成核染色体稳定性下降的重要原因。     

小鼠卵母细胞体外成熟培养系统的建立与优化

目的 探讨激素刺激时间、体外培养时间对小鼠卵母细胞核成熟及不同激活方案对卵母细胞孤雌激活、胚胎发育能力的影响。方法 孕马血清促性腺激素（PMSG）超排处理,在体外培养的不同时间点检测卵母细胞核成熟率（每个处理至少重复3次,3只/重复,以下实验相同）。
分别采用乙醇结合6-二甲氨基嘌呤（6-DMAP）法和SrCl₂ 法激活卵母细胞,胚胎培养液选用CZB［胎牛血清（FBS）或牛血清清蛋白（BSA）］两种,确定最佳激活方案。对不同时间点成熟的卵母细胞进行激活,确定最佳激活卵龄。研究缩短PMSG刺激时间对卵母细胞发育的影响。结果 将
PMSG刺激时间从46h缩短至24h,卵母细胞获得最高核成熟率（97.6% vs 91.9%）的培养时间由14h延长至16h;缩短PMSG刺激时间,核成熟率不受影响,但能显著降低激活率（91.2% vs 37.1%）和囊胚率（20.9% vs 0.0%）。 两种方法体内成熟卵母细胞激活率均高于90%,但囊胚率差异
显著(P<0.05)。卵母细胞体外培养至24~26h时,激活率（89.5%）和囊胚率（21.9%）均达到最高点。结论 建立了一种小鼠卵母细胞体外成熟培养系统,即PMSG超排处理46h、卵母细胞培养24h,CZB（10mmol/L SrCl2）激活2.5h后采用CZB（0.5%BSA）进行胚胎培养。     

小鼠胚胎体外培养方法的改良

目的改进胚胎培养系统以进一步提高胚胎质量与发育潜能。方法采用内径0.21mm、外径0.28mm的塑料毛细管培养胚胎,将吸有胚胎的毛细管浸在盛有蒸馏水的烧杯内,再将烧杯放置在培养箱里的磁力搅拌器上,允许胚胎在微小的空间内发育并伴随着水的旋转而摆动,更好地模拟了胚胎在输卵管中的运动环境。结果分别对85枚、82枚2-细胞胚胎进行毛细管及微滴培养,其中毛细管培养胚胎的囊胚率以及胚胎细胞数(85.4%,57.0)显著高于微滴培养(36.5%,20.6),囊胚率差异显著(P0.05)。且接种在Matrigel基底膜上形成的内细胞团集落显著增大。结论小鼠胚胎体外培养方法的改良——毛细管培养,促进小鼠植入前胚胎的体外发育。     

骨桥蛋白对小鼠体外受精及早期胚胎发育的影响

目的 探讨骨桥蛋白（OPN）对小鼠体外受精及早期胚胎发育的影响。方法 120只昆明雌鼠和30只雄鼠,采用体外受精、胚胎培养方法,将小鼠精子、卵子、原核期胚胎和2-细胞期胚胎分别用不同浓度的OPN抗体预处理,观察小鼠受精、卵裂以及早期胚胎发育情况。结果 不同浓度的OPN抗体分别预处理精子和卵子后,与对照组比较,受精率显著降低(P＜0.01)。OPN抗体预处理原核期胚胎后,0.01mg/L OPN抗体组的卵裂率较对照组低,但差异无显著性 (P =0.052),1.00mg/L OPN抗体组的卵裂率低于0.01mg/L 组（P ＜0.01）及0.10mg/L组（P ＜0.05）。不同浓度的OPN抗体预处理2-细胞胚胎后可抑制胚胎发育。1.00mg/L OPN抗体组的4-细胞率和8-细胞率与0.10mg/L OPN抗体组相比差异无显著性(P ＞0.05),但前者的囊胚形成率显著低于后者（P ＜0.01）。1.00mg/L OPN抗体组的4-细胞率、8-细胞率以及囊胚形成率均显著低于0.01mg/L OPN抗体组（P ＜0.01）。结论 OPN可促进小鼠的受精和早期胚胎发育。     

超短精卵共孵育时间对小鼠体外受精的影响

目的 探讨不同精卵共孵育时间对小鼠体外受精受精率、氧化应激产生及胚胎质量的影响,及小鼠体外受精最短的精卵共孵育时间。 方法 分别比较ICR小鼠精卵共孵育30s、2min、10min、05h、2h、4h及18h的体外受精的受精率及囊胚形成率,并对精卵共孵育0h、2h及18h培养液的丙二醛浓度进行检测。结果 各组获得卵细胞数分别为52、53、53、46、48、48及47,受精率分别为67.3%、81.1%、83.0%、87.0%、85.4%、81.3%及48.9%。精卵共孵育30s组的受精率显著低于0.5h及2h组（P ＜0.05）,而18h组的受精率显著低于2min、10min、0.5h、2h及4h组（P ＜0.05）。2min组的受精率相比10min、0.5h、2h及4h组均无差异（P ＞0.05）。各组的囊胚形成率分别为82.9%、65.1%、70.5%、67.5%、75.6%、71.8%及65.2%,两两比较差异均无显著性（ P ＞0.05）。精卵共孵育0h、2h及18h丙二醛浓度检测的均值分别为（1.06±0.21）×10^-3mol/L、（1.44±0.22）×10^-3mol/L及（2.00±0.21）×10^-3mol/L,各组间两两比较差异均有显著性（ P ＜0.05）,丙二醛浓度随着精卵共孵育时间的缩短而降低。结论 小鼠体外受精精卵共孵育时间缩短至2min不会降低受精率,同时随着孵育时间的缩短,产生的氧化应激也随之减少。     

In vitro survival of cells derived from isodiploid uniparental half embryos of the mouse after aggregation with normal embryos

Summary Fertilized mouse eggs, heterozygous for two allozymes of glucose phosphate isomerase (GPI) were bisected, and the resulting half eggs were diploidized with cytochalasin B. After separate aggregation with normal embryos carrying a third allozyme of GPI, the resulting chimaeras were kept in culture up to 10 days. The majority grew out on the culture dish during this period. By GPI analysis, 7.7% of the embryos were found to be chimaeric. Both types of uniparental cells, from gynogenetic and from androgenetic half eggs, were capable of surviving in chimaeras in vitro. These results are comparable with published data obtained by using uniparental embryos generated by micromanipulation.     

Transmission electron microscopy of mouse blastocysts activated and growth-arrested in vivo and in vitro

Summary Blastocysts from mice in a state of delayed implantation were examined by electron microscopy, either directly or after a culture period, to find out if activation and growth arrest in vitro were similar to the corresponding stages in vivo. It was found that activation in vitro, obtained by culturing the blastocysts in an outgrowth medium, was accompained by morphological signs similar to those during oestrogen activation in vivo, namely an increase in polyribosomes and glycogen granules. Analogously, growth arrest in vitro, obtained by culturing the blastocysts in a medium deprived of glucose, arginine and leucine, was accompanied by a morphology similar to that of blastocysts obtained during delay of implantation, namely scattered ribosomes of the monosome type, few membranes of endoplasmic reticulum and a lack of glycogen granules, all signs of a low metabolism. However, the morphological parallelism between the in vitro and the in vivo systems does not necessarily mean that the growth-controlling factors are the same in both cases.Activated blastocysts were transplanted to uteri of mice in delay of implantation to characterize the trophoblast ultrastructure four days after the transplantation. The experiments demonstrated that both in blastocysts activated for 24h in vivo and in those activated for 6 h in vitro the morphology reverted to that of inactive blastocysts, indicating that the functional inactivity is related to reversion into a morphologically inactive state rather than to uterine blocking of a morphologically active state.     

5-Hydroxytryptamine-induced locomotor rhythm in the neonatal mouse spinal cord in vitro

We examined the 5-hydroxytryptamine (5-HT)-induced locomotor rhythm in isolated spinal cord preparations taken from neonatal mice on postnatal day (P) 0–3. Motor activity was recorded from L2 and L5 ventral roots. Bath application of 5-HT (15–100 μM) evoked rhythmic bursts that alternated between the two sides, and the bursts in the L2 ventral root alternated with those in the ipsilateral L5 ventral root. After transection of the mid-lumbar cord, the locomotor rhythm in L2 persisted, while that in the L5 ventral root was abolished. This suggests that the upper lumbar region has a greater ability to generate a locomotor rhythm than the lower lumbar spinal cord. Kynurenate, a broad-spectrum glutamate receptor antagonist, blocked the 5-HT-induced locomotor rhythm indicating that ionotropic glutamate receptors are required for the rhythm to be generated.