人脐血间充质干细胞体外分离培养及基因载体特性研究

目的证实脐血中含有间充质干细胞,探讨其体外分离、培养条件,并进行生物学特性和表面抗原的鉴定,初步探索间充质干细胞作为基因治疗的载体携带目的基因的可能性及方法。方法无菌条件下取正常足月剖宫产的脐血分离、培养和纯化,获得间充质干细胞;对获得的间充质干细胞进行形态学观察;绘制生长曲线,分析间充质干细胞的增殖情况;用流式细胞仪检测间充质干细胞表面抗原的表达情况。采用脂质体转染法将pDNA316-IRES-EGFP质粒转入间充质干细胞中,观察绿色荧光的表达以及转染后细胞生长情况。结果自脐血中成功分离获得间充质干细胞,可传代培养,经表面标志检测,表达CD29、CD44、CD105,不表达CD45和HLA-DR。质粒pDNA316-IRES-EGFP通过脂质体介导转染间充质干细胞后,荧光显微镜下观察到报告基因EGFP的表达。转染后的细胞生长受到一定影响。结论人脐血来源的间充质干细胞能在体外分离、培养、扩增,并且具有和骨髓源间充质干细胞类似的生物形态和抗原表型。EGFP基因可被成功转入间充质干细胞中并获表达。转基因间充质干细胞用于基因治疗的持久性和有效性仍需进一步研究。     

临床应用型人脐血间充质干细胞分离培养与鉴定

目的探讨能够达到临床细胞治疗标准的人脐血间充质干细胞的体外培养与纯化方法。方法以15%FBS/DMEM作为培养基,采用淋巴细胞分离液间接分离法,分离MSCs,以贴壁培养法进行原代培养和纯化。倒置显微镜下观察生长状态和形态学变化,共聚焦显微镜下观察细胞表面抗原CD34,CD44免疫组化染色的鉴定。结果细胞计数显示人脐血间充质干细胞产品的细胞成活率大于95%,其纯度大于85%,符合卫生部第三类医疗技术的有关标准。结论脐带血内含MSCs,可在体外分离培养纯化增殖,获得大量相对纯化的MSCs,达到临床应用水平。     

脐血浆分离培养人脐带间充质干细胞

目的:利用脐带血血浆分离、培养人脐带间充质干细胞(HUCMSCs).方法:将脐血浆经盐析、透析等处理后,按10％体积成分分离、培养扩增HUCMSCs,观察细胞的形态,流式细胞仪检测细胞表面标志,MTT法检测细胞生长曲线、增殖能力,ELISA检测培养液中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、noggin的分泌浓度.结果:利用含10％脐带血血浆的培养液能分离、扩增HUCMSCs,分离纯化的HUCMSCs成梭形、增殖能力强、具有分化为成骨细胞、脂肪细胞及神经干细胞的能力,高表达CD29、CD44,低表达或不表达CD34、CD45及HLA-DR.而且在含10％脐带血血浆的培养液中生长的HUCMSCs还能分泌人胚胎干细胞(hESC)生长所需的的bFGF及noggin.结论:脐带血血浆经简单处理后能分离培养HUCMSCs,而且其分泌的细胞因子更适合hESC培养需要.     

人脐血间充质干细胞培养及其生物学特性的研究

目的建立人脐血间充质干细胞体外分离培养的最佳条件,并观察其生物学特性。方法在无菌条件下抽取人脐血,用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞,接种含10%胎牛血清的IMDM培养基中。对单个核细胞行贴壁培养后,进行细胞形态学观察,细胞生长、细胞周期分析及细胞凋亡检测,免疫细胞化学鉴定。结果采用Percoll(1.073g/ml)分离的脐血间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)大小较为均匀,呈梭形或星形的上皮样细胞,传代培养后的细胞体积较大,成纤维样细胞逐渐增多。细胞生长曲线测定表明接种后第5d细胞进入指数增生期,至第9d进入平台期;流式细胞术证明G2+S期细胞为14.8%;免疫细胞化学染色结果表明42.0%细胞为CD45阳性。结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定,可作为组织工程的种子细胞。     

胎儿骨髓间充质干细胞的分离培养及表面标志的检测

目的 建立胎儿骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC)的分离培养方法，并对其表面标志进行检测。方法 采用体外细胞培养技术，分离培养胎儿骨髓MSC，用流式细胞术对其进行鉴定，并研究其增殖及生长特征。结果 流式细胞术证明，MSC具有间质细胞的特征。原代及传代培养显示，胎儿骨髓MSC具有活跃增殖的能力。结论 胎儿骨髓MSC作为组织工程重建的种子细胞具有较强的可行性。     

影响脐血间充质干细胞分离培养的关键环节

背景：脐血中存在间充质干细胞,目前国内外尚未见到对脐血间充质干细胞体外分离、培养及扩增较统一且有效的方法。 目的：探讨影响人脐血间充质干细胞成功分离培养的相关因素。 方法：分别从不同胎龄(≥40周,37周和≤32周),脐血中单个核细胞数量(≥2.5× 10⁹ L^-1,< 2.5×10⁹ L^-1), 不同细胞接种浓度(1×10⁷,1×10⁹,1×10¹¹ L^-1),不同体积分数胎牛血清(5%,10%,15%,20%)以及培养瓶是否被胎牛血清包被等方面对人脐血间充质干细胞分离培养成功率进行比较。 结果与结论：脐血间充质干细胞的分离培养成功率为58.3%,且随胎龄的增高而培养成功率降低(P < 0.01);脐血中单个核细胞浓度≥2.5×10⁹ L^-1组培养成功率高于< 2.5×10⁹ L^-1组(P < 0.01);相同容量脐血中单个核细胞数量与胎龄呈负相关(r = -0.95,P < 0.01);1×10¹¹ L^-1组原代及传代培养的间充质干细胞生长及扩增情况高于1×10⁷,1×10⁹ L^-1;体积分数5%FBS组间充质干细胞贴壁速度较其他3组略慢,但细胞纯度较高,且细胞传代速度与其他3组无明显差别;胎牛血清包被组脐血间充质干细胞原代和传代后的纯度及扩增能力均高于未包被组。提示脐血间充质干细胞分离培养成功率受多种因素的影响：通过选择较低胎龄的胎儿,采集足够量的脐血,以较高的细胞密度接种,培养基中添加较低浓度的胎牛血清,并将培养瓶预先用胎牛血清进行包被,能在体外建立稳定的脐血间充质干细胞培养体系。     

脐血间充质干细胞的分离培养及生物学特性

背景：脐血富含干细胞,刺激后进入细胞周期的速度以及自泌生长因子的能力均强于骨髓及外周血干细胞。 目的：建立一种分离纯化、培养扩增脐血间充质干细胞的方法,并观察体外培养脐血间充质干细胞的生物学特性。 方法：密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化脐血间充质干细胞。观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,应用流式细胞仪测定细胞周期,以免疫组织化学法(SP法)测定CD29,CD44,CD34。采用体积分数20%马血清诱导脐血间充质干细胞分化为脂肪细胞,以油红O染色鉴定;0.1 μmol/L地塞米松,10 mmol/L β-甘油磷酸钠和50 μmol/L抗坏血酸诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞,以碱性磷酸酶染色鉴定。 结果与结论：分离获得了高纯度贴壁生长的间充质干细胞,间充质干细胞呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养9代,未发生形态学改变,无衰老征象。第3代间充质干细胞体外可以分化为脂肪细胞和成骨细胞。提示采用淋巴细胞分离液密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,可以获得纯度较高的脐血间充质干细胞,脐血间充质干细胞体外增殖和传代能力强。     

人脐血间充质干细胞的培养条件比较

目的摸索人脐血间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）的培养条件。方法根据不同采血量、首次换液时间、胎龄、不同培养基对样本分组，比较不同培养条件对脐血中的间充质干细胞原代生长的影响，以流式细胞仪对培养出的间充质干细胞进行细胞表面标志检测。结果在相同条件下，取10ml的脐血能较大程度培养出间充质干细胞；观察首次换液时间在培养后96h较为合适，延长换液时间有利于数量不占优势的单核细胞充分贴壁：早产胎儿的脐血培养出的间充质干细胞成功率较高；胎牛血清的质和量决定了培养成功与否。培养出的间充质干细胞不表达造血细胞系的标志（CD34、CD45、CD14）及内皮细胞的标志（CD106），强表达CD29、CD44、CD13。结论样本量、首次换液时间、胎龄、培养基的质和量对MSCs的成活、生长有关键作用。     

胎儿脐血间充质干细胞治疗大鼠急性心肌梗死

背景：胎儿脐血间充质干细胞对病变心肌有修复和再生能力,胎儿脐血间充质干细胞移植是治疗心肌梗死的一种新途径。 目的：探讨胎儿脐血间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死的效果。 方法：选取32只大鼠结扎左冠状动脉前降支制作心肌梗死动物模型,随机等分为移植组和梗死组,从胎儿脐血中分离培养脐血间充质干细胞,制备脐血间充质干细胞悬液,对移植组大鼠进行脐血间充质干细胞移植。 结果与结论：胎儿脐血间充质干细胞在体外可以被成功分离培养;与梗死组相比,移植组大鼠心肌梗死边缘区的微血管密度、左室收缩末压、左室内压最大上升和下降速率显著增加(P < 0.05),左室舒张末压显著下降(P < 0.05),心电图情况稍有好转。表明胎儿脐血间充质干细胞治疗心肌梗死大鼠可以促进心肌血管再生,改善心脏功能。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及形态学观察

目的建立一种简单实用的小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养方法,通过了解其细胞生物学特性,为MSCs的应用提供实验依据。方法采用差速贴壁法体外分离、扩增MSCs,倒置显微镜观察原代及传代细胞的形态及生长过程。结果在小鼠骨髓间充质干细胞的培养过程中,血液系细胞在换液过程被去除,成纤维细胞污染经差速贴壁法也可去除。获得的骨髓间充质细胞形态较均一,生长状态良好。结论采用差速贴壁培养法可获得一定纯度的MSCs,此法简单、实用,并且获得的细胞生长状态良好,增殖能力强.     

人脐带间充质干细胞的快速分离、纯化及冻存

目的:建立在一般实验条件下快速分离、纯化及冻存人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)的简便有效方法并研究其冻存复苏后的增殖及多向分化能力。方法:用胶原酶Ⅱ、胰蛋白酶次序消化及二步离心法从人的完整脐带中快速分离UC-MSCs,通过把握传代时的消化程度及酸化培养基来快速纯化UC-MSCs,以流式细胞仪检测表面抗原进行鉴定;用简易二步法(-4℃停留30 min,-20℃存放2 h,-80℃长期保存)冻存UC-MSCs,半年后复苏,扩增、传代,检测其胚胎干细胞特异性抗原Oct4、SSEA-4和人端粒酶逆转录酶hTERT的表达情况,并诱导其向神经元样细胞、成肌细胞和肝细胞样细胞分化。结果:通过双酶次序消化结合二步离心法,2 h可提取全脐带中的MSCs,原代培养7 d即可传代,通过适度消化传代和选用弱酸性培养基培养,第3代即可得到纯化的UC-MSCs,UC-MSCs表达CD29和CD44,不表达CD34和CD45,极低表达HLA-DR、CD80、CD86和CD106。简易法冻存半年后复苏的UC-MSCs表达Oct4、SSEA-4和hTERT,可向三个胚层来源的细胞分化。结论:双酶次序消化结合二步离心法是从人的完整脐带中快速分离UC-MSCs的一种简便有效方法,偏酸性环境有利于UC-MSCs的扩增及纯化;简易二步法冻存对UC-MSCs增殖和多向分化能力没有明显影响。     

人脐血源性MSCs的免疫调节作用

目的 从人脐血中分离、培养间充质干细胞(MSCs)并探讨其对淋巴细胞的免疫调节作用.方法 淋巴细胞分离液分离人脐血单个核细胞,利用贴壁筛选法通过多次传代得到MSCs,流式细胞仪测定细胞表型;将获得的MSCs分别以不同数量加入到外周血混合淋巴细胞培养体系和植物血凝素(PHA)刺激的外周血淋巴细胞转化体系中,用H3-TdR标记β液体闪烁计数仪检测细胞增殖,观察脐血来源的MSCs对混合淋巴细胞反应和淋巴细胞转化的影响.结果 从人脐血中分离获得的贴壁细胞,呈成纤维样的细胞形态,CD29、CD105和CD166表达阳性,CD14、CD34和CD45表达阴性;人脐血源性MSCs在体外对混合淋巴细胞反应和PHA诱导的淋巴细胞转化均具有明显的抑制作用,抑制作用与细胞数量呈正相关.结论 从人脐血中可以成功地分离出MSCs,其对同种异体淋巴细胞具有免疫调节作用,为其作为骨组织工程异基因种子细胞来源打下基础.     

Immunomodulatory function of whole human umbilical cord derived mesenchymal stem cells

Bone marrow derived mesenchymal stem cells (MSCs) play a critical role in immune modulation. However, immunomodulatory function of whole human umbilical cord derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) remains unclear. In this study, UC-MSCs were separated from whole umbilical cord using a single enzyme digestion. UC-MSCs (CD73⁺, CD90⁺, CD105⁺, and CD34⁻, CD45⁻, HLA-DR⁻) were differentiated into adipocytes, osteocytes and chondrocytes in vitro under specific stimulatory environments. UC-MSCs suppressed umbilical cord blood lymphocyte proliferation stimulated by mitogen, and ELISA showed that the secretion of INF-γ was downregulated, and the secretion of IL-4 was upregulated, with CD8⁺ T cells markedly decreased and CD4⁺ T cells changed lightly. Moreover, the infusion of UC-MSCs in recipient mice transplanted with donor bone marrow cells ameliorated acute graft-versus host disease (aGVHD) and extended survival. In conclusion, UC-MSCs might negatively modulate immunoreactions, and have application potential in the treatment of aGVHD caused by allogeneic stem cells transplantation.     

人脐带间充质干细胞定向诱导分化成类神经元的实验研究

目的:采用不同细胞因子定向诱导人脐带间充质干细胞分化成类神经元,为脐带间充质干细胞移植治疗脊髓损伤提供理论依据。方法:采用Ⅱ型胶原酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,采用流式细胞术鉴定细胞。取第5代细胞随机分成A、B、C、D 4组,在A组基础培养基中加入b FGF,B组中加入b FGF和BDNF,C组中加入b FGF、BDNF和BHA诱导培养,D组为对照组,使用含有10%胎牛血清的DMEM-F12培养基培养。诱导2周后采用实时荧光定量PCR检测细胞的nestin、NEFH和GFAP mRNA表达情况,并通过原子力显微镜观察细胞超微结构的的变化。结果:Ⅱ型胶原酶消化法能成功分离人脐带间充质干细胞。通过流式细胞术检测第3代细胞发现,细胞均强表达CD29、CD44和CD105,而CD34、CD45和HLA-DR均未见表达。经定向诱导分化成类神经元后,原子力显微镜观察细胞表面突起增多,实时荧光定量PCR检测显示nestin在A、B、C组均呈阳性表达,NEFH在A、B组呈阳性表达,而GFAP在A、B、C、D 4组均不表达。A、B组n EFH和nestin表达具有显著差异(P﹤0.05)。结论:本实验成功分离培养人脐带间充质干细胞,所培养的细胞扩增迅速,生物学性状稳定;与b FGF单独处理相比,b FGF联合BDNF更能有效诱导人脐带间充质干细胞分化成类神经元。     

人脐血源性MSCs成骨诱导分化后对DCs的免疫抑制研究

目的探讨人脐血源性间充质干细胞(mesenchymal stem cells derived from umbilical cord blood,UCB-MSCs)经成骨诱导分化后,对树突状细胞(dendritic cells,DCs)的分化、成熟及免疫功能的影响。方法对UCB-MSCs通过细胞形态、表面标记及成骨诱导分化能力进行鉴定;在外周血单核细胞培养体系中加入GM-CSF+IL-4+TNF-α,刺激DCs诱导分化及成熟;收集与成骨诱导分化前后UCB-MSCs共培养的DCs,流式细胞仪检测DCs免疫表型的表达情况;将成熟DCs作为刺激因素,外周血淋巴细胞作为反应细胞,3H-TdR标记β液体闪烁计数仪检测与成骨诱导分化前后UCB-MSCs共培养后,DCs刺激淋巴细胞增殖能力的变化。结果人UCB-MSCs成骨诱导分化后能抑制DCs表面CD40、CD80、CD83、CD86和MHC-II的表达,上调CD14的表达;DCs具有明显刺激淋巴细胞增殖的功能,而UCB-MSCs成骨诱导分化后能显著抑制DCs刺激的淋巴细胞增殖。结论成骨诱导分化的UCB-MSCs在体外可抑制同种异体DCs的分化、成熟及免疫功能,为UCB-MSCs作为同种异体源性种子细胞在骨组织工程中的应用提供了依据。     

人脐带间充质干细胞传代后发生染色体核型变异

据文献报道人脐带间充质干细胞传代10次以上染色体核型分析都正常,我们在研究中发现,一例人脐带间充质干细胞传代到第8代,发生了染色体核型变异。现报道如下。     

脐带血间充质干细胞的研究进展

脐带血中存在着丰富的造血干细胞,在移植方面发挥重要作用,在脐血中是否还存在间充质干细胞却有争议,有的学者认为其中有间充质干细胞,且与骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)的形态、表面标志及分化潜能非常相似,有的学者认为含量较低,难以传代培养扩增,总结了近5年来国内外关于脐血间充质干细胞的研究情况,为脐血的充分利用提供更多的资料。     

骨髓腔内途径脐血与间质干细胞共移植对造血重建的实验研究

目的：探讨骨髓腔内输注（IBM）脐血与间质干细胞（MSCs）对大鼠造血重建、骨髓MSCs恢复的影响，并研究供体MSCs植入状态以探讨MSCs的作用机制。方法：BrdU标记F344大鼠骨髓MSCs通过双侧胫骨IBM或尾静脉注射（IV）与胎鼠及新生大鼠外周血（FNPB）共移植Wistar雌鼠。监测受鼠存活状况、造血免疫重建、HSCs植入水平及骨髓MSCs恢复情况，并以免疫荧光法检测受鼠骨髓MSCs的来源。结果：(1)2个共移植组60 d存活率均为100%，单纯FNPB移植组仅为66.7%。(2)共移植组的外周血象、骨髓造血干祖细胞集落产率明显高于单纯FNPB移植组，尤以骨髓腔共移植组最佳。(3)2个共移植组的HSCs植入水平无统计学差异，而骨髓腔共移植组明显高于单纯FNPB移植组（P＜0.05）。(4)30 d时各移植组MSCs的增殖能力未达正常水平，但仍以骨髓腔共移植组的恢复情况最佳（P＜0.05）。(5)仅少部分受体可发现供、受体源性MSCs嵌合。 结论：脐血与MSCs共移植可促进受体骨髓MSCs恢复和造血重建，提高HSCs植入率；IBM途径应用安全，促进造血恢复的作用优于IV途径。     

人胎盘血间质干细胞分离培养

目的：分离培养人胎盘血间质干细胞（hMSC），为hMSC探寻新来源。方法：采用羟乙基淀粉（HES）方法分离、富集胎盘血有核细胞；DMEM培养液体外培养、纯化、扩增hMSC；流式细胞仪检测细胞表面标记；地塞米松、IBMX、胰岛素和吲哚美辛定向诱导hMSC样细胞向脂肪细胞分化。结果：胎盘血来源有核细胞,在DMEM体外培养条件下，生长出具有塑料粘附特性的梭形细胞，阳性获得率29.17%（7/24），该细胞传代培养达6个月以上；流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD59、CD90、CD105、CD166表达阳性，CD14、CD34、CD45、CD80、CD86表达阴性；加入脂肪细胞诱导剂，细胞在形态上向脂肪细胞转化，胞内出现脂滴、脂泡，油红O阳性。结论：人胎盘血可以分离培养出hMSC，是hMSC的重要来源。