急性出血性结膜炎病原学分子特征分析

目的 检测分析引发浙江省急性出血性结膜炎(AHC)爆发流行的病原学及毒株的分子特征.方法 采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法直接从AHC患者眼拭子样本中检测肠道病毒(EV)和柯萨奇病毒A24变异株(CA24v)核酸;用Hep-2细胞分离病毒,对阳性分离物扩增病毒VP1基因和3C区片段,测定核苷酸序列,应用DNAMAN和MEGA软件进行同源性和进化分析.结果 3株浙江CA24v分离株VP1基因全长915个核苷酸(nt).3C区全长549 nt,均没有nt的插人和缺失;浙江分离株Zhejiang/13/08与CA24v原型株EH24/70在VP1和3C区核苷酸同源性分别为85.3%和86.5%,与2005年新加坡分离株Singapore/DSO-26/05和2007年广东分离株Guangdong/332/07株在VP1区和3C区的核苷酸同源性分别为97.0%～99.1%和96.7%～99.5%;浙江CA24v分离株在3C区进化树的Ⅲ基因亚型B分支上(GⅢ/B),在VP1进化树的CA24v Group2分支上.结论 引起2007-2008年浙江省急性出血性结膜炎爆发流行的病原为CA24v GⅢ亚型,该病毒最有可能来源于新加坡.     

中国大陆柯萨奇病毒A组16型全基因参照序列的初步建立和分析

目的 建立中国大陆柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)流行株的全基因参照序列.方法 从GenBank中获得CoxA16中国大陆分离株的所有全基因序列和氨基酸序列,用DNAstar/MegAlign软件对所得序列进行多序列比对和进化分析,按照参照序列标准拟定CoxA16的全基因参照序列和氨基酸序列,并与参考序列进行比对分析.结果 中国大陆分离的CoxA16毒株全基因序列共8株,分离于2005-2009年,其中2008年5株,广东省5株;通过序列比对获得了大陆CoxA 16全基因和氨基酸参照序列;参考毒株间核苷酸序列同源性介于79.0％～98.8％,氨基酸序列同源性为94.3％～99.9％,与参照序列的核苷酸同源性为79.7％～97.0％,氨基酸同源性介于95.1％～99.5％之间,同源性最低的为2008年安徽阜阳的FY18株.结论 比对分析了中国大陆CoxA16毒株全序列,成功建立了中国大陆CoxA16全基因和氨基酸参照序列.     

肠道病毒71型宁波分离株全基因组特征研究

目的:研究2010年肠道病毒71型宁波分离株的全基因组序列特征。方法:收集宁波市手足口病患者的粪便标本进行特异性荧光定量RT-PCR鉴定,EV71阳性标本进行病毒分离和全基因组序列的测定。结果:2010NB65株全长7406 bp,与参考株EV71相比编码区没有核苷酸的缺失和插入。2010NB65株与2008年-2010年中国大陆EV71流行株的各区段核苷酸和氨基酸同源性均较高,分别为94.1%～98.8%和97.6%～100%;与A型和CoxA16核苷酸同源性较低,分别为75.0%～82.4%和63.0%～85.4%。VP1和全基因组亲缘进化分析表明,2010NB65株属于C4基因亚型的C4a进化分支,与浙江株、阜阳株、北京株亲缘关系近。2010NB65株P2、P3区与CoxA16的进化途径相近。结论:宁波市HFMD患者粪便中分离得到EV71属于C4基因亚型的C4a进化分支,与我国其他地区的EV71存在共同进化趋势,全基因组序列提供了完整的分子生物学背景,为EV71病毒性疾病的防控提供参考价值。     

金山区柯萨奇病毒A组6型基因特征分析

目的分析上海市金山区2017—2018年分离的柯萨奇病毒A组6型(Cox A6) VP1基因特征和氨基酸位点突变,为手足口病防控提供依据。方法对金山区2017—2018年采集并分离到16株Cox A6分离株VP1全长基因进行扩增、测序、序列比对,构建系统发生树,分析核苷酸和氨基酸同源性以及氨基酸位点突变。结果金山区16株Cox A6分离株均属于E2亚型同一个进化分支,16株间VP1基因核苷酸同源性为92.3%～97.7%,氨基酸同源性为98.4%～100.0%。与金山区16株分离株同源性最高的是2018年山东分离株MK357081/CHN/SD/JN/2018,核苷酸和氨基酸同源性分别为95.7%～99.3%和98.7%～99.7%。13株Cox A6分离株VP1氨基酸序列存在氨基酸位点变异,涉及8个氨基酸变异位点,但在抗原表位重要位点201D、243H、245R、247Y、248M和249R均未检测到抗原漂移。结论 16株Cox A6分离株核苷酸和氨基酸序列高度同源且位于E2亚型同一进化分支;Cox A6 E2亚型可能是金山区2017—2018年流行的主导基因型,金山区Cox A6 VP1存在氨基酸突变位点但未涉及关键的抗原表位。     

阜阳市手足口病柯萨奇病毒A10型VP4区基因特征分析

目的分析2011-2012年阜阳市手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）患儿咽拭子标本分离的柯萨奇病毒A10型（coxsackievirus A10,CoxA10）VP4区的基因特征,初步了解该病毒的变异情况。方法对49份HFMD患儿的咽拭子标本进行病毒分离,出现人肠道病毒（human enterovirus,HEV）特征性病毒致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）后提取病毒RNA,用VP4区分型引物进行半巢式反转录-PCR,再通过测序和GenBank Blast比对确定病毒型别,并对其VP4区进行序列进化分析。结果 49份咽拭子标本有16份出现了特征性CPE,病毒分离阳性率32.7%。其中三株经鉴定为CoxA10,阳性率18.8%。它们的VP4区核苷酸序列同源性为95%～99%,与GenBank中参考毒株VP4区核苷酸序列同源性为77%～97%。其中与中国株HQOO5431同源性为96%～97%,与中国株JN639887同源性为96%～97%,与中国株FJ598089同源性为95%～96%,与日本株AB282808同源性为8...     

福建省2013-2014年EV71病毒VP1遗传特征分析

目的 开展肠道病毒71型(EV71)基因变异监测,为EV71型传染病防治提供依据.方法 对福建省2013-2014年手足口监测标本进行病毒分离和鉴定.选取34株(每年各17株)各地市具有代表性EV71型分离株进行VP1基因测序,对所得序列进行比对,构建进化树,并分析氨基酸变异情况.结果 34株EV71型分离株均为C4a亚型,VP1区的核苷酸和氨基酸同源性分别为93.3％～99.8％和98.3％～100％,2013与2014年毒株VP1基因未见明显变异.分离株的氨基酸同源性比较,共有22株在6个位点的氨基酸发生突变.结论 福建地区2013-2014年流行的EV71毒株基因型仍为C4a亚型,但序列进化和氨基酸变异分析提示,福建省存在不同的EV71传播链,应持续给予关注.     

浙江省杭州地区手足口病病原谱分析和肠道病毒71型VP1基因分析

[目的]分析杭州地区手足口病的病原谱构成,并对肠道病毒(EV)71型的VP1基因进行核苷酸和氨基酸的序列的比对分析,了解杭州地区EV71的基因特征。[方法]采集98份手足口病确诊病例的粪便标本,用EV71和柯萨奇病毒A组(CoxA)16型特异性引物进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定,并选择6例EV71检测结果阳性的标本进行病毒分离并进行VP1基因的特异性扩增并进行测序,结合EV71各亚型的代表株构建系统进化树,并对VP1蛋白的氨基酸序列进行分析。[结果]通过RT-PCR特异性检测,发现EV71阳性结果22份,阳性率为22.4%;CoxA16阳性结果27份,阳性率为27.6%。测序结果表明6株EV71之间的VP1基因核苷酸同源性为92.2%～98.5%,氨基酸同源性为99.0%～100%。通过与各代表亚型进行核苷酸同源性比较后发现此次分离得到的EV71病毒都属于C4亚型。6株EV71与部分亚型代表株间在BCloop区域的氨基酸序列存在着差别,而SP70区域的氨基酸序列则完全一致。[结论]在手足口病患者中,由EV71感染引起的比例越来越大;此外,此次在杭州地区分离的EV71病毒都属于C基因型的C4亚型,尚没有证据说明此次在杭州地区分离的6株EV71毒株的毒力有增强。     

2010一2011年湖南省郴州市手足口病EV71型VP1区基因序列分析

目的了解2010-2011年湖南省郴州市手足口病EV71病毒的基因特征,为手足口病的预防控制提供科学依据。方法从2010-2011年郴州市各县（市、区）送检的手足口病肛拭子标本中随机挑选60份标本采用RD细胞进行病毒分离,采用Realtime—RT—PCR方法检测肠道病毒核酸,挑选14株致细胞病变阳性且EV71核酸检测阳性的标本（其中2010年的4株均为郴州市手足口流行夏季高峰期分离株,2011年的毒株主要为冬季高峰期分离株）,采用RT—PCR法扩增出EV71分离株的VP1区片段,随后进行VP1区核苷酸序列测定和分析,并使用生物信息学方法作基因特性分析。结果郴州市14株EV71毒株在生物进化树上与CAa亚型的代表株属同一分支。14株EV71毒株之间核苷酸序列的同源性在96．1％～100．0％之间,氨基酸序列的同源性在99．3％～100．0％之间;与A、B、C各基因型和亚型代表株EV71VP1编码区核苷酸和氨基酸序列同源性分析表明,郴州各分离株与安徽阜阳2008年毒株C4a亚型代表株（EU703812）的同源性最高,其中核苷酸同源性在91．8％-93．3％之间,氨基酸同源性均为99．3％。14株分离株与安徽阜阳2008年毒株（C4a亚型代表株）VP1区段的氨基酸编码序列进行比较,发现K98E、S283T和A293S3处位点变异,重症病例与普通病例的EV71病毒VPI氨基酸变异无明显差异。结论2010-2011年郴州市手足口病的优势毒株EV71属于C4a基因亚型。郴州市各县（市、区）的EV71亲缘关系近,毒株基因较稳定,未发现氨基酸突变位点与病例类型有关联。     

北京市2010年一起由CoxA24v引起的急性出血性结膜炎疫情的流行病学及病原学特征分析

目的 了解2010年北京市某职业学院急性出血性结膜炎(acute hemorrhagic conjunctivitis,AHC)病例的流行病学及病原学特征.方法 对AHC聚集性疫情开展流行病学调查,分析每例患者感染来源,采用描述性流行病学方法进行统计分析.荧光定量RT-PCR检测肠道病毒70型(enterovirus 70,EV70)和柯萨奇病毒A组24型变异株(coxsackvirus A24 variant,CoxA24v),并用Hep-2细胞进行病毒分离,对病毒分离株的VP1全长基因序列进行种系发生分析.结果 某职业学院AHC聚集性病例8天有15例患者发病,检测8例患者眼拭子样本,4例为CoxA24v阳性,共分离获得2株CoxA24v毒株.该2个毒株VP1全长基因序列组内核苷酸同源性为99.7％,与北京市2010年分离毒株亲缘关系最近,与印度2007年部分毒株亲缘关系次之.结论 本起疫情由一个CoxA24v病毒链引起,CoxA24v毒株VP1全长基因序列与2010年北京市株及2007年印度部分分离株有较高同源性.应加强AHC症状监测并密切关注引起该病的肠道病毒的变异,为防制AHC提供科学依据.     

新疆和田地区2016年甲型肝炎病毒流行株基因特征

目的了解新疆和田地区甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)流行株基因特征。方法收集新疆和田地区2016年甲型肝炎病例急性期血清标本,经核酸提取、逆转录、套式PCR、序列测定,进行HAV基因分型、主要中和抗原位点氨基酸序列分析,并与GenBank中HAV基因型和亚型代表株构建系统进化树,分析核苷酸和氨基酸序列差异或同源性。结果获得和田地区43株2016年IA基因亚型HAV流行株和2株减毒活疫苗株序列。43株流行株在VP1-2A区的核苷酸、氨基酸序列差异分别为0.0%-2.9%、0.0%-1.9%,在VP3-VP1-2A区分别为0.0%-2.2%、0.0%-0.7%;与2株减毒活疫苗株的氨基酸序列差异为0.5%-0.9%。HAV流行株的主要中和抗原位点未发现氨基酸变异,处于负向选择压力;与GenBank中中国新疆、中国四川或日本HAV序列的同源性最高。结论2016年和田地区HAV流行株为基因IA亚型且分为不同基因簇;HAV流行株和减毒活疫苗株的主要中和抗原位点氨基酸序列保守。     

Molecular epidemiology and genetic evolution of canine parvovirus in East China,during 2018‐2020

Canine parvovirus type 2 (CPV-2) emerged in the late 1970s, which caused high rates of morbidity and mortality in dogs. In last decade, five genetic variants (CPV-2a, CPV-2b, CPV-2c, New CPV-2a, and New CPV-2b) were frequently reported in the dog population, and replaced the original CPV-2, rising widespread concerns. However, little is known about their recent genetic diversity and evolution. The aim of this study was to analyze the characteristics of the CPV-2 strains collected in East China from 2018 to 2020. The 57 CPV-2 strains were isolated from rectal swab samples (n=140). They belong to three different genotypes, based on VP2 protein amino acid sequence. The results revealed a high prevalence of CPV-2c (77.19%) compared to the New CPV-2a (5.26%) and New CPV-2b (17.54%) strains. Further analysis showed that nucleotide homology of the VP2 gene among the 57 CPV strains was 98.9%~100%, and the homology with 24 reference strains from different countries and regions was 98.1%~100%. The phylogenetic tree of VP2 gene sequence showed that 44 CPV-2c strains were distantly related to CPV-2, CPV-2a, CPV-2b, New CPV-2a, New CPV-2b and European/American CPV-2c strains, and were closely related to Asian CPV-2c strains. The results showed that these Asian CPV-2c strains had become the dominant strain, which renewed the knowledge of CPV-2 molecular epidemiology in East China.     

2018年济南市14株柯萨奇病毒A组6型VP1基因特征分析

目的 分析济南市导致手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)的柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6, CVA6)分离株VP1基因特征及氨基酸变异。方法 2018年济南市HFMD常规监测病例样本经实时荧光RT-PCR检测,随机选择部分CVA6核酸阳性样本进行细胞分离鉴定,扩增阳性分离株VP1基因序列并进行同源性比较、氨基酸变异及系统进化分析。结果 2018年共检测652份样本,其中CVA6核酸阳性率为47.85%（312/652）,远高于人肠道病毒A组71型（human enterovirus A 71, EV71）（7.06%, 46/652）和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16, CVA16)（8.44%,55/652 ）,为济南市HFMD最主要病原体。通过细胞分离成功获得14株CVA6病毒,经VP1基因系统进化分析显示,济南市CVA6分离株均为基因D5亚型,VP1基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别为94.2%~100%和98.0%~100%,与2017年广东株（GenBank 登录号MG385796、MG385815）、广西株（GenBank 登录号MH018512）、云南株（GenBank 登录号LC413143）及2014年江西株（GenBank 登录号KY913482）等亲缘关系较近。VP1蛋白主要存在V174I等位点变异,与国内流行的D5亚型基本一致。结论 2018年CVA6病毒为导致济南HFMD的主要病原,与广东、广西、云南和江西等省分离株亲缘关系较近,属于我国目前流行的基因D5亚型。     

长沙市2010年手足口病EV71型VP1区基因序列分析

目的了解2010年长沙市手足口病（hand-foot-mouth disease,HFMD）重症和普通病例肠道病毒71型（human Enterovirus 71,EV71）VP1区基因特征。方法收集12例HFMD重症和普通病例的咽拭子或肛拭子标本进行VP1区基因RT-PCR扩增和核苷酸序列测定,测序结果利用sequin软件提交至GenBank,Lasergene和Mega5软件对测序结果进行氨基酸比对分析和构建进化树。结果 12株EV71 VP1区基因序列在进化树上与C基因型中的C4a亚型代表株属同一分支,在核苷酸同源性分析中,12株EV71与C4a亚型代表株（3254-TAI-98）的同源性达到92.6%-93.3%,高于与A、B、C1、C2、C3、CVA16型或亚型代表株的同源性（分别为79.9%-80.7%、83.1%-84.0%、87.9%-88.7%、89.1%-89.8%8、7.8%-88.2%和57.3%-58.4%）;12株EV71病毒VP1之间的核苷酸有高度的同源性：同源性为98.1%-100.0%,高于与C4亚型代表株的同源性（92.6%-93.3%和91.8%-92.7%）。2010年分离自长沙的重症和普通病例与2008年分离自北京、深圳和阜阳的EV71病毒VP1基因序列之间的氨基酸变异位点少。结论 2010年长沙市流行的EV71型病毒属于C基因型中的C4亚型;12例HFMD重症和普通病例的EV71 VP1区基因序列差异较小;不同时间、不同地区和不同病例来源的EV71 VP1区氨基酸变异位点无关联。     

广西16株狂犬病毒P基因序列分析

目的分析广西16株狂犬病毒P基因序列特点,探讨广西狂犬病高发的可能原因。方法 2005-2008年在广西14个市采集健康犬脑标本3 961份,用直接免疫荧光法（DFA）和RT-PCR法检测狂犬病毒,P基因PCR扩增阳性者进行序列测定和分析。结果 16株狂犬病毒完成P基因序列测定,核苷酸及氨基酸同源性分别为86%-100%和93%-100%,属于基因Ⅰ型狂犬病毒;广西境内至少存在3条狂犬病毒传播链;16株狂犬病毒P基因序列推导的氨基酸序列多个位点发生变异。结论广西存在多个Ⅰ型狂犬病毒株系的流行,可能是近几年广西狂犬病持续高发的原因之一。     

2008年和2010年肠道病毒7l型广州分离株全基因组序列分析

目的 研究2008年和2010年广州地区手足口病患者中肠道病毒71型(EV71)病毒全基因组序列的基因型与变异特点.方法 参照GenBank上EV71深圳株SHZH03(AY465356)基因组设计分段扩增引物,进行RT-PCR分段扩增EV71病毒基因组,PCR产物直接进行序列测定,用Clustal W/X、DNASTAR、MEGA4.1等软件分析基因组序列.结果 克隆9株广州株EV71,病毒全基因组全长序列均为7405 bp,提交到GenBank上的序列号为HQ456305、HQ456306、HQ456307、HQ456308、HQ456309、HQ456310、HQ456311、HQ456312、HQ456313.将9株广州株EV71与EV71的A、B3、B4、B5、C1、C2、C3、C4型及阜阳株全基因组核苷酸序列进行Clustal W比较,发现与C4a型阜阳株等同源性为98%～99%,与C4b同源性为91%～93%,与C1～C3同源性为82%～83%,与B3～B5同源性为81%～83%,与A型同源性为80%.将9株广州分离株EV71的VP1基因与EV71病毒A、B、C型进行Clustal W比较,同样是与C4a为98%～99%,与C4b同源性为92%～94%,与C1～C3的同源性为88%～89%,与B1～B5型同源性为83%～84%,与A型同源性为81%～82%.将9株广州株与EV71的A、B、C型VP1基因氨基酸序列进行Clustal W比对,发现VP1基因22位点的谷氨酰胺转变为组氨酸(Q→H),聚合蛋白中213位点(S→T)和1764位点(V→(Ⅰ)也发生了氨基酸的点突变,P的213位点属于VP2基因,1764位点属于3D基因.结论 2008年和2010年分离的9株广州株EV71属于C4a型,与阜阳株同源性为98%～99%,VP1基因22位点发生了点突变,聚合蛋白中213位点和1764位点也发生了氨基酸的点突变.

Abstract：

Objective To study the genomic genotypes and variation of human enterovirus 71(EV71)infected infants in Guangzhou city,in 2008 and 2010.Methods Primers were designed on the basis of the genomic sequence of EV71 SHZH03 strain(AY465356)in the GenBank,and EV71genome amplified by RT-PCR.PCR-products were directly sequenced and the genomic nucleotide sequences were analyzed with the programs of Clustal W/X,DNASTAR and MEGA 4.1.Results 9strains of EV71 genome appeared to be 7405 bp in length.The genomic sequences of EV71Guangzhou strains were compared with those of EV71 in GenBank,which revealed that the homology with EV71 genotype C4a Fuyang strains ranged between 98%-99%.Homology with genotype C4b were 92%-94%,with genotypes C1,C2,C3 as 82%-83%,with genotypes B3,B4,B5 as 81%-83%and the homology with genotype A was 80%.When compared the VP1 genes of EV71 Guangzhou strains with genotypes A,B,C virus,we revealed that the highest homology was also with genotype C4a.When compared the VP1 amino acid sequences of EV71 Guangzhou strains with genotype A,B,C virus by Clustal W program,the results revealed that the amino acid residue Q at position 22 in VP1gene was transformed to H,while 213(S→T)and 1764(V→(Ⅰ))mutations in polyprotein were discovered.Conclusion Data from the sequences and phylogenetics analysis on those Guangzhou strains in 2008 and 2010 revealed that those isolates belong to genotype C4a,with the homology with Fuyang strains as 98%-99%.Mutation of amino acid residue H at position 22 in VP1 gene was discovered and the neutralizing antibody of EV71 might have been conversed by this residue.213(S→T)and 1764(V→Ⅰ)mutations in polyprotein were also discovered.     

大连市肠道病毒71型VP1区段基因特征分析

目的:了解大连市手足口病病原体肠道病毒71型(EV71)分离株的基因特征。方法:从手足口患者粪便标本中分离EV71病毒,经RT-PCR扩增VP1全长,并进行核苷酸序列分析。结果:4株EV71分离株与C4亚型代表株具有较高的核苷酸和氨基酸序列同源性。在系统进化树上,4株EV71分离株与C4亚型代表株处于同一分支。结论:大连市手足口病患者中分离的EV71属C4亚型。     

江苏省2012-2014年柯萨奇病毒A组16型分子流行病学特征分析

目的 了解江苏省2012-2014年柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus A16,CA16）流行毒株基因型概况。方法 收集江苏省2012-2014年儿童手足口病标本并送样,进行病毒分离培养获取相应毒株,用CA16特异性引物通过反转录聚合酶链反应技术进行VP1区基因片段扩增和测序,利用生物信息学软件对序列进行分析,并与CA16参比株序列进行同源性比较并构建基因进化树。结果 分离得到82株CA16毒株,测序结果显示全部属于基因亚型B1,VP1基因分析显示其中9株毒株序列的基因亚型为B1a,另外73株毒株序列的基因亚型为B1b。CA16分离株VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为87.8%～100.0%和97.5%～100.0%;与CA16国际标准株G10核苷酸和氨基酸同源性分别为75.2%～78.2%和90.5%～91.9%。结论 江苏省2012-2014年分离获得CA16毒株属于基因亚型B1,以B1a和B1b两个分支共同进化和流行,其中又以B1b为优势亚型。     

父儿传播乙型肝炎病毒S区的基因分型

目的：从乙型肝炎病毒（HBV）S基因155－687段序列,研究携带者父亲与其子所携HBV的基因分型,方法：应用套式PCR扩增S基因片段,直接测序155－687段核苷酸并推衍出其编码的氨基酸序列,与文献中4株分属A,B,C,D基因序列比较。结果：父亲与其子所携带HBV序列与B型同源性最高,核苷酸水平分别达98．3％和97．9％,氨基酸水平分别达100％与99．4％,故父亲与其子所携HBV均属B型,父与子间此段序列的同源性极高,核苷酸与氨基酸同源性分别达99．6％与99．4％,结论：从分子水平证明出生前期HBV你儿传播的存在。