表达HIV Vpr细胞株的建立及其促细胞凋亡作用的研究

目的 建立稳定表达人免疫缺陷病毒(HIV)Vpr蛋白的细胞株,观察Vpr蛋白促进感染细胞凋亡的特性,以及Vpr变异后对其致凋亡作用的影响.方法 以携带野生株HIV Vpr基因和突变株HIV vpr-FS基因的质粒分别转染HeLa细胞,建立稳定表达HIV Vpr蛋白的细胞株,以流式细胞仪和细胞内DNA片段分析法检测细胞凋亡效果,观察Vpr蛋白促细胞凋亡的特性,以及两者致凋亡作用的区别.结果 重组质粒pcDNA3.1-vpr和pcDNA3.1-vpr-FS经酶切后均可获得342bp产物,DNA测序结果与目的 基因已知序列完全一致;上述质粒转染的HeLa细胞,RT-PCR检测到目的 基因vpr或vpr-FS的表达,Western blot检测到明显Vpr或Vpr-FS蛋白的表达.流式细胞仪和细胞内DNA片段分析法分别检测细胞凋亡,显示野生株HeLa pcDNA3.1-vpr组的凋亡率明显高于对照组,而变异株HeLa pcDNA3.1-vpr-FS的凋亡率与对照组无明显差别.结论 成功建立了表达HIV Vpr和HIVVpr-FS蛋白的感染细胞株.实验显示HIV Vpr蛋白能促进感染细胞的凋亡,而Vpr蛋白的变异可能使其促进细胞凋亡作用减弱.实验结果为下一步研究提供了基础资料.     

mTSARG3真核表达载体的构建及其稳定转染细胞系的建立

目的:构建小鼠mTSARG3基因真核表达载体,转染小鼠精原细胞系GC-1,建立稳定转染mTSARG3的GC-1细胞系,利用流式细胞技术(FCM)进行初步功能研究。方法:应用RT-PCR从小鼠睾丸cDNA文库中扩增mTSARG3的开放阅读框(ORF),并将PCR产物插入到pGEM-TEasy载体中测序验证。随后,经NotI和Hind III酶切后将目的片段进一步克隆到pcDNA3.1 Hygro(-)真核表达载体中。将经过测序验证的pcDNA3.1 Hygro(-)/mTSARG3表达质粒转染GC-1细胞,通过潮霉素筛选建立mTSARG3稳定转染的GC-1细胞系。RT-PCR和Western blot检测mTSARG3在稳定转染的GC-1细胞系中的表达;FCM观察转染pcDNA3.1 Hygro(-)/mTSARG3重组质粒)对GC-1细胞周期和凋亡的影响。结果:成功构建了pcDNA3.1 Hygro(-)/mTSARG3表达质粒,建立了稳定转染的GC-1细胞系。RT-PCR和Western blot检测结果发现,mT-SARG3在GC-1细胞系中成功表达。进一步通过FCM检测分析发现,转染mTSARG3可促进GC-1细胞增殖,抑制细胞凋亡。结论:mTSARG3真核表达载体的成功构建和稳定转染重组质粒GC-1细胞系的建立为进一步体外研究mTSARG3的功能奠定了基础。     

GRIM-19基因的克隆及其对小鼠前列腺癌细胞株的促凋亡作用

目的构建GRIM-19基因真核表达质粒,探讨GRIM-19基因转染对小鼠前列腺癌rm-1细胞的促凋亡作用。方法采用RT-PCR及重组DNA技术构建pcDNA-GRIM-19真核表达质粒,体外进行基因转染。形态学观察,DNAladder检测转染后rm-1细胞凋亡,RT-PCR方法检测rm-1细胞caspase-3活性。结果扩增出GRIM-19cDNA全长,测序结果与GenBank记载基本一致。转染rm-1细胞48h后证明其能在真核细胞表达,形态学及共聚焦显微镜观察到pcDNA3.1-GRIM-19重组质粒组出现明显的细胞凋亡,并出现典型的DNAladder。转染pcDNA3.1-GRIM-19重组质粒组caspase-3表达强度较对照组及空质粒组明显上调(P<0.05)。结论成功克隆并构建鼠GRIM-19基因真核表达载体pcDNA3.1-GRIM-19,该载体可诱导鼠rm-1细胞凋亡。其凋亡机制与caspase-3酶活性有关。     

Polo-like激酶1反义RNA对肺癌细胞A549生长的实验研究

目的:探讨Polo-like激酶1(Plk1)基因表达下调对肺癌细胞周期分布及其生长的影响。方法:培养肺腺癌细胞株A549,构建表达Plk1反义RNA的质粒pcDNA3-Plk1,通过脂质体介导转染A549细胞,采用RT-PCR和Western blotting的方法检测Plk1基因的表达,细胞计数、BrdU脉冲标记检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞周期变化和凋亡,MTT法检测长春瑞宾(NVB)对各组细胞的生长抑制率。结果:A549细胞转染pcDNA3-Plk1后24h,Plk1mRNA及蛋白表达均下降;细胞变圆、漂浮、增殖减慢;S期细胞百分数(BrdU标记指数)显著低于对照组(P<0.05);转染后48hA549细胞出现G2/M期阻滞(P<0.05)并发生凋亡;等浓度化疗药物诺维本对转染pcDNA3-Plk1细胞的抑制率明显高于各对照组(P<0.05),转染pcDNA3与未转染的对照细胞差异无显著(P>0.05)。结论:pcDNA3-Plk1的转染能下调Plk1基因的表达,抑制A549细胞增殖,诱导凋亡,并能增加A549细胞对化疗药物的敏感性。     

Pax-8 基因真核表达载体的构建及其功能的初步研究

目的: 构建大鼠 Pax-8 基因全长序列的真核表达载体pcDNA3.1(+),并将重组质粒转染至心肌细胞系H9c2中进行表达,测定转染后 Pax-8 基因对心肌细胞增殖及凋亡的影响。方法: 酶切pCMV sport6- Pax-8 获得大鼠 Pax-8 全长基因,通过基因重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-Pax-8。限制性酶切鉴定和DNA测序鉴定插入片段。将重组质粒经脂质体法转染至大鼠心肌细胞系H9c2细胞中,RT-PCR法及Western blotting法分别检测转染后Pax-8 mRNA及蛋白表达水平。CCK-8法检测细胞增殖;以血清饥饿诱导心肌细胞凋亡,同时进行 Pax-8 质粒转染,流式细胞仪检测细胞凋亡指数,Western blotting法检测活化caspase-3的表达。结果: 成功构建了大鼠pcDNA3.1(+)-Pax-8真核表达载体,且证实转染后心肌细胞的 Pax-8 mRNA 及蛋白表达均明显高于空白对照组(P<0.05)及空质粒组(P<0.05)。转染 Pax-8 基因能提高心肌细胞的增殖能力(P<0.05),明显抑制血清饥饿引起的细胞凋亡(P<0.01),同时下调活化caspase-3的表达(P<0.01)。结论: 通过基因重组技术成功使得 Pax-8 基因在心肌细胞中过表达。 Pax-8 基因可能通过促进心肌细胞增殖及抑制心肌细胞凋亡从而参与胚胎心脏发育的过程。     

LKB1基因转染对人肺腺癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨外源性LKB1基因表达对人肺腺癌细胞生物学行为的影响。方法:应用巢式PCR方法扩增LKB1基因编码区,利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA-LKB1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别导入A549细胞,经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆,Western blot检测LKB1和STAT3在A549细胞中的表达变化。通过绘制生长曲线和克隆形成试验检测获得性表达LKB1基因后肺癌细胞的增殖变化,流式细胞术(FCM)分析其细胞周期及其凋亡的变化。结果:成功获得了稳定表达外源性LKB1基因的A549细胞系,与转染空白载体组比较,转染LKB1基因的细胞生长速度明显减慢,细胞周期中G1/G0期比例明显增加,S期比例减少,细胞凋亡率升高;同时STAT3蛋白的磷酸化水平明显降低。结论:LKB1可能通过下调STAT3蛋白磷酸化水平的表达从而抑制A549细胞的恶性生物学行为。     

ING4基因的克隆及其诱导HeLa细胞凋亡的实验研究

 目的：分离小鼠ING4基因并构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4, 观察ING4基因转染人宫颈癌HeLa细胞后对细胞凋亡的影响。方法:应用RT-PCR技术从小鼠肝组织中扩增得到ING4cDNA。利用DNA重组技术构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4并用双酶切、PCR、基因测序进行鉴定,然后利用阳离子脂质体lipofectamine将其转染HeLa细胞，用RT-PCR检测ING4基因的表达情况，应用荧光显微镜（Hoechst33258染色）、激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪观察细胞凋亡情况。结果:RT-PCR产物为约 750 bp 的条带,构建的真核表达载体pcDNA3.0-ING4经双酶切、PCR鉴定均出现 750 bp 大小的条带，基因测序正确, Hoechst33258染色发现pcDNA3.0-ING4转染HeLa细胞的凋亡率（21.25%）明显高于对照组pcDNA3.0转染HeLa细胞的凋亡率（8.91%,P<0.01）。共聚焦显微镜也观察到了典型的细胞凋亡。细胞周期检测显示S期细胞所占百分数pcDNA3.0-ING4转染组高于pcDNA3.0转染组。结论:分离得到了小鼠ING4基因并成功构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4, 初步研究发现该基因转染HeLa细胞后可促使细胞凋亡。     

单羧酸转运蛋白基因过表达对MDA-MB-231乳腺癌细胞生物学行为的影响

目的研究单羧酸转运蛋白(MCT)基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡、细胞周期、侵袭和转移能力的影响。方法将真核表达质粒pcDNA3.1/MCT及空质粒pcDNA3.1分别转染乳腺癌MDA-MB-231细胞。采用实时定量PCR(qRTPCR)和Western blot法分别检测转染后细胞内MCT基因的表达。Annexin V-FITC/PI染色和PI单染色结合流式细胞术检测MCT基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡、细胞周期的影响,Transwell实验检测MCT基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响,划痕实验检测MCT基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的影响。结果实验组MCT的mRNA和蛋白水平明显高于转染空质粒的阴性对照组和未处理组;MCT过表达能促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡,G2期细胞减少、S期细胞增多,同时能抑制癌细胞的侵袭和迁移能力。结论 MCT基因过表达能促进MDA-MB-231细胞的凋亡、调节细胞G2/M期检控点,抑制细胞的侵袭和迁移能力。     

自噬基因Beclin 1 shRNA表达质粒的构建及其下调凋亡因子caspase-9效应的研究

构建自噬基因Beclin 1的小发夹RNA(shRNA)真核表达质粒,脂质体包裹后体外转染人宫颈癌HeLa细胞株,通过荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot检测其对HeLa细胞自噬基因Beclin 1 mRNA及蛋白表达的影响,并检测细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡情况以及凋亡因子caspase-9 mRNA及蛋白表达的变化。结果表明shRNA真核表达载体可以使HeLa细胞中自噬基因Beclin 1的mRNA及其蛋白含量降低,转染后细胞生长增殖速度加快,凋亡率降低,并伴有caspase-9 mRNA及蛋白量的显著下调。因此,Beclin 1不仅与自噬调控通路有关,而且可以调控凋亡的发生,同时参与两种程序性细胞死亡的过程。     

miR-145在转染的HeLa细胞中的表达及其对CDK6的靶向抑制

目的构建miR-145高效表达载体,研究其对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法人工合成miR-145基因序列,构建真核重组质粒pcDNATM6.2-GW-miR-145,并转染HeLa细胞,将HeLa细胞分为转染miR-145组、空载体组和未经处理的HeLa细胞组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot法分别检测miR-145及其下游靶基因细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)在各组中的表达,采用MTT法检测miR-145对HeLa细胞增殖活性的影响。结果经测序和qRT-PCR分析鉴定证明重组质粒pcDNATM6.2-GW-miR-145构建成功,qRT-PCR和Western blot结果显示转染miR-145组的HeLa细胞中CDK6的表达水平明显降低,MTT试验结果显示转染miR-145的HeLa细胞其增殖活性明显受到抑制(P0.05)。结论成功构建miR-145真核表达载体pcDNATM6.2-GW-miR-145,miR-145能够抑制宫颈癌HeLa细胞中CDK6的表达。     

高表达p27基因对子宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

目的构建抑癌基因p27高表达细胞株,研究其对子宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法运用RT-PCR技术从HeLaRNA中扩增p27 cDNA,连接酶连接至真核表达载体pcDNA3.1(+),所得的重组质粒pcDNA3.1(+)-p27用脂质体法转染子宫颈癌HeLa细胞,使用RT-PCR以及Western blot法筛选p27基因高表达的细胞株。MTT法和流式细胞术检测p27基因高表达对细胞增殖的影响。结果成功获得p27高表达的HeLa细胞株。细胞增殖分析和流式细胞术结果显示,p27基因高表达对细胞增殖有抑制作用,并明显增加G1期的细胞数(由44.4%增加到59%,P<0.05)。结论 p27基因在HeLa细胞中高表达能通过抑制细胞G1/S转换从而抑制细胞增殖,提示p27基因可能成为子宫颈癌基因治疗的靶基因。     

Dlx2基因过表达与前成骨细胞系MC3T3-E1成骨分化过程中的细胞凋亡和周期调控*****◆

背景：Dlx2基因在颅神经嵴细胞迁徙进入第一鳃弓过程和颅颌面骨骼发育中起重要作用,但Dlx2基因对成骨细胞分化过程中细胞凋亡和细胞周期调控的影响尚未见报道。 目的：观察Dlx2基因过表达对前成骨细胞系MC3T3-E1成骨分化过程中细胞凋亡和细胞周期调控的影响。 方法：构建反转录病毒pMSCV-puro-Dlx2并转染矿化诱导液培养下的MC3T3-E1细胞,构建稳定过表达Dlx2基因的细胞系MC3T3-E1-Dlx2。RT-PCR和Western blot验证Dlx2基因过表达细胞系的建立。Annexin V/PI双染色后流式细胞分选检测细胞凋亡,PI/RNase双染色后流式细胞分选检测细胞周期变化。 结果与结论：实验成功构建稳定过表达Dlx2基因的细胞系MC3T3-E1-Dlx2。发现Dlx2基因过表达促进细胞凋亡(P < 0.05),同时阻滞细胞周期于G1/G0期(P < 0.05),减低细胞增殖性,促进细胞分化行使功能。 关键词：成骨细胞分化;Dlx2基因;稳定过表达;细胞凋亡;细胞周期 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.022     

ING4基因真核表达载体的构建及其功能

目的：构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,观察ING4基因对人肝癌SMMC7721细胞周期及凋亡的影响。方法：小鼠肝组织经RT-PCR扩增,构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,分别用双酶切、PCR、基因测序进行鉴定,将其转导进入人肝癌SMMC7721细胞,检测ING4基因的表达情况及其对细胞周期的影响,应用荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况。结果：RT-PCR产物为约750bp的条带,基因测序正确,转导进入人肝癌细胞株SMMC7721后可延长G2期,其凋亡率（23.66％）明显高于对照组（13.75％）。结论：成功分离得到了小鼠ING4基因并成功构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,该质粒转染人肝癌SMMC7721细胞后可延长G2期并可促使细胞凋亡。     

CHK1shRNA抑制HeLa细胞增殖并诱导其凋亡

目的：构建针对CHK(checkpoint kinase，细胞周期检测点激酶)1基因的短发夹状RNA（short hairpin RNA，shRNA），观察其对高表达〖STBX〗CHK1〖STBZ〗的宫颈癌细胞系-HeLa细胞凋亡和细胞周期的影响。方法：〖HTSS〗 设计并合成了针对CHK1的shRNA，将其导入本室构建的携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的RNAi（RNA interference，RNA干扰）表达载体中。通过 RT-PCR和Western blotting分别检测HeLa细胞CHK1基因和蛋白水平的表达，以流式细胞仪测细胞凋亡，MTT法检测细胞的增殖。结果：〖HTSS〗 成功构建了携带EGFP的RNAi表达载体pEGFP-H1。与对照组和空载体转染组相比, shRNA使细胞中〖STBX〗CHK1〖STBZ〗 mRNA水平下降了66％，蛋白水平下降了60％。此外，shRNA转染组的HeLa细胞凋亡率明显高于对照组，其增殖活性则明显低于对照组。结论：〖HTSS〗 本课题构建的RNAi表达载体便于观察靶基因的转染情况，且不影响H1启动子的体内转录。CHK1shRNA能诱导HeLa细胞凋亡，抑制该细胞的增殖，为进一步研究〖STBX〗CHK1〖STBZ〗在肿瘤治疗中的作用机制提供了实验基础。     

Presenilin Overexpression Arrests Cells in the G1 Phase of the Cell Cycle : Arrest Potentiated by the Alzheimer’s Disease PS2(N141I) Mutant

To investigate the mechanism by which presenilin (PS) overexpression induces apoptosis, we studied the effects of these proteins on cell cycle progression. Transiently transfected HeLa cells were bromodeoxyuridine (BrdU) labeled to visualize DNA synthesis by immunofluorescence and stained with propidium iodide to measure DNA content by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BrdU labeling was decreased in cells expressing presenilin-1 (PS1), presenilin-2 (PS2), an Alzheimer's disease-associated missense mutation PS2(N141I), and the carboxyl-terminally deleted PS2 construct PS2(166aa), compared with mock and neurofilament-light (NF-L) transfected cells. Analysis of BrdU incorporation in mitotically synchronized HeLa cells suggested that cells were arresting in the G1 phase of the cell cycle, and this was confirmed by FACS analysis. Interestingly, cell cycle progression was more inhibited by the expression of PS2(N141I) compared with wild-type PS2. In addition, ATM, the gene product mutated in ataxia-telangiectasia, does not appear to be a downstream effector of PS-induced cell cycle arrest as transfection of PS constructs into an ataxia-telangiectasia cell line also resulted in cell cycle inhibition. Quantitative immunoblotting of whole-cell lysates from PS-transfected cells did not reveal increases or decreases in the steady-state levels of p21, p27, p53, pRb, or c-myc, suggesting that the presenilins mediate cell cycle arrest by mechanisms other than simple changes in the steady-state levels of these cell-cycle-related proteins.     

CRT-E2-EGFP表达、胞内定位及其对B16细胞凋亡的影响

目的:观察CRT-E2融合蛋白在小鼠黑色素瘤B16细胞中的表达及其定位,并探讨CRT引起的E2蛋白表达定位改变对B16细胞增殖及调亡的影响.方法:构建荧光真核表达载体pEGFP-CRT、pEGFP-E2、pEGFP-CRT-E2,将上述载体以及空载体pEGFP-C1经脂质体瞬时转染B16细胞,West-em blot分析确认目的蛋白表达.荧光显微镜下观察CRT-E2融合蛋白在细胞中表达定位;流式细胞术检测不同重组表达载体转染B16细胞24 h、48 h后,对细胞周期的影响和诱导凋亡的情况.结果:CRT-E2融合蛋白在B16细胞中正确表达,主要分布于细胞质,能将细胞阻滞于G1期,有效诱导肿瘤细胞发生凋亡(P<0.01).结论:成功构建CRT-E2真核表达载体,外源性CRT能够引起E2蛋白表达定位于细胞质,并明显促进了肿瘤细胞的调亡.     

Familial Alzheimer's disease presenilin-1 mutants potentiate cell cycle arrest

We previously reported that overexpression of presenilin 1 and 2 (PS1 and PS2) in HeLa cells leads to cell cycle arrest, and that the PS2(N141I) FAD mutant potentiates cell cycle arrest compared to wild-type PS2. Using similar BrdU incorporation studies we now report that three different PS1 FAD mutants also increase cell cycle arrest compared to wild-type PS1when overexpressed in either HeLa cells or an ATM deficient cell line. We detected reproducible differences in the degrees to which these FAD mutants induced arrest. PS1(P117L) reduced BrdU incorporation the most (13 to 14%) followed by PS1(P267S) (7.5 to 9%), with the PS1(E280A) mutant inhibiting BrdU incorporation the least (6 to 7%), compared to wild-type PS1. The degree to which the different mutants inhibited cell cycle progression correlates somewhat with the age of AD onset induced by the mutations in carriers. Immunoblot analysis of protein extracts from presenilin-overexpressing cells indicates that the cell cycle-regulated cytoplasmic pool of β-catenin is dramatically reduced, whereas the insoluble β-catenin pool remains essentially unaffected. We discuss the implications of these findings in relationship to cell cycle arrest, apoptosis and AD.