酵母双杂交技术筛选与克隆白细胞中与NS5ATP7蛋白结合的蛋白编码基因

目的 应用酵母双杂交体系寻找与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A反式激活蛋白7(human gene 5 transactivated by nonstructural protein 5A of hepatitis C virus,NS5ATP7)相互作用的白细胞蛋白,以探讨SN5ATP7的生物功能。方法 应用酵母双杂交系统3,构建NS5ATP7诱饵质粒,转化酵母AH109,与含人白细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合,于涂有X-α-gal营养缺陷型培养基(SD／-Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长。挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌提取质粒。DNA后进行测序,然后进行生物信息学分析。结果 筛选出15个与NS5ATP7特异性相互作用的克隆,其中包括人类RhoGDF分裂抑制剂α、人类细胞色素b558a亚单位、人类MLL(MLL)基因外显子、人类S100钙结合蛋白A9(钙粒蛋白B)、人类移动抑制因子相关蛋白14变体E(S100A9)、人类金属硫蛋白2A、人类染色体序列及人类cDNA序列等,1个是未知功能基因。结论 初步克隆了NSSATP7与白细胞结合蛋白基因,根据所克隆到的基因,对以后研究NS5ATP7的功能有一定的提示作用;为以后研究这些能与NS5ATP7相互作用的基因在白细胞中的生理功能奠定了基础。     

酵母双杂交技术筛选人白细胞cDNA文库中HCV NS4B结合蛋白

目的筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白4B（HCV NS4B）在人白细胞eDNA文库中的相互作用蛋白。方法应用酵母双杂交技术筛选人白细胞文库中与HCV NS4B相互作用的蛋白,对筛选结果中目的蛋白的编码基因进行克隆,并构建其酵母表达载体,在酵母细胞中进行回交验证。结果共筛选出人白细胞eDNA文库中与能够与HCV NS4B相互作用的蛋白5种（溶菌酶前体、推测的人翻译起始因子、人选择素P配体、人HC7371基因和TNF—alpha转换酶）以及一个未知功能基因。对新基因成功克隆,在酵母细胞中回交验证了HCVNS4B与该基因的相互作用。结论在人白细胞cDNA文库中存在一些能够与HCV NS4B相互作用的蛋白,它们均与细胞的生长和代谢状态有着密切的关系,其具体作用机制尚有待进一步研究。     

酵母双杂交技术筛选肝细胞中与羧基末端截短型乙型肝炎表面抗原中蛋白MHBst167蛋白结合蛋白的研究

目的应用酵母双杂交技术筛选人肝细胞cDNA文库中与羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白（MHBs^t167）具有相互作用的肝细胞蛋白，以探讨MHBs^t167可能的生物学功能。方法用多聚酶链反应（PCR）法扩增MHBs^t167研基因，应用酵母双杂交系统3，连接人酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒，转染酵母细胞AH109并在其内表达，然后与转染了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合，于涂有X-α-gal营养缺陷型培养基（SD／-Trp-Leu-His-Ade）上进行双重筛选阳性菌落。挑选阳性克隆，提取此酵母克隆的质粒转化DH5a大肠杆菌并经氨苄青霉素抗性筛选，提取单克隆菌落质粒DNA，酶切鉴定后进行测序，然后进行生物信息学分析。结果成功构建MHBs^t167酵母表达载体pGBKT7-MHBs^t167.筛选出阳性菌落28个，经生物信息学分析，最后从肝细胞cDNA文库中筛选出7个与MHBs^t167特异性结合作用的克隆。其中包括人类核糖基化因子1、胎儿肝全长cDNA克隆、人类醛缩酶B果糖二磷酸（ALDOB）、补体3（C3）、人类血清扩散因子（生长调节素B）、人类BAC（细菌人工染色体）克隆GSI一306C12。结论成功克隆出MHBs^t167基因并在酵母细胞中表达，应用酵母双杂交技术筛选出7个能与MHBs^t167蛋白相互作用的肝细胞结合蛋白基因，根据所克隆到的基因，对以后研究MHBs^t167的生物学功能及乙型肝炎病毒致癌的分子生物学机制奠定了理论基础。     

酵母双杂交技术筛选乙型肝炎e抗原反式激活蛋白结合蛋白的基因

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与乙型肝炎e抗原反式激活蛋白(HBeAgTP)相互作用蛋白的基因。方法应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆HBeAg反式激活的新型靶基因HBeAgTP。用聚合酶链反应(PCR)法扩增HBeAgTP基因,连接人酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α gal)上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出目的片段并测序,进行生物信息学分析。结果成功克隆出HBeAgTP基因并在酵母细胞中表达,应用酵母双杂交筛选出阳性菌落24个,经生物信息学分析为15种已知基因。结论成功克隆出HBeAgTP的结合蛋白,包括一些与细胞内蛋白质的转录、翻译、免疫调节及物贡和能量代谢相关的基因。     

酵母双杂交技术筛选研究乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP结合蛋白

目的筛选与乙型肝炎病毒 DNA 聚合酶-N末端蛋白(TP)相互结合的肝细胞蛋白,进一步探讨 TP 的生物学功能。方法酵母双杂交相关实验材料购自美国 Clontech公司,其中 pACT2为人肝配合表达的 cDNA 文库(HumanLiver MATCHMAKER cDNA Library),产品号为 HL4024AH。pGBKT7-53和 pGADT7-T 中的 p53和大 T 抗原在酵母双杂交试验中相互作用,为阳性对照,pGBKT7-Lam 中的 Lamin C既不与其他蛋白形成复合物又不与大多数蛋白发生反应,为阴性对照。含有 AF384372 HBV DNA P 全基因组 cDNA 的质粒 G318A7由解放军第三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心合成并保存。TP 基因的上下游引物序列分别为:5′-GAA TTC ATG ATG CCC CTA TCT TAT CAA-3′,5′-GGA TCCTFA CTC TTG TTC CCA AGA ATA-3′,下划线部分为引物两端内切酶 EcoRI 和 BamHI 的酶切位点。引物合成及 DNA 测序由上海博亚公司完成。用聚合酶链反应(PCR)技术扩增 TP片段,连接人酵母表达载体 pGBKT7中构建诱饵质粒,用醋酸锂法转入酵母细胞 AH109并在其内表达,挑取在 SD/-Trp 培养基上的转化子-即 pGBKT7-TP(AH109)(计数大于1×10~9个细胞/ml),与转化了人肝 cDNA 文库质粒 pACT2的酵母细胞 Y187配合,生长6～18 d 后把长出的>2 mm 的酵母集落,在铺有 X-α-gal 的 QDO 培养基上检查α-gal 活性,蓝色菌落为真阳性集落。挑取阳性集落提取酵母质粒,以复杂冰冻高效感受态方法转化大肠埃希菌,于含有氨苄西林的 SOB 平板培养,所获得的菌落酶切鉴定后测序。提交 GenBank 分析。结果成功得到47个与 TP 特异性结合的阳性克隆,28个克隆与已知基因的部分序列高度同源(96%～100%),含21种目的基因,其余19个克隆基因为假设蛋白(hypothetical pro-tein)。筛选出的目的基因包括有:固醇调节元件结合蛋白1;UDP 糖基转移酶1家族多肽 A9;CD14抗原;B 糖蛋白血液结合素;Ⅰ类乙醇脱氢酶γ多肽;WW 域结合蛋白2;醛脱氢酶1;延伸因子2;S 蛋白基因;补体成分8,α多肽(C8A);唾液酸糖蛋白受体2,转录变异体3;肉毒碱酰基转移酶,转录变异体3;血浆铜蓝蛋白(CP);β激活素 E 亚基;Z 蛋白依赖性蛋白酶抑制剂前体;前列腺特异性膜抗原基因;11号染色体,克隆 RP11-107P7;RNA 聚合酶Ⅱ亚单位 hsRPB7 mRNA;跨膜蛋白4超家族成员2;跨膜蛋白14 A;铁蛋白 L 链。19个假设蛋白的同源性在97%～100%。结论 TP 蛋白可以与肝细胞内某些已知和未知功能蛋白相互结合,提示其具有较广泛的生物学功能。     

酵母双杂交技术筛选α干扰素结合蛋白的基因

目的 筛选人肝细胞cDNA文库中与α干扰素（IFNα）蛋白具有相互作用的蛋白基因。方法 用聚合酶链反应（PCR）扩增IFNα基因，连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒，转染酵母细胞AH109，Western blot证明IFNα蛋白能够在AH109中表达。然后将AH109与转染了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合，在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖（X-α-gal）上进行双重筛选阳性菌落，提取质粒后转化DH5α大肠埃希菌并经氨苄西林抗性筛选，提取单克隆菌落质粒，酶切答定正确者进行测序，再行生物信息学分析。结果 成功克隆化IFNα基因并在酵母细胞中表达，应用酵母双杂交筛选出阳性菌落34个，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到8种已知基因：玻璃体连接蛋白、纤维蛋白原α多肽、人类免疫缺陷病毒（HIV）1Tat相互作用蛋白2、精氨酸酶、NADH脱氢酶1β亚复合物、转铁蛋白受体2α、酒精脱氢酶IBβ多肽、肝细胞癌蛋白（HCC-1）；2种染色体基因：人染色体17，克隆RP11-35083，人染色体10，克隆RP11-35101。结论 成功克隆出IFNα基因，并从肝细胞cDNA文库中筛选出8种能与IFNα具有结合作用的蛋白基因。