人IL2/GMCSF融合基因的克隆及序列测定

通过PCR技术,构建与克隆了IL2/GMCSF融合基因,并进行了序列测定。该融合基因的克隆成功,为表达具有IL2、GMCSF双功能活性的新型融合蛋白,以及发现细胞因子的新生物学功能等研究提供了有利条件。     

登革病毒衣壳蛋白与葡萄球菌核酸酶融合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：实现登革病毒衣壳蛋白C与葡萄球菌核酸酶SN融合蛋白在大肠杆菌中的表达。方法：利用基因重组技术将通过BamHⅠ连接在一起的CSN基因克隆入表达载体pLEX，转化大肠杆茵G1724并以色氨酸诱导表达，用SDS-PAGE和免疫印迹法鉴定表达的融合蛋白，采用TDA显色法检测融合蛋白中SN的活性。结果与结论：成功构建重组表达载体pLEX-CSN并在大肠杆菌中获得表达，表达的融合蛋白相对分子质量约27000，可被抗登革病毒C蛋白抗体识别，并具有SN的生物活性。为探讨登革病毒衣壳蛋白靶向性抗病毒作用奠定了基础。     

FAS抗原胞外区片段GST融合蛋白 产生

获得得重组ＦＡＳ抗原，用于抗体制备及进一步的功能分析，方法用ＰＣＲ技术从完整的ＦＡＳｃＤＮＡ克隆上扩增其编码胞外区的部分，将ＰＣＲ产物直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统，ＤＮＡ序列分析证实序列完全正确；用ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ将ＦＡＳ胞外区片段切出，     

在大肠杆菌中以非融合蛋白形式高效表达丙型肝炎核心蛋白

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，扩增出完整的丙型肝炎病毒核心蛋白基因，将其克隆于表达载体ｐＢＶ２２０ ＰＲＰＬ启动子的下游，构建了重组质粒ｐＢＶ－ＨＣＶ；转化大肠杆菌后，以非融合蛋白方式表达了丙型肝炎病毒核心蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示，此蛋白的分子量约为２０ｋＤａ，表达量约占菌体蛋白的１１％；Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹实验证明，此蛋白能与慢性丙型肝炎患者血清发生特异反应。序列分析结果表明，克隆于ｐＢＶ     

人MD-2/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达

构建人髓样分化蛋白－2（human myeloid differentiation proterin-2,hMD-2)与谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione-S-transferase,GST)的融合蛋白（hMD-2/GST)表达载体PGEX－4T－1／hMD-2，在大肠杆菌中融合表达hMD-2/GST。以真核表达载体PEF－BOS／hMD-2为模板，用PCR法在MD－2编码序列上下游引入酶切位点和终止密码子，将hMD-2编码序列克隆入原核表达载体PGEX－4T－1的相应酶切位点，用PCR和酶切筛选，鉴定重组质粒PGEX－4T－1/hMD-2，并对插入基因片断测序，重组质粒PGEX－4T－1／hMD-2转化大肠杆菌，经IPTG诱导后用SDS－PAGE分析表达产物。结果PCR，酶切鉴定和序列测实MD－2编码序列正向插入原核表达载体PGEX－4T－1的相应酶切位点，片断与PCR扩增产物大小相同，序列无误，阅读框架正确，SDS－PAGE证实hMD-2/GST在大肠杆菌中表达，表达量约占菌体总蛋白的30％，说明成功构建了PEGX－4T－1／hMD-2载体，hMD-2/GST融合蛋白在大肠杆菌中得到初步表达，为MD－2后续研究作了必要的准备。     

FAS抗原胞外区片段GST融合蛋白的产生

目的：获得重组ＦＡＳ抗原，用于抗体制备及进一步的功能分析。方法：用ＰＣＲ技术从完整的ＦＡＳｃＤＮＡ克隆上扩增其编码胞外区的部分，将ＰＣＲ产物直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统，ＤＮＡ序列分析证实序列完全正确；用ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ将ＦＡＳ胞外区片段切出，定向克隆到经同样酶切处理的ｐＧＥＸ－ＫＧ表达载体，转化大肠杆菌，经优化ＩＰＴＧ的诱导条件，获得了ＦＡＳ胞外区与谷胱甘肽－Ｓ－转移酶的融合蛋白高效表达；用亲合层析法从细菌粗提物中纯化了ＧＳＴ－ＦＡＳ融合蛋白，免疫家兔制备了抗ＦＡＳ抗体。结果：用重组ＦＡＳ为免疫原制备的抗体能诱导Ｕ９３７细胞产生细胞凋亡。结论：重组ＦＡＳ抗原和制备的抗体能用于对ＦＡＳ系统的功能研究     

新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的表达优化

目的：我们所研创的pRSETa-B7-2-PE40KDEL／BL21 pLysE工程菌通常情况下更多的是以包涵体形式为主，而少部分为可溶形式，本研究试图在不改变其结构而仅通过优化各种已知影响原核表达系统的相关因素而获得稳定、高效的几乎全部以可溶性形式表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白。方法：针对更换不同的培养基、降低或升高诱导温度、增加或减少IPTG的用量、延长或缩短诱导时间等诸多能够增加可溶性表达量的各种因素进行较为系统的探索。结果：该工程菌在无压力选择条件下传代50代后的表达稳定性约为60％；通过大量对比研究，我们最终确定了pRSETa-B7-2-PE40KDEL／BL21 pLysE菌种的最佳培养诱导表达方案：即过夜活化的菌种以2％浓度接种于2YT培养基，22℃培养至D值约为0．4时加入0．1mmol／L IPTG，诱导12h，由此可获得较高水平的、稳定的、几乎全部为可溶性表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白，目的蛋白量占菌体总蛋白的≥24％。结论：通过优化各种已知影响原核表达系统的相关因素，获得了稳定、高效的几乎全部以可溶性形式表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的工程菌，为进一步有效分离纯化该蛋白奠定了基础。     

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的表达纯化及多克隆抗体制备

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活基因2(FTP2)的原核表达载体并诱导其表达,制备多克隆抗体并探讨其在临床病理组织中表达的意义。方法通过PCR获得HCVFTP2基因,将其克隆至原核表达载体pET32a( )上,构建重组表达载体,在大肠埃希菌BL21中诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blotting验证后进行大量表达并纯化。将纯化的重组蛋白免疫家兔获得多克隆抗体,并将此抗体作为诊断试剂观察其在正常肝组织和临床病理组织中的表达情况。结果以pET32a( )-FTP2表达载体转化BL21菌后,经IPTG诱导,成功获得大量重组蛋白,分子量约为25kD。将此重组蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体,经抗体间接ELISA检测证明,多克隆抗体效价>1:128000,免疫组化显示多克隆抗体能够与丙型肝炎、肝硬化、肝细胞癌等临床病理组织产生FTP2抗原反应。结论成功表达了HCV的FTP2蛋白并制备了其多克隆抗体,证实FTP2与丙型肝炎、肝硬化的发病机制密切相关。     

融合His标签的HCV包膜糖蛋白E2的真核表达及意义

目的 构建HCV包膜糖蛋白E2与His标签融合的真核表达载体并在CHO细胞中表达,为研究HCV包膜糖蛋白的功能奠定基础。方法 利用PCR技术从HCV基因组序列中扩增出编码HCV包膜糖蛋白E2的基因,将其插入原核表达载体pET28(a)载体中,构建pET28(a)-HCVE2,从pET28(a)-HCVE2上获得His-HCVE2融合基因,插入pcDNA3．1,构建表达HCV包膜糖蛋白E2与His标签融合蛋白的真核表达载体pcDNA3．1-His-E2。用脂质体介导法将pcDNA3．1-His-E2转染CHO细胞,通过间接免疫荧光、Western blot检测融合蛋白在CHO细胞内的表达。结果 转染HCVE2与His融合基因的真核表达载体的CHO细胞内声融合蛋白的表达。结论 与His标签融合的HCV包膜糖蛋白E2能够在CHO细胞内表达。     

IL—12与IL—2活化的淋巴细胞表型差异及其意义

为探讨IL 12与IL 2作用下外周血淋巴细胞 (PBL)生长的细胞表型的特点 ,采用免疫荧光标记 ,流式细胞仪 (FCM)检测了外周血淋巴细胞在IL 2和IL 12作用下 ,CD2、CD3、CD8、CD2 8、CD19和NK等细胞表型。结果显示 ,IL 2与IL 12培养 72h细胞表型发生了明显变化 ,IL 12作用显著变化为CD2增加 (P <0 .0 5 )和NK细胞增加 (P <0 .0 1) ,CD19阳性B细胞也见增加 (P <0 .0 5 ) ,CD3减少 (P <0 .0 1)。IL 2作用下CD2、CD3均显著增加 (P <0 .0 1) ,CD19明显减少 (P <0 .0 5 ) ,NK细胞也增加 ,CD8和CD2 8以及CD8+ /CD2 8+ 细胞增加最多 (P <0 .0 1)。由此表明 ,IL 2与IL 12诱导淋巴细胞生长的表型显著差异在于IL 12主要促进NK细胞表达 ,对B细胞的生长亦有维持作用 ;而IL 2主要作用为促进T细胞生长 ,特别是对CD8和CD8/CD2 8双阳性细胞作用最显著。     

肿瘤相关抗原MART-1蛋白原核表达载体的构建、表达纯化和活性鉴定

目的构建编码肿瘤相关抗原MART-1融合基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达His-MART-1融合蛋白,并对蛋白进行纯化和免疫原性鉴定。方法采用PCR法扩增编码MART-1的基因片段,将该基因片段克隆到含有His标签的pET-28b原核表达载体上,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌,IPTG诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白并进行脱盐,SDS-PAGE电泳和Western blotting法鉴定。通过ELISA法检测经树突状细胞提呈后的His-MART-1融合蛋白对特异性CD4+T细胞的刺激作用。结果重组质粒经双酶切、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。His-MART-1融合蛋白经表达纯化后,分子量约13kD,与预期值相符。Western blotting证实该融合蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合。His-MART-1融合蛋白经树突状细胞提呈后能刺激MART-1特异性CD4+T细胞分泌IFN-γ。结论成功构建了编码MART-1基因原核表达载体pET-28b-MART-1,表达及纯化获得该融合蛋白,并证实其具有良好的免疫原性。     

PTD-NGF融合蛋白的制备、活性分析及其跨膜功能研究

目的:构建PTD-NGF融合基因,检测表达的重组蛋白生物学活性和跨膜转运功能.方法:提取小鼠大脑组织RNA逆转录后,钓取β-NGF基因.PCR技术构建PTD-NGF融合基因,插入表达质粒pBV220后,转化大肠杆菌DH5α进行表达与纯化.稀释法复性后,SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达重组蛋白.PC12细胞分化培养检测融合蛋白的生物学活性.重组蛋白与HepG2细胞共孵育,免疫组化检测其跨膜功能.结果:PTD-NGF融合基因测序正确,表达产物与目的蛋白大小相符,能与NGF抗体发生结合反应.纯化后蛋白纯度可约达90%以上,重组蛋白经复性可诱导PC12细胞出现明显分化,并能跨膜进入HepG2细胞内部.结论:成功构建了融合基因,表达的重组蛋白具有显著的生物学活性及跨膜转运功能.     

IIn-UK融合基因在CHO细胞中的高表达研究

目的 :构建新型高效真核表达载体 ,实现人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体 低分子量尿激酶 (IIn UK)在CHO细胞中的高表达。方法 :利用常规分子生物学方法 ,通过对neo基因的表达进行不同程度的弱化 ,构建了一系列新型真核表达载体 ,以IIn UK融合基因为目的基因 ,比较这些真核表达载体实现外源基因高表达的能力 ,然后挑选高表达的克隆 ,通过MTX加压扩增 ,以提高IIn UK融合基因的拷贝数及表达水平。结果与讨论 :构建了 5种新型真核表达载体 ,并筛选出优化的真核表达载体 ,通过MTX加压扩增 ,实现了IIn UK融合基因在CHO细胞中的高表达 ,表达量达到 10 μg/ (10 6细胞·2 4h )。     

利用RNAi技术抑制ARPC2基因表达的研究

目的 构建pSUPER-ARPC2表达载体,并在真核细胞中进行表达,验证ARPC2基因表达是否受到抑制。方法 设计特异性针对ARPC2基因的寡核苷酸序列,退火后利用常规酶切、连接方法将其重组至pSUPER basic载体中。对阳性克隆进行酶切和测序鉴定后,转染HEK293细胞,利用RT-PCR和Western blot检测ARPC2基因的表达情况。结果 构建的pSUPER-ARPC2载体导入HEK293细胞时,ARPC2基因的表达受到抑制,蛋白合成减少。结论 成功构建了ARPC2的RNAi表达载体,并证实其能对ARPC2基因的表达产生抑制作用,为进一步研究ARPC2的生理功能提供了重要的实验材料。     

IFN-α2a - GFE-1融合基因的构建及表达

 目的构建IFN-α 2a-GFE-1融合基因载体,检测其在转染细胞的表达,为肺癌基因导向药物治疗积累实验资料.方法应用聚合酶链式反应技术(PCR)对干扰素(IFN)-α 2a羧基端的酶切位点进行改造,并人工合成肺特异性结合多肽CGFECVRQCPERC(GFE-1)的寡核苷酸片段,二者连接后克隆入pGEM-3zf质粒,连接产物转化感受态DH5α细胞,挑选阳性克隆经EcoRⅠ+PstⅠ酶切鉴定后测序,将测序正确的目的基因从测序载体相应酶切位点消化回收并纯化后,与上述酶处理过的PBV220质粒连接,连接产物常规转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经筛选后随机挑选阳性菌落,提取质粒酶切鉴定.结果序列分析表明合成片段成功的插入IFN-α 2a羧基端,大小、位置、方向均正确无误;融合基因克隆入PBV 220表达载体在大肠杆菌中获得有效表达.结论IFN-α 2a-GFE-1融合基因载体的构建及表达,为检测其在肺内特异性分布及抑瘤活性研究提供了实验基础.     

甲病毒表达系统研究进展

介绍甲毒表达系统，包括载体和用于包装的辅助系统的构建，以及该系统在异源基因表达和核酸疫苗研究中的应用。     

C反应蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建人C反应蛋白(CRP)真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法利用带HA反向互补序列碱基的特异性引物,从p91023/CRP载体上将编码人CRP的基因序列亚克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH3T3细胞;并使用Westernblot和细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HA-CRP在NIH3T3细胞中的表达及其蛋白定位进行分析。结果PCR、双酶切和测序鉴定表明,pcDNA3/HA-CRP真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞膜和核周边内质网的区域。结论成功构建了带HA标签的人CRP真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步研究CRP的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。