特异性RBBP10多克隆抗体的制备

目的：制备RBBP10多克隆抗体。方法：用纯化的RBBP10蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆抗体，间接ELISA法检测抗体效价，Western印迹检测抗体特异性。结果：抗血清效价可达1：1000以上。结论：经Western印迹检测证明抗体效价高，特异性强．此抗体可通过免疫组化方法检测RBBP10蛋白在各种肿瘤中的表达。具有一定的应用价值。     

Wilson蛋白N端多克隆抗体的制备和纯化

[目的]制备并纯化Wilson蛋白(ATP7B)的N端多克隆抗体，为进一步研究其基因表达蛋白的结构和功能打下基础。[方法]RT-PCR扩增目的基因，GST基因融合载体表达融合蛋白，亲和层析进行蛋白纯化，Thrombin酶切并收集目的蛋白，免疫家兔，ELISA检测抗体滴度，离子交换层析纯化抗体血清，Western blot检测抗体特异性。[结果]ELISA方法检测抗体滴度达到了1：2500，Western blot表明该抗体有很好的特异性，非变性SDS-PAGE显示纯化后的抗体IgG纯度很高。[结论]应用该方法成功制备了Wilson病蛋白质量的多克隆抗体。     

抗rhANG多克隆抗体的制备及初步应用

目的 制备抗重组人血管生长素(recombinant human angiogenin，rhANG)多克隆抗体，并初步应用于消化道肿瘤实验研究。方法 用重组基因工程菌表达，SDS法纯化的rhANG蛋白免疫新西兰兔，制备并纯化多克隆抗体，并用免疫组织化学和ELISA等方法对多克隆抗体进行测定。结果 此次获得的抗血清ELISA方法效价达1：12800，检测ANG灵敏度最低为8～16μg／L，不与其他细胞因子和血清反应。该抗体与20％～30％消化道恶性肿瘤呈阳性反应。结论 ANG多克隆抗体对表达ANG的肿瘤组织反应特异性强，ELISA方法检测灵敏度高，该抗体可用于ANG的检测。     

新耐药基因HA117多克隆抗体的制备与鉴定

目的制备HA117多克隆抗体。方法以HA117表达质粒pAdTrack-HA117为模板,PCR扩增HA117基因,扩增产物转入BL21(DE3)感受态细胞,进行HA117蛋白诱导表达,采用SDS-PAGE检测表达产物。纯化HA117蛋白后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。通过间接ELISA检测其效价。将转染携带HA117重组腺病毒的HEK293细胞为实验组,未转染的HEK293细胞为对照组,用细胞免疫荧光和Western blot方法检测其过表达的HA117蛋白,验证制备的HA117多克隆抗体的特异性。结果成功获得HA117多克隆抗体,间接ELISA法检测显示抗HA117血清效价为1∶729 000。细胞免疫荧光和Western blot检测示制备的HA117多克隆抗体可以特异性识别HA117抗原蛋白。结论获得了效价和特异性较高的HA117多克隆抗体。     

人肝脏微粒体多克隆抗体的制备

目的 利用肝脏微粒体制备多克隆抗体,为制备肝微粒体单克隆抗体奠定基础。方法 用肝微粒体制备抗原,免疫动物制备抗体,并用免疫沉淀、固相免疫吸附、Westem blotting法鉴定抗体特性。结果 在动物血清中检测到多克隆抗体。结论 鉴定肝微粒体多克隆抗体为将来制备肝微粒体单克隆抗体做前期工作。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA) 多克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备金黄色葡萄球菌肠毒素A( SEA) 多克隆抗体并用金黄色葡萄球菌野生株对其进行验证,
为进一步研究SEA 在金黄色葡萄球菌致病机制中的作用提供基础。方法: PCＲ 方法扩增肠毒素A 基因( sea) ,
构建原核表达载体pET 30 a /sea,经PCＲ 方法和测序鉴定后,阳性表达载体转化大肠杆菌表达宿主菌DH 5α,表
达产物用十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS－PAGE) 和蛋白质印迹法( Western Bloting,WB) 分析鉴定。
蛋白经纯化后作为免疫原免疫新西兰大白兔,得到抗血清并纯化,采用sea 基因阳性的金黄色葡萄球菌野生株S
8 和S 23 株的菌体蛋白进行鉴定。结果: pET 30 a /sea 重组表达载体构建成功,目的蛋白在构建的原核表达系统
中可实现高表达,纯化后得到高纯度的SEA 蛋白,经临床分离金黄色葡萄球菌S 8 和S 23 株菌体蛋白验证,证实
得到理想的兔抗SEA 多克隆抗体。结论:通过基因重组技术,金黄色葡萄球菌SEA 蛋白在构建的原核表达系统
中得以成功表达,并获得了高纯度的目的蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究金黄色葡萄球菌肠毒素A 蛋白的
生物学活性及抗体的保护作用奠定了基础。     

小鼠Rnf141多克隆抗体的制备及鉴定

目的 获得小鼠Rnf141多克隆抗体,并对其功能进行初步研究.方法 利用多聚酶链反应(PCR)扩增获得鼠Rnf141基因并且与原核表达载体pGEX-5X-3(含GST标签)进行重组,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L IPTG在25 ℃条件下诱导,用SDS-PAGE检测,获得GST-Rnf141融合蛋白高效表达后,通过Glutathione Sephorase 4B纯化.纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,通过Western blot和免疫组织化学的方法检测抗体的特异性.结果 成功构建了重组质粒pGEX-Rnf141,该质粒能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白GST-Rnf141,融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的46%,制备的多抗效价达1∶128000,它可以与GST-Rnf141重组蛋白和小鼠不同脏器组织Rnf141蛋白发生特异的抗原抗体反应,在脾脏和脑组织中Rnf141蛋白表达量较高.结论 成功制备小鼠Rnf141多克隆抗体,该抗体为研究Rnf141的表达与功能提供了有用的工具.     

增强型绿色荧光蛋白原核表达纯化与多克隆抗体的制备

目的：进行增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的克隆、原核表达和纯化以及多克隆抗体的制备，为以后纯化EGFP融合蛋白奠定基础。方法：构建pGEX-4T3—EGFP重组质粒，在大肠杆菌BL21中进行原核表达，用亲和层析法纯化GST—EGFP，免疫BAB／c小鼠制备EGFP多克隆抗体。结果：①目的蛋白GST—EGFP表达量为8g／L。②获得纯抗体溶液5m1。浓度为0．4g／L。③EGFP抗体在1：100000稀释度时，Western blot检测条带清晰，背景干净。结论：通过优化诱导条件，利用大肠杆菌可低成本获得大量GST—EGFP。直接使用GST—EGFP融合蛋白免疫BAB／c小鼠，可在较短时间内大量制备EGFP多克隆抗体。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）多克隆抗体并用金黄色葡萄球菌野生株对其进行验证,为进一步研究SEA在金黄色葡萄球菌致病机制中的作用提供基础。方法：PCR方法扩增肠毒素A基因（sea）,构建原核表达载体p ET 30 a/sea,经PCR方法和测序鉴定后,阳性表达载体转化大肠杆菌表达宿主菌DH 5α,表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western Bloting,WB）分析鉴定。蛋白经纯化后作为免疫原免疫新西兰大白兔,得到抗血清并纯化,采用sea基因阳性的金黄色葡萄球菌野生株S8和S 23株的菌体蛋白进行鉴定。结果：pET 30 a/sea重组表达载体构建成功,目的蛋白在构建的原核表达系统中可实现高表达,纯化后得到高纯度的SEA蛋白,经临床分离金黄色葡萄球菌S 8和S 23株菌体蛋白验证,证实得到理想的兔抗SEA多克隆抗体。结论：通过基因重组技术,金黄色葡萄球菌SEA蛋白在构建的原核表达系统中得以成功表达,并获得了高纯度的目的蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究金黄色葡萄球菌肠毒素A蛋白的生物学活性及抗体的保护作用奠定了基础。     

人L-选择素的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：构建人L-选择素原核表达载体,表达并纯化人L-选择素重组蛋白,制备兔抗人L-选择素多克隆抗体。方法：利用人L-选择素cDNA的N末端胞外结构区153个氨基酸的开放阅读框架(ORF),通过PCR方法扩增出人L-选择素目的片段。将扩增的基因插入表达载体pQE40的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点之间,再经转化使其在大肠杆菌M15中表达,产生含6-His-tag的融合蛋白。融合蛋白经Ni亲合层析柱纯化和SDS-PAGE分析后,用以免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。最后经Western blotting检测和斑点杂交（DIBA）进行抗体效价测定。结果：酶切鉴定和DNA测序显示,pQE40-L-选择素重组表达载体含有人L-选择素N末端结构区153个氨基酸的cDNA序列;通过在大肠杆菌M15中的表达和纯化分析,获得了蛋白含量为600 mg·L^-1的人L-选择素蛋白;通过免疫新西兰白兔和抗体效价测定,得到抗血清效价达1∶1 000的多克隆抗体。结论：人L-选择素蛋白可在M15大肠杆菌中高效表达,其多克隆抗体效价较高。     

hErmin160蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的:对hErmin氨基端160个氨基酸(hErmin160)蛋白进行表达、鉴定和纯化并制备其多克隆抗体,为研究hEr-min功能奠定基础.方法:PCR扩增编码hErmin160的核苷酸序列,克隆入原核表达载体pET41-b( ),转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,诱导表达hErmin160融合蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Western Blot进行鉴定,经镍柱纯化后,免疫家兔,制备其多克隆抗体,并对免疫后抗血清进行亲和纯化,用Western-Blot检测抗体纯化的效果.结果:测序证实获得hEr-min氨基端前160个氨基酸的编码序列;SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量为51 ku,与理论值相符;灰度扫描分析hErmin160融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的10%,纯化产物纯度达92%;Western Blot确认所表达的蛋白;抗血清和纯化后的多克隆抗体Westerm Blot反应均为阳性.结论:利用大肠杆菌融合表达系统,获得了较高纯度的可溶形式hErmin160融合蛋白,并通过亲和纯化成功制备hEr-min160多克隆抗体.     

多西环素多克隆抗体的制备及鉴定

目的:采用人工偶联方法构建多西环素完全抗原,制备多克隆抗体。方法:分别采用直接偶联法、甲醛一步法、重氮法+混合酸酐法和重氮法+碳二亚胺法等4种方法将多西环素与牛血清白蛋白(bull serum albumin,BSA)或鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)分别偶联,构建人工完全抗原。选择最好偶联效果制备的抗原免疫BALB/c小鼠,通过直接ELISA法检测多克隆抗体效价,竞争抑制ELISA法分析其灵敏性及特异性。结果:重氮法+碳二亚胺法偶联的多西环素人工完全抗原效果最好,其与BSA的偶联比为8.37∶1,与OVA的偶联比为4.92∶1。采用该方法偶联的抗原免疫小鼠获得的多克隆抗体效价在1∶8 000以上;该抗体对多西环素的半数抑制浓度(IC50)为98.89~120.32μg/L,与其他四环素类药物的交叉反应性较低。结论:重氮法+碳二亚胺法的偶联效率最高,获得的多西环素多克隆抗体效价较高,特异性和灵敏度均较理想。     

抗人端粒重复序列结合因子多克隆抗体制备及纯化

目的 制备并纯化抗人端粒重复序列结合因子片段（TRF1^33-277)的多克隆抗体。方法 运用基因工程的方法表达人工TRF1^33-277，将表达蛋白经亲和层析大量纯化后免疫白哆，制备血清过柱纯化，将TRF1^33-277和GST交连于CNBr-活化的Sephrose4B柱，血清过GST柱以去除抗GST抗体，然后经GST-TRF1柱吸收抗TRF1抗体，获得兔抗人TRF1多克隆抗体。结果 用此抗体作为一抗。在人膀胱癌细胞总蛋白中检到68KD的特异条带，与阳对照基本一致。结论 兔抗人TRF1多克隆抗体制备方法有效。所获抗TRF1^33-277多克隆抗体为国内首次报道。     

猪白血病抑制因子多克隆抗体的制备及其免疫定位

目的：构建猪LIF原核表达载体，表达并纯化重组猪LIF蛋白，制备兔抗猪LIF多克隆抗体并进行免疫定位。 方法：根据GenBank中猪LIF cDNA基因序列扩增出目的基因片段，将扩增的片段克隆进 PET-31b表达载体的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，经转化使其在大肠杆菌BL21中表达，产生重组猪LIF蛋白，纯化后作为抗原免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体；经ELISA和Western blotting分析鉴定抗体的效价和特异性；最后利用所制备的抗体进行LIF蛋白在猪体内的免疫定位。结果：酶切和DNA测序显示,所构建的原核表达质粒PET-31b-mpLIF含有编码成熟型猪LIF蛋白的cDNA序列；表达结果显示，诱导样品在相对分子质量约20 000的位置上有明显的增强表达条带；纯化结果显示，重组蛋白在相对分子质量约20 000的位置上有一条清晰、单一的条带；通过免疫新西兰大白兔，获得了特异性较高、效价达1∶10 000的多克隆抗体；应用该抗体进行的免疫定位显示，LIF蛋白在心肌细胞、脾索和脾被膜的单层上皮细胞、肺成纤维细胞中有弱表达。结论：重组猪LIF蛋白在大肠杆菌中进行了高效、正确表达；得到了效价较高、特异性较强的多克隆抗体；LIF蛋白在心肌细胞、脾索和脾被膜的单层上皮细胞、肺成纤维细胞中有弱表达。     

晚期糖化终产物及其多克隆抗体的制备

目的制备晚期糖化终产物(advanced glycoslation endproducts,AGEs)及其多克隆抗体并鉴定其特异性用于糖尿病及其并发症的研究.方法牛血清白蛋白(BSA)与葡萄糖(100mg/L)孵育3个月和多点、多次免疫接种新西兰大耳白兔,所得抗血清用亲和层析纯化鉴定.结果AGEs-BSA荧光值为5.26±0.21,而BSA为0.16±0.01.荧光光谱扫描显示AGEs-BSA激发高峰位于365nm,发射高峰位于446nm.抗-BAGEs抗体亲和层析前抗体滴度为1:128,亲和层析后抗体滴度为1:2(P＜0.01).结论所制备的晚期糖化终产物及其抗体效价高,质量稳定.为进一步研究糖尿病及其并发症提供了必要的物质基础.     

单纯疱疹病毒胸苷激酶多克隆抗体的制备

目的：克隆单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因,并在大肠杆菌中表达,通过免疫家兔,获得HSV-TK多克隆抗体,为进一步研究HSV-TK 的功能奠定基础。方法：从纯化的单纯疱疹病毒(HSV)中提取病毒基因组,用PCR特异性扩增HSV-TK全长基因,克隆入表达载体pRSET B中进行表达,以纯化的表达产物免疫家兔制备多克隆抗血清,进行Western blotting 鉴定。结果：用IPTG诱导后,表达出相对分子质量（Mr）约43 000的融合蛋白,免疫家兔制备的兔血清,第2～5周每周采血1次,Western blotting检测均获得特异性蛋白带;最后一次样品3个稀释度（1∶1 000、1∶3 000、1∶5 000）的Western blotting分析仍可以检出蛋白质带。结论：成功获得了特异性强和滴度高的HSV-TK多克隆抗体。     

前列腺特异性抗原多克隆抗体的制备及初步应用

用盐析法，阴，阳离子交换柱层析及凝胶过滤法，从人前列腺组织中分离纯化前列腺特异性抗原，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示其分子量为３４ＫＤ。以该抗原常规免疫家兔，获得抗ＰＳＡ多克隆抗体，此抗体经进一步纯化后，以免疫印迹技术证实它具有ＰＳＡ３４特异性。     

小鼠Tnfaipl基因的克隆、表达及抗体制备

目的克隆小鼠Tnfaipl基因，并在大肠杆菌中表达，通过免疫新西兰兔，获得小鼠Tnfaipl多克隆抗体，为进一步研究小鼠Tnfaipl的功能奠定基础。方法用RT-PCR方法从小鼠肝脏组织中扩增获得Tnfaipl基因的蛋白质编码区，将目的片段连接到PMD18-T载体，然后亚克隆至pGEX-4T-2中，进而在大肠杆菌BL21（DE3）中表达融合蛋白质GST-Tnfaipl，并用其免疫新西兰兔，获得小鼠Tnfaipl多克隆抗血清。结果得到了小鼠Tnfaipl多克隆抗体。结论成功得到了特异性好的、效价高的小鼠Tnfaipl多克隆抗体。     

胞嘧啶脱氨酶的原核表达和多克隆抗体的制备

目的：在原核系统中表达并纯化大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,CD)，制备鼠抗大肠杆菌CD多克隆抗体，方法：亚克隆CD基因到原核表达载体pMAL-c2和pBV222中，并转化入大肠杆菌DH5α内，诱导表达并纯化MBP-CD和6his-CD融合蛋白，用纯化的MBP-CD融合蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果：通过重组质粒的酶切筛选出重组阳性克隆，成功地表达和纯化出MBP-CD和6his-CD融合蛋白，用纯化的MBP-CD成功制备了鼠抗CD多克隆抗体，并用6his-CD和GST-CD重组蛋白进行Western印迹分析，证实了抗体的正确性，结论：应用多克隆抗体可以检测体内外CD基因的表达，为临床前和临床上深入开展CD基因的生物治疗研究提供重要的实验材料。     

癌症转移相关基因Syntenin1多克隆抗体的制备与鉴定

目的 获得原核表达GST-Syntenin1融合蛋白,制备高效价的抗Syntenin1多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增Syntenin1 cDNA开放阅读框(CDS)序列,亚克隆到编码GST的pGEX-4T-2原核表达载体上,将编码Syntenin1的pGEX-4T-2-Syntenin1重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Syntenin1融合蛋白表达,对融合蛋白亲和纯化.SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体效价及特异性.结果 成功制备GST-Syntenin1融合蛋白及多克隆抗体.Western blot结果表明Syntenin1兔多克隆抗体效价可达到1∶20 000,且与Syntenin1蛋白特异结合.结论 成功制备Syntenin1多克隆抗体,为进一步研究Syntenin1基因的功能奠定了基础.