纳米PLLA膜复合内皮生长晕细胞的相容性研究

目的 通过观察内皮生长晕细胞(EOCs)与纳米聚-L-乳酸(PLLA)有序纤维膜体外复合培养的生物相容性及黏附、增殖情况,为构建组织修复材料提供理论依据.方法 通过静电纺丝技术制备的纳米PLLA纤维支架,行低温等离子体技术改性及 Ⅰ 型胶原表面涂覆,与EOCs复合培养,测定细胞黏附率及增殖率,观察细胞生长曲线,荧光显微镜及扫描电镜下观察支架材料与种子细胞EOCs形态特征和生物相容性.结果 制备的纳米PLLA膜孔径在300～400 nm之间,孔隙率>90%.各组(单纯细胞组、无序膜组、有序膜组及超级有序膜组)吸光度(A)值均随共培养时间的增加而逐步升高; 从第5天起,有序膜和超级有序膜组A值与无序膜和单纯细胞组比较,差异有统计学意义(P＜0.05); 单纯细胞组和无序膜组各检测时间点A值差异无统计学意义(P>0.05 ).复合培养12 h及24 h后有序膜组和超级有序膜组黏附率则明显高于无序膜组,差异有统计学意义(P＜0.01).复合培养1 d、3 d及7 d后,有序膜组和超级有序膜组的增殖率明显高于无序膜组(P＜0.05,P＜0.01).细胞在支架膜上生长良好,纳米无序膜的细胞生长较散在、杂乱; 有良好空间定向效果的有序膜及超级有序膜支架有利于细胞沿纤维定向附着、伸展、增殖,以超级有序膜更有利于保持其结构.结论 EOCs是理想的组织工程种子来源细胞; 纳米PLLA有序及超级有序膜支架能促进种子细胞在材料表面的黏附、增殖,并能较好地保持细胞的形态,是一种理想的组织修复材料.     

纳米化左旋聚乳酸有序膜的细胞亲和性研究

目的 制备具有较好细胞亲和性、利于内皮生长晕细胞(EOCs))黏附增殖的纳米左旋聚乳酸有序膜,为构建组织工程血管材料提供理论依据.方法 改性后纳米纤维膜与细胞复合培养,观察细胞与材料牛物亲和性.结果 纳米纤维孔径在300～400 nm,孔隙率>90%.有序和超级有序膜组吸光度,4值与无序膜、单纯细胞组差异有显著统计学意义(P<0.05).无序膜细胞生长较散在、杂乱;有序及超级有序纤维膜有利于细胞沿纤维定向附着、增殖.结论 EOCs是理想的组织工程血管种子细胞来源.有序及超级有序膜是一种理想的组织工程血管材料.     

多巴胺表面修饰/负载软骨源性形态发生蛋白1的3D打印聚己内酯-羟基磷灰石三维多孔支架促进人BMSCs成软骨分化的实验研究

目的探讨利用3D打印技术制备、经多巴胺表面修饰及负载软骨源性形态发生蛋白1(cartilage derived morphogenetic protein 1,CDMP1)的聚己内酯(polycaprolactone,PCL)-羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)三维多孔支架,体外诱导人BMSCs(human BMSCs,hBMSCs)成软骨分化的可行性。方法采用3D打印技术制备PCL-HA支架,经多巴胺表面修饰后,将CDMP-1负载于支架上,扫描电镜观察支架表面微结构,并检测孔隙率和水静态接触角。体外成软骨分化实验:分为A、B、C 3组,A组为PCL-HA支架,B组为多巴胺表面修饰的PCL-HA支架,C组为多巴胺表面修饰及负载CDMP-1的PCL-HA支架;将h BMSCs植入3组支架,成软骨诱导培养后比较细胞黏附率、细胞增殖(MTT法)和细胞活性(Live/Dead染色法),并采用实时荧光定量PCR检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的基因表达。结果 3组支架均呈三维多孔圆柱体状,孔洞相互联通,孔径为400~500μm,孔隙率为56%,材料纤维走向为0°/90°。经多巴胺表面修饰后,支架颜色由初始的白色变为棕色;水静态接触角也由76°降为0°。体外培养24 h,A、B、C组细胞黏附率分别为34.3%±3.5%、48.3%±1.5%、57.4%±2.5%,比较差异均有统计学意义(P0.05)。Live/Dead染色显示3组细胞均有较好的细胞活性。MTT检测显示各组h BMSCs均生长良好,吸光度(A)值随培养时间延长而增大;培养4、7、14、21 d时,C组A值显著高于A、B组,B组高于A组,差异均有统计学意义(P0.05)。随培养时间延长,3组Ⅱ型胶原mRNA和Aggrecan mRNA表达均持续增加;培养7、14、21 dⅡ型胶原mRNA相对表达量及培养14、21 d Aggrecan mRNA相对表达量,C组均显著高于A、B组,B组高于A组,比较差异有统计学意义(P0.05)。结论采用3D打印技术制备、经多巴胺表面修饰及负载CDMP-1的PCL-HA三维多孔支架,体外与hB MSCs共培养,可促进细胞黏附、增殖及成软骨分化。     

壳聚糖/胡须/磷酸钙骨水泥复合生物材料的力学性能及对诱导多能干细胞成骨潜能的影响

目的观察新型强化型磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement,CPC)生物支架材料的力学性能以及对诱导多能干细胞(induced potential stem cells,i PS)生物活性及成骨潜能的影响。方法根据制备的支架材料不同,将实验分为4组,A组为单纯CPC支架组,B组为CPC∶10%wt壳聚糖为2∶1比例混合支架组,C组为CPC∶10%wt壳聚糖∶胡须为2∶1∶1比例混合支架组,D组为CPC∶10%wt壳聚糖∶胡须为2∶1∶2比例混合支架组。检测各组支架材料力学性能(抗弯强度、断裂功、硬度及弹性模量)。与第5代i PS-MSCs复合培养1、3、7、14 d采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测各组吸光度(A)值;1、7、14 d行ALP活性检测、Live/Dead荧光染色及定量检测、RT-PCR检测成骨基因ALP、Runx2、Ⅰ型胶原、骨钙蛋白(osteocalcin,OC)及BMP-2表达;1、7、14、21 d行茜素红染色观察。取3月龄雄性SD大鼠24只,建立8 mm颅骨骨缺损模型,随机分为4组(n=6),分别植入对应的4组支架材料,术后8周取材行HE染色观察骨缺损修复情况,并检测新生骨体积百分比和新生血管密度。结果 B、C、D组抗弯强度、断裂功、弹性模量及硬度均显著高于A组,C、D组高于B组,D组高于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。CCK-8法检测示随培养时间增加,细胞活性逐渐增加,3、7、14 d时B、C、D组A值均显著高于A组,C、D组高于B组(P0.05),C、D组间比较差异无统计学意义(P0.05)。Live/Dead荧光染色示,7、14 d时B、C、D组活细胞比例均显著高于A组(P0.05),7 d时C、D组显著高于B组(P0.05);RT-PCR检测示,7、14 d时B、C、D组各基因相对表达量均显著高于A组,C、D组显著高于B组(P0.05),C、D组间比较差异无统计学意义(P0.05);茜素红染色示随培养时间延长,各组支架材料表面的红色钙盐沉积均逐渐加深变厚,14、21 d时B、C、D组A值均显著高于A组,C、D组高于B组(P0.05),C、D组间差异无统计学意义(P0.05)。动物体内修复实验显示,各组新生骨主要填充于支架材料间隙中,成骨细胞和新生血管被基质中的新生骨组织包围,成骨细胞排列在新生骨边界上,B、C、D组新生骨显著多于A组,C、D组显著多于B组。B、C、D组新生骨体积百分比和新生血管密度均显著高于A组,C、D组高于B组,差异有统计学意义(P0.05);C、D组间差异无统计学意义(P0.05)。结论复合壳聚糖、胡须和CPC制备的新型强化型复合生物支架材料的机械性能明显优于单纯CPC支架材料,可满足皮质骨及松质骨的机械性能要求。i PS-MSCs在新型强化型复合生物支架材料上黏附、增殖,骨组织修复效果良好,可满足骨植入材料的生物活性及成骨活性要求。     

促进内皮祖细胞生长的细胞外基质组织工程血管支架的研究

目的 研究鼠骨髓来源内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)在不同类型细胞外基质支架上的生长特性,为EPCs生长寻找新的生物组织工程血管支架.方法 EPCs种植于细胞外基质支架(extracellular matrix,ECM)上.培养不同时间点用免疫荧光技术鉴定并细胞记数;电镜观察支架表面结构及EPCs的生长情况;Western blotting法、real-time PCR法检测VWF(von Willebrand factor)蛋白及mRNA表达变化.结果 在1、3、5 h 3个检测点的压缩组细胞贴壁率明显高于未压缩组(P<0.01).在1、3、7 d压缩组的细胞数明显高于未压缩组(P<0.05),10d后差异无统计学意义,且压缩组细胞形态较成熟,与内皮细胞相似,有一个较平整的细胞平面.Western blotting检测表明3、7、10 d VWF蛋白在压缩支架上表达比未压缩支架上强,14 d后两组表达相当.real-time PCR结果示3、7、10 d压缩组VWF基因表达量明显高于未压缩组(P<0.01),14 d后两组表达无差异.结论 压缩ECM更能促进EPCs黏附、增殖和分化,可作为一种新的合成人工血管的生物组织工程支架.     

釉基质蛋白对人皮肤成纤维细胞黏附、增殖及Ⅰ型胶原前mRNA合成影响的体外研究

目的 观察釉基质蛋白(enamel matrix proteins,EMPs)对体外培养的人正常皮肤成纤维细胞黏附、增殖及Ⅰ型胶原前mRNA合成的影响.方法 取自愿捐赠包皮环切术后包皮组织,采用组织块法培养人皮肤成纤维细胞,取第3～6代细胞进行实验.以终浓度为50、100、150、200 μg/mL的EMPs工作液预铺培养板.①细胞黏附实验:取细胞以1 × 106个/mL置于预铺EMPs的96孔培养板,每孔0.2 mL,作为实验组(A、B、C、D组).培养1.5、3.0和4.5 h后MTT比色法测定黏附细胞量.②细胞增殖实验:取细胞以5 × 104个/mL置于预铺EMPs的培养板,每孔0.2 mL,作为实验组(A1、B1、C1、D1组).于第2、4、6、8天以MTT比色法测定增殖细胞量.③细胞Ⅰ型胶原前mRNA合成实验:取细胞以1×106个/mL置于预铺EMPs培养板,每孔2 mL,作为实验组(A2、B2、C2、D2组).于培养第5天RT-PCR法测定Ⅰ型胶原前mRNA合成的量.以上实验均以相同浓度细胞悬液加入未预铺EMPs的板孔作为对照组,每组均3个复孔.结果 ①细胞黏附实验中,各时间点B、C、D组与A组及对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);A组与对照组间及B、C、D组间比较差异均无统计学意义(P＞005).②细胞增殖实验中,第2天各组间差异均无统计学意义(P＞0.05):第4、6天,B1、C1、D1组吸光度(A)值分别为0.598±0.020、0.582±0017、0.574±0.021及0.639±0.016、0.641±0.020、0.635±0.021,均高于对照组的0.548±0.021及0.605±0.019(P＜0.05);A1组A值分别为0.545±0.023及0.603±0.016,与对照组差异无统计学意义(P＞0.05).第8天,B1、C1组A值分别为0.629±0.012、0.631±0.014,高于对照组的0.606±0.031(P＜0.05),A1、D1组与对照组比较,差异无统计学意义(P＞005).③细胞Ⅰ型胶原前mRNA合成实验中,B2、C2、D2组Ⅰ型胶原前mRNA合成量高于对照组.结论 EMPs促进人正常皮肤成纤维细胞黏附、增殖及Ⅰ型胶原前mRNA合成,且EMPs在100μg/mL浓度时可发挥最大促进作用.     

重组人红细胞生成素治疗大鼠急性脊髓损伤的用药时间窗探讨

目的:探讨腹腔注射重组人红细胞生成素(rHuEPO)治疗大鼠急性脊髓损伤(ASCI)的用药时间窗.方法:采用显微血管夹夹伤雌性SD大鼠T10脊髓建立脊髓急性损伤模型,将造模成功后的40只大鼠随机分为A、B、C、D、E组,每组8只.A、B、C、D组分别于损伤后即刻、1h、3h和6h腹腔注射rHuEPO 50001U/kg,E组损伤后立即腹腔注射等量生理盐水,作为对照组.各组大鼠于术后1d、3d、5d、7d进行BBB运动学评分,并于术后3d、7d用TUNEL染色和caspase-3免疫组化染色法检测各组大鼠脊髓神经细胞凋亡情况.结果:术后1d、3d各组大鼠BBB评分无统计学差异(P>0.05);5d时A、B、C三组BBB评分均高于D、E两组(P<0.01),A、B、C 三组间与D、E组间无统计学差异(P>0.05);7d时D组BBB评分高于E组(P<0.01),但低于A、B、C三组(P<0.01),而A、B、C三组间无统计学差异(P>0.05).损伤后3d、7d,A～D组的TUNEL、caspase-3染色阳性细胞均高于E组,且损伤后7d时D组TUNEL染色阳性细胞数高于A、B、C三组(P<0.05),A、B、C三组间无统计学差异;损伤后3d.D组caspase-3染色细胞阳性率高于A、B、C三组(P<0.05),A、B、C三组间无统计学差异(P>0.05),损伤后7d,A～D组间无统计学差异(P>0.05).结论:大鼠ASCI后3h内给予rHuEPO可以显著改善运动功能恢复情况,并抑制伤后脊髓神经细胞凋亡现象的发生;伤后6h给药效果较差.     

具有开放孔结构的左旋聚乳酸/卵磷脂多孔支架的制备及成骨性能研究

目的探讨具有开放孔结构的左旋聚乳酸[poly(L-lactic acid),PLLA]/卵磷脂多孔支架的制备方法及成骨性能。方法采用热致相分离法制备含不同比例卵磷脂(0、5%、10%、20%、30%、40%、50%)的PLLA/卵磷脂多孔支架(分别对应为A、B、C、D、E、F、G组)。扫描电镜观察各支架表面形貌;广角X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)和差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)检测各支架结晶度;测量各组支架吸水率;采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测小鼠BMSCs在各支架表面的增殖情况;通过检测ALP活性观察小鼠BMSCs在各组支架上的成骨分化能力。最后使用SD大鼠颅骨缺损模型观察含不同比例卵磷脂的支架在动物体内的骨修复情况,采用Micro-CT对缺损处进行三维模型重建,并对缺损处的新生骨体积和骨矿物密度进行定量分析。结果扫描电镜观察示,卵磷脂会导致支架孔径略微缩小;当卵磷脂含量为50%时,支架表面会出现片状结构。广角XRD和DSC检测示,支架结晶度随卵磷脂含量的升高而逐渐降低。亲水性测试示,随着卵磷脂含量增加,支架的亲水性逐渐增强。CCK-8法检测示,随培养时间增加,BMSCs在各组支架上均有明显增殖;培养7 d时,C、D、E、F组吸光度(A)值显著高于A、B、G组(P0.05),C、D、E、F组间比较差异无统计学意义(P0.05)。成骨诱导14 d时,随卵磷脂含量增加,各组ALP活性出现了显著差异,D、E、F、G组ALP活性显著高于A、B、C组(P0.05)。大鼠颅骨缺损修复实验中,Micro-CT检测及新生骨体积和骨矿物密度结果均显示,含30%卵磷脂支架修复效果最佳。结论通过热致相分离法制备的PLLA/卵磷脂多孔支架的细胞相容性、成骨分化性能及骨修复能力显著强于单纯PLLA支架;卵磷脂含量适宜的PLLA/卵磷脂多孔支架有望作为骨组织工程支架材料。     

BMSCs条件培养基改善地塞米松对成骨细胞成骨功能抑制效应的研究

目的探讨BMSCs的旁分泌作用对地塞米松所致成骨细胞成骨功能抑制作用的影响。方法首先通过培养小鼠BMSCs 24 h制备无血清条件培养基备用。将小鼠MC3T3-E1细胞株复苏并传至第3代用于实验,分为4组:A组为对照组;B组于细胞中添加1μmol/L地塞米松;C组于细胞中按1∶1比例添加1μmol/L地塞米松和BMSCs条件培养基;D组仅添加BMSCs条件培养基。培养24 h后收集细胞测定ALP含量,Western blot测定细胞内RUNX2、骨钙素(Osteocalcin)蛋白表达,实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR)测定细胞内α1-Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ-α1,COL1A1)、RUNX2、ALP、Osteocalcin基因表达;21 d后行茜素红染色观察钙结节形成情况。结果培养24 h后,B、C、D组ALP含量均显著低于A组,B组低于C、D组(P0.05),C、D组间差异无统计学意义(P0.05)。Western blot检测示,B组RUNX2蛋白相对表达量显著低于A、C、D组(P0.05),A、C、D组间比较差异无统计学意义(P0.05);B组Osteocalcin蛋白相对表达量均显著低于A、C、D组,A、C组低于D组(P0.05),A、C组间差异无统计学意义(P0.05)。RT-q PCR检测示,B、C、D组RUNX2、Osteocalcin、COL1A1、ALP基因相对表达量均显著低于A组(P0.05);D组RUNX2、Osteocalcin、ALP基因相对表达量均显著高于B、C组,C组显著高于B组(P0.05);D组COL1A1基因相对表达量显著高于B组(P0.05),B、C组间及C、D组间比较差异均无统计学意义(P0.05)。培养6 d时A组细胞死亡;21 d时B、C、D组均可见钙结节阳性染色,且逐渐增强。结论小鼠BMSCs条件培养基能改善地塞米松对成骨细胞成骨功能的抑制效应。     

膝关节置换术后不同镇痛方案的疗效评价

[目的]比较膝关节置换术后四种不同的多模式镇痛方案的疗效。[方法]选取2011年9月²013年3月行单侧全膝关节置换患者80例,随机分为4组,每组20例。A组:术后予连续股神经阻滞(CFNB)+术中关节周围浸润镇痛(LIA)+持续冰疗(CCT)镇痛;B组:术后予CFNB+LIA;C组:术后予CFNB+CCT;D组:术后仅予CFNB。采用视觉模拟量表(VAS)评估患者术后6、12、24、48、72 h静息时及术后24、48、72 h活动时的疼痛情况,并记录术后6、12、24、48、72 h各组患肢股四头肌肌力水平,以及术后22013年3月行单侧全膝关节置换患者80例,随机分为4组,每组20例。A组:术后予连续股神经阻滞(CFNB)+术中关节周围浸润镇痛(LIA)+持续冰疗(CCT)镇痛;B组:术后予CFNB+LIA;C组:术后予CFNB+CCT;D组:术后仅予CFNB。采用视觉模拟量表(VAS)评估患者术后6、12、24、48、72 h静息时及术后24、48、72 h活动时的疼痛情况,并记录术后6、12、24、48、72 h各组患肢股四头肌肌力水平,以及术后2⁷ d时患膝关节主动及被动屈伸活动度;监测术后恶心、呕吐、头晕等药物不良反应及伤口并发症情况。[结果]术后6、12、24、48 h,A、B组静息VAS评分均低于C、D组(P<0.05),C组低于D组(P<0.05),术后72 h,四组静息VAS评分没有统计学差异(P>0.05);术后24、48、72 h,A、B组活动VAS评分均低于C、D组(P<0.05),C组低于D组(P<0.05)。术后各组患肢股四头肌肌力水平无统计学差异(P>0.05);术后27 d时患膝关节主动及被动屈伸活动度;监测术后恶心、呕吐、头晕等药物不良反应及伤口并发症情况。[结果]术后6、12、24、48 h,A、B组静息VAS评分均低于C、D组(P<0.05),C组低于D组(P<0.05),术后72 h,四组静息VAS评分没有统计学差异(P>0.05);术后24、48、72 h,A、B组活动VAS评分均低于C、D组(P<0.05),C组低于D组(P<0.05)。术后各组患肢股四头肌肌力水平无统计学差异(P>0.05);术后2⁵ d,A组、B组的主动活动度均>C组、D组(P<0.05),C组>D组(P<0.05),术后65 d,A组、B组的主动活动度均>C组、D组(P<0.05),C组>D组(P<0.05),术后6⁷ d四组没有统计学差异(P>0.05);术后27 d四组没有统计学差异(P>0.05);术后2⁴ d,A、B组被动活动度>C、D组(P<0.05),C组>D组(P<0.05),术后54 d,A、B组被动活动度>C、D组(P<0.05),C组>D组(P<0.05),术后5⁷ d四组被动活动度没有统计学差异(P>0.05);术后A、B组之间的差异均无统计学意义;术后四组不良反应事件差异无统计学意义(P>0.05)。[结论]连续股神经阻滞联合关节局部浸润镇痛效果良好,有利于TKA术后的早期康复锻炼,其疗效与CFNB+LIA+CCT无统计学差异,值得进一步临床推广。