丙型肝炎病毒 NS4A蛋白在胰腺细胞 cDNA文库中的结合蛋白基因的筛选

目的:从人胰腺细胞cDNA文库中筛选出与丙型肝炎病毒(HCV)NS4A蛋白存在相关作用并且参与糖、脂类代谢过程的结合蛋白,为研究HCV影响糖、脂类代谢的分子生物学机制提供实验依据.方法:构建pGBKT7-NS4A作为诱饵质粒,转化酵母菌株AH109,用SD/-Trp筛选阳性菌落.配合两种重组酵母菌株AH109与Y187...     

酵母双杂交技术筛选p7TP2蛋白结合肝细胞蛋白的编码基因

目的 筛选HCV p7蛋白反式调节蛋白p7TP2的结合蛋白,探讨HCV的致病机制及新蛋白p7TP2的生物学功能.方法 应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的p7TP2基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化单倍体酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝细胞文库质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌氨苄青霉素-LB平板上选择并测序,结果在GenBank中进行生物信息学分析.然后将阳性文库质粒与诱饵质粒回交,以证实其相互作用.结果 筛选出与p7TP2结合的蛋白基因10个,其中包括金属硫蛋白2A、载脂蛋白H、蛋白C、果糖二磷酸醛缩酶B、配对免疫球蛋白样2型受体α、CTL1基因类胆碱运输蛋白等已知功能蛋白基因相互作用,回交试验已经证实其相互作用.结论 由本研究结果发现p7TP2蛋白可以结合一系列不同功能的肝细胞蛋白,作为一种新基因,对它的进一步作用机制的研究将为阐明HCV感染及慢性肝炎、肝纤维化和肝癌的病理机制提出新的思路.     

增生性瘢痕成纤维细胞中羟基丙酮酸异构酶同系物结合结构域分析

目的 了解增生性瘢痕Fb中羟基丙酮酸异构酶同系物(HYI)与P311蛋白相互作用的结合区域. 方法(1)以克隆有P311的pMD18-T质粒为模板,对P311进行PCR扩增;Trizol法提取人增生性瘢痕Fb的总RNA,对HYI进行RT-PCR扩增,采用双酶切法分别构建pGA DT7-P311和pGBKT7-HYI重组载体,PCR及测序验证.采用Prot Seale软件和HNN软件对HYI蛋白进行二级结构分析,据此结果扩增HYI-1(1 ～447 bp)、HYI-2(247 ～447 bp)、HYI-3(1 ～279 bp)、HYI-4(247 ～654 bp)片段,双酶切法构建pGBKT7-HYI-1、2、3、4重组载体,经PCR及测序验证.(2)采用醋酸锂法将酵母细胞AH109制备成感受态细胞,粗略等量分为HYI全长与HYI-1、2、3、4杂交组,以及阳性对照组和阴性对照组.采用聚乙二醇-醋酸锂法,前5组分别同时转化pGBKT7-HyI全长、各片段的重组载体与pGADT7-P311重组载体,后2组分别同时转化pGBKT7-53与pGADT7-RecT重组载体、pGBKT7-Lam与pGADT7-RecT重组载体.转化后即刻,取各组部分细胞分别涂布在缺乏亮氨酸、色氨酸、腺嘌呤及组氨酸的培养基(简称四缺培养基)上,另取各组部分细胞分别涂布在缺乏亮氨酸和色氨酸的培养基(简称二缺培养基)上,培养3～6d,观察菌株生长情况,5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷显色反应检测菌落β半乳糖苷酶表达. 结果(1)克隆出的P311片段与Genbank中P311(序号hsu36189)序列一致.与Genbank中HYI(序号AY775560)序列对比,HYI基因扩增片段在496 bp处的A替换为了G.经验证各重组载体插入片段无误.(2)计算机模拟结果显示,组成HYI蛋白的216个氨基酸中,可能形成α螺旋的氨基酸有101个,可能形成无规则卷曲的氨基酸有90个,可能形成延伸链的氨基酸有25个.(3)HYI-1、2、3、4克隆片段大小与预期相符,经验证各重组载体插入片段无误.(4)除阴性对照组菌株未见在四缺培养基上生长外,其他组菌株均在2种培养基上生长,其中HYI-2(α螺旋结构最少)、HYI-3杂交组长出菌落较少.(5)除生长在二缺培养基上的阴性对照组菌落和生长在四缺培养基上的HYI-2杂交组菌落未见β半乳糖苷酶表达外,其他在四缺培养基上长出的各组菌落均有β半乳糖苷酶表达. 结论 HYI与P311蛋白可能以α螺旋结构紧密结合,在增生性瘢痕Fb向肌成纤维细胞转分化过程中发挥重要作用.     

HCV NS4A与钙离子信号调节亲环素配体相互作用对细胞基因表达的影响

目的 探讨HCV NS4A与钙离子信号调节亲环素配体(CAML)相互作用后对细胞基因表达的影响.方法 分别构建HCV NS4A及CAML真核表达载体pCMV/Myc-NS4A及pcDNA3.1/HisA-CAML,分别转染pCMV/Myc-NS4A(实验组)及pCMV/Myc空载体(对照组)至稳定表达CAML的293细胞,提取总mRNA,逆转录为cDNA,基因芯片技术检测转染NS4A对稳定表达CAML细胞株基因表达谱的影响.结果 与细胞凋亡有关的Rho蛋白信号转导相关基因有7种,4种呈现上调表达,3种呈现下调表达.结论 转染HCV NS4A后的293-CAML细胞的基因表达谱发生了一系列改变,尤其是一些与细胞凋亡相关的Rho蛋白信号转导途径相关基因.HCV NS4A可能通过与CAML相互作用对细胞凋亡过程产生影响,并且主要以负调节为主,从而赋予细胞对凋亡的抵抗,并可能因此导致病毒感染的慢性化.     

雄激素受体相关蛋白267-α酵母双杂交诱饵重组质粒的构建及转化

目的 构建和转化雄激素受体相关蛋白267—α(ARA267—α)的酵母诱饵重组质粒，为通过酵母双杂交研究ARA267—α的功能奠定基础。方法 用PCR扩增ARA267—α全长cDNA中编码PWWP和PHD-SET蛋白结构域的两个基因片段；将基因片段与pGBKT7载体定向重组；用酶切和测序鉴定重组质粒；将核苷酸序列正确的重组质粒转化入AH109酵母菌株。结果 成功构建pGBKT7-PWWP和pGBKT7—PHDSET重组质粒。分别转化有2种重组质粒和pGBKT7空载体的3种AH109酵母都能在SD／-Trp／X—α—gal培养基中长成白色菌落，但都不能在SD／-HiS／-Trp／2．5mmol／L 3-AT／X—α—gal和SD／-Ade／-Trp／X—α—gal培养基中生长，在SD／-Trp液中培养16h后，A600均值分别为0．8、0．9、0．9。这表明重组质粒表达的融合蛋白没有激活HIS3、ADE2和MEL1酵母报告基因表达的活性，也没有酵母毒性作用。结论 构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的cDNA文库筛选。     

人分泌的凋亡相关蛋白1基因酵母双杂交诱饵载体的构建及表达鉴定

目的构建人分泌的凋亡相关蛋白1(secreted apoptosis-related protein 1,SARP1)基因酵母双杂交诱饵载体,为鉴定SARP1基因相互作用蛋白、探讨SARP1基因在瘢痕组织中的生物学功能奠定基础。方法根据GenBank中SARP1的mRNA序列,设计分别带有NdeⅠ和SalⅠ酶切位点的上、下游引物,人工合成SARP1基因片段,扩增SARP1基因片段,构建含pGBKT7-SARP1基因的重组质粒,用NdeⅠ和SalⅠ进行双酶切、PCR,凝胶电泳及测序。用醋酸锂法将序列正确的重组质粒pGBKT7-SARP1(卡那霉素抗性筛选)转化入AH109酵母菌株,在缺陷型培养基上观察pGBKT7-SARP1在AH109中的表达情况。结果 SARP1基因扩增后的片段大小符合预期,并成功克隆入pGBKT7载体中;酶切后凝胶电泳及DNA测序显示pGBKT7-SARP1基因重组载体构建正确,对酵母菌株AH109无毒性,且不具自主激活报告基因的效应。结论成功构建了pGBKT7-SARP1基因酵母双杂交诱饵载体。     

人睾丸酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

目的:构建应用于酵母双杂交系统的人睾丸组织cDNA文库。方法:从正常人睾丸组织总RNA中纯化出mRNA,以SMARTШTM和CDSШ为引物,合成两端具有同源臂的双链cDNA,后者与线性质粒pGADT7-Rec共转化入感受态酵母细胞Y187,两者在酵母细胞中同源重组成环形的cDNA文库质粒,收集在营养缺陷培养板上筛选出的所有克隆,即为人睾丸酵母双杂交cDNA文库。结果:构建了具有基因多样性和库容量足够大的人睾丸cDNA文库,共获得2×106个转化子,插入的双链cDNA片段的长度在0.3～4.0 kb之间。结论:利用ClontechSMART技术,成功构建了应用于酵母双杂交的人睾丸组织cDNA文库,为探讨人精子发生的分子机制奠定了基础。     

新基因AngRem104与Bardet-Biedl综合征2蛋白的相互作用

目的 筛选与新基因AngRem104相互作用的蛋白,并验证AngRem104和Bardet-Biedl综合征2(BBS2)蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用,为进一步研究AngRem104的生理功能奠定基础。方法构建AngRem104的酵母真核表达载体AngRem104-pGBKT7／c-myc,用以转化酵母菌AH109,并与转化了成人肾脏cDNA文库的酵母菌Y187接合,筛选与AngRem104相互作用的蛋白。从中挑选Bardet-Biedl综合征2蛋白进行免疫共沉淀,构建AngRem104-pcDNA3．1／V5-His和BBS2-pCMV／c-myc融合表达载体,共转染HEK293T细胞。分别用小鼠抗人c-mvc单克隆抗体和小鼠抗人V5-HRP抗体进行免疫沉淀和免疫印迹,以验证AngRem104和BBS2蛋白问的相互作用。结果以AngRem104为诱饵蛋白在人肾脏cDNA文库中共筛选到包括BBS2在内的7个与之存在相互作用的蛋白。免疫共沉淀结果显示,AngRem104-V5融合蛋白能够在c-myc抗体的免疫沉淀物中检测出来：在V5抗体的免疫沉淀物中也能检测到BBS2-c-myc融合蛋白。结论AngRem104和BBS2蛋白在哺乳动物细胞中存在某种相互作用,为新基因AngRem104功能探讨和Bardet-Biedl综合征发病机制的研究提供了有价值的线索。     

生产透明质酸的兽疫链球菌NUF-035的筛选及摇瓶发酵条件

从肺炎患羊的肺叶中取得微生物 ,经菌落分离、镜检、生化反应鉴定 ,分离出兽疫链球菌 .通过正交实验确定摇瓶培养最优培养基为 :葡萄糖 6 0 g/L ,蛋白胨 10g/L ,酵母抽提物 10 g/L ,K2 HPO4 2 .0 g/L ,(NH4 ) 2 SO4 5 .0 g/L ,MgSO4 · 7H2 O 0 .5 g/L .筛选出Streptococcuszooepi demicucNUF 0 35菌株 ,该菌产生的粗品透明质酸的相对分子质量为 2 .11× 10 6 ,产量达 1.88g/L.     

乳鼠成骨细胞酵母双杂交cDNA文库构建

目的构建乳鼠成骨细胞的酵母双杂交cDNA文库。方法用TRIzol法提取乳鼠成骨细胞总RNA,按照SMART cDNA Library Construction Kit ( CLONTECH)说明书反转录合成双链cDNA.Spin Column去除短片段,然后用同源重组的方法将双链 cDNA和PGADT7~rec载体共转化到酵母细胞Y187中,建立文库并计算文库滴度。结果提取的总RNA的A 260/A 280为 1.99,琼脂糖凝胶电泳示28SrRNA、18SrRNA2条带,且28S与18S带亮度比值约为2。酵母文库库容为1. 68 x 107,重组率为 100%。插人片段PCR检测提示大小分布为1. 5 -4. 0 kb,平均长度约为3. 0 kb。结论乳鼠成骨细胞酵母双杂交cDNA文 库构建成功。