RNA干扰中小干扰RNA的设计原则

RNA干扰(RNAi)是由内源性或外源性双链RNA介导的一种高度保守的序列特异性基因表达调控机制,主要通过小干扰RNA(siRNA)和微小RNA发挥作用。由于其具有高效、高特异性、作用稳定等特点,已被广泛地应用于基础实验和疾病治疗的研究中。在进行siRNA介导的RNAi实验时,如何设计高效、特异性抑制靶mRNA的siRNA是实验成败的关键。     

RNA干扰

RNA干扰(RNA interference,简称RNAi)现象是指,当与内源性的mRNA编码区某段序列同源的双链RNA(dsRNA)导入细胞后,该mRNA发生特异性的降解,导致该基因表达沉寂。它是生物界一种古老而且进化上高度保守的现象,由于它的简单性和快速性以及高特异和高效率的特点,已被广泛用于基因功能研究、基因治疗、和新药研究与开发等方面。     

RNA干扰与鼻咽癌的研究进展

RNA干扰(RNAi)是利用双链小片段RNA高效、特异性地降解细胞内同源mRNA,阻断体内基因表达,使细胞出现靶基因缺失的表型[1]。近几年,RNA干扰研究在国内外迅速开展,并且扩大到许多方面,如抑制病毒的研究、抑制多药耐药基因的表达、在人体寄生虫研究中的应用、基因治疗、肿瘤研究等。而鼻咽癌的发病机制与许多致病因素有关,实验研究表明RNAi可以通过多种途径影响鼻咽癌细胞的生长,因此RNAi可能为鼻咽癌治疗提供新的方法。     

RNA干扰与药物的研究进展

RNA干扰是由双链RNA诱导的序列特异性的基因沉默,目前被广泛用于药物研究,特别是针对肿瘤、病毒感染性疾病、血液病及神经退行性疾病等的治疗药物。随着核酸药物在体内靶向转运技术的不断发展,RNA干扰有可能成为一种新型的治疗途径。     

RNA干扰技术

在基因治疗领域里，继反义RNA、核酶和三链DNA技术之后，现在又掀起了RNA干扰技术，这项技术在2002年度里荣登美国著名“科学”杂志评选出的世界十大科技进展之榜首，现将有关RNA干扰技术作一介绍。     

RNA干扰及其干扰技术

目前在哺乳动物中使用RNA干扰 (RNAinterference ,RNAi)技术对细胞基因的靶向性有效抑制已经慢慢被人们所认识。当导入一段大于 1 9个碱基对的双链RNA(dsRNA)入细胞中不仅可以导致导入的目的dsRNA降解 ,而且可以引起细胞内的与之同源的单链RNA(ssRNAs) ,即mRNA共同降解。这是细胞本身的固有的现象。基于以上这些因素 ,RNAi技术不仅可作为研究功能基因的强大武器 ,并且可以抑制致病基因的表达并作为一种潜在的治疗方式用于疾病的治疗     

RNA干扰技术及其应用

RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA诱发的基因沉默。在此过程中,与双链RNA有同源序列的信使RNA被降解,从而抑制了该基因的表达。从发现RNAi现象以来,对RNAi的了解已取得重大进展。包括从最初的,对其干扰模式的预测,到如今,能够精确了解RNAi在多个物种中调节基因表达的作用机制及多面性。RNAi技术也已经在很多领域成为研究基因功能的重要工具。     

RNA干扰与基因功能研究

去除或降低某个或某些基因在细胞或机体中的表达 ,是研究正常基因的结构、功能、疾病的发病机制的重要手段。进行这类研究 ,需要在遗传学和分子生物学上有易于控制的实验体系。比如基因敲除 (ｋｎｏｃｋｏｕｔ)或基因表达降低(ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ)等方法就成功地对许多特殊基因在生理或病理状态下的功能进行了研究。但这些基础方法操作比较复杂 ,费时费力 ,对靶基因的选择有很大的局限性。显性阴性(ｄｏｍｉｎａｎｔｎｅｇａｔｉｖｅ)和反义法 (ａｎｔｉｓｅｎｓｅ)是对以上方法的补充 ,但仍然具有结果不稳定 ,无法预知实验效果等缺点。因此…     

RNA干扰技术的原理与应用

RNA干扰作用(RNA i)是通过双链RNA(dsRNA)引发的转录后基因沉默机制。RNA i主要是指dsRNA分子进入细胞内,特异性降解与之同源的mRNA,从而特异高效地抑制相应基因表达活性的现象。近年来,RNA i以其高特异性、高效性等显著优势已成为研究基因功能的新手段,在功能基因组学、基因表达调控机制研究等领域得到了广泛的应用。在此对RNA干扰技术的发展历程、作用机制、作用特点及应用前景予以综述。     

RNA干扰技术及应用

目的综述RNA干扰(RNAi)技术的发现、作用机制、作用特点以及应用研究新进展。方法检索国内外有关RNAi技术研究资料并整理总结。结果RNAi技术是利用双链小片段RNA高效、特异性的降解细胞内同源mRNA,从而阻断体内基因表达,使细胞出现靶基因缺失的表型。结论RNAi技术是一项较新的研究技术,可用于基因功能、基因治疗以及新的药物筛选等研究领域。     

SMO特异性siRNA慢病毒载体的筛选构建

目的构建特异性沉默SMO基因的重组慢病毒载体,筛选对T293细胞SMO基因表达抑制效率最高的siRNA。方法根据SMO基因信息,设计了4个小干扰序列和1个阴性对照序列,利用慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP构建了5个重组质粒。用脂质体将重组慢病毒载体转染293T细胞后,Western blot检测沉默效率,从中筛选沉默效率高的质粒载体进行慢病毒颗粒大量包装。结果测序结果证明4个重组慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP-721、pGCSIL-GFP-722、pGCSIL-GFP-723、pGCSIL-GFP-724的插入序列完全正确,重组慢病毒载体转染293T细胞后,Western blotting证实重组慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP-723的干扰效率最高。包装获得Lv-SIL-SMO723慢病毒颗粒。结论成功筛选获得特异性抑制SMO的siRNA,成功构建了特异性沉默SMO基因慢病毒载体,其产生的慢病毒颗粒能高效特异地沉默SMO基因,为进一步应用奠定基础。     

Ku70 基因RNA 干扰载体的构建及干扰效果鉴定

目的构建靶向Ku70基因的RNA干扰(RNAi)表达载体并进行RNAi效果鉴定。方法设计3个针对Ku70基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染Hela细胞系。在转染24、48、72 h后,通过免疫印迹分析检测Ku70蛋白的表达量。把RNAi效果最显著的siRNA设计成短发夹RNA(short-hairpin RNA,shRNA),克隆入pSi-lencerTM 4.1-CMV hygro载体,转染Hela细胞系并筛选稳转细胞株,在mRNA和蛋白水平,评估Ku70 siRNA的干扰效果。结果 siRNA转染Hela细胞24、48 h后,Ku70蛋白的表达没有显著变化,但在72 h后,蛋白的表达量显著下降。在具有稳定表达siRNA的稳转细胞株中,Ku70基因的表达在mRNA水平和蛋白水平都受到了非常明显的抑制。结论成功构建靶向Ku70基因RNAi载体,并筛选出效能最优序列,为进一步研究Ku70基因的表达与宫颈癌放射治疗敏感性的关系奠定了基础。     

RNA干扰技术抗乙型肝炎病毒的实验研究进展

目前对乙型肝炎病毒(HBV)引起的病毒性肝炎尚无令人满意的治疗效果。RNA干扰技术的出现，为各类慢性HBV感染的治疗开辟了新的途径。作者主要从RNA干扰技术的研究背景、实验中存在的问题和应用前景等方面对其抗HBV的研究进展进行综述。     

RNA interference and its current application in mammals

Objective The aim of this review was to assess RNA interference (RNAi) and its possibility as a potential and powerful tool to develop highly specific double-stranded RNA (dsRNA) or small interfering RNA (siRNA) based gene-silencing therapeutics. Data sources The data used in this review were obtained from the current RNAi-related research reports. Study selection dsRNA-mediated RNAi has recently emerged as a powerful reverse genetic tool to silence gene expression in multiple organisms. The discovery that synthetic duplexes of 21 nucleotides siRNAs trigger gene-specific silencing in mammalian cells has further expanded the utility of RNAi in to the mammalian system. Data extraction The currently published papers reporting the discovery and mechanism of RNAi phenomena and application of RNAi on gene function in mammalian cells were included. Data synthesis Since the recent development of RNAi technology in the mammalian system, investigators have used RNAi to elucidate gene function, and to develop gene-based therapeutics by delivery exogenous siRNA or siRNA expressing vector. The general and sequence-specific inhibitory effects of RNAi that will be selective, long-term, and systemic to modulate gene targets mentioned in similar reports have caused much concern about its effectiveness in mammals and its eventual use as a therapeutic mordality. Conclusions It is certain that the ability of RNAi in mammals to silence specific genes, either when transfected directly as siRNAs or when generated from DNA vectors, will undoubtedly accelerate the study of gene function and might also be used as a potentially useful method to develop highly genespecific therapeutic methods. It is also expected that RNAi might one day be used to treat human diseases.     

RNA干扰技术用于survivin基因表达的研究

目的：构建pSUPER-SVV表达载体,并在真核细胞中进行表达,验证survivin基因表达是否受到抑制。方法：设计特异性以survivin基因为靶序列的寡核苷酸序列,退火后将其连接于pSUPERbasic载体中,经测序鉴定插入序列的正确性。以脂质体转染方法将pSUPER-SVV干扰质粒转染人类宫颈癌（HeLa）细胞,应用流式细胞术和RT-PCR方法检测survivin基因的表达情况。结果：成功构建survivin的RNAi表达载体。该载体可以使HeLa细胞中survivin基因在mRNA转录水平明显降低,与转染空质粒组相比差异具有显著性（P<0.05）。利用流式细胞术检测蛋白表达水平,转染pSUPER-SVV组抑制率可达31.62%,与转染空质粒组相比差异具有显著性（P<0.001）。结论：成功构建干扰survivin基因表达的载体,转染HeLa细胞后survivin基因在mRNA转录水平、蛋白表达水平均受到明显抑制。     

RNA干扰技术特异性抑制骨肉瘤survivin的表达

目的:体外转录合成survivin siRNA,观察其在骨肉瘤细胞株U2-OS中抑制survivin的表达情况.方法:体外转录合成survivin序列特异性双链RNA(dsRNA),转染U2-OS细胞株中,用RT-PCR和Western blot法检测转染前后survivin基因的mRNA和蛋白的表达,MTF法检测细胞增殖,观察U2-OS细胞生物学特性的改变.结果:转染特异性siRNA的细胞其survivin mRNA及蛋白表达均下调,干涉后细胞的增殖受到抑制.结论:体外转录合成特异性survivin siRNA能有效抑制骨肉瘤细胞株U2-OS中survivin的表达,抑制细胞的增殖,RNA干扰技术为骨肉瘤的治疗提供了一种新策略.     

RNA干扰抑制土拨鼠肝炎病毒X基因表达

目的:研究土拨鼠肝炎病毒(WHV)序列特异性siRNA对WHV X基因表达的抑制作用。方法:以WHV全长质粒为模板PCR扩增WHV X基因,克隆到pXF3H载体构建WHX-HA融合蛋白真核表达质粒(pXF3H-WHx);合成siRNA的模板序列,克隆到siRNA表达质粒psiRNA构建shRNA表达质粒(psiWx1、psiWx2);质粒pXF3H-WHx与psiWx1、psiWx2共转染Hela细胞,Western blot检测WHV X蛋白的表达。结果:Hela细胞中WHVX蛋白的表达受siRNA的抑制,psiWx1表达的siRNA抑制90%以上的X蛋白表达,并呈剂量依赖性,但是WHV X基因靶位点中2个突变的核苷酸可使这种干扰作用消失。结论:质粒表达的siRNA序列特异性抑制WHV X蛋白的表达。