人乳腺癌细胞MCF-7紫杉醇耐药株的建立及其生物学特性研究

目的建立紫杉醇(Taxol)的人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Taxol,并初步研究其生物学特性。方法采用低浓度加量持续诱导法建立MCF-7/Taxol;细胞模型的多药耐药性以SRB法检测;流式细胞术分析细胞周期分布;免疫组化法检测细胞表型变化;高效液相鉴定细胞中药物蓄积;光镜和电子扫描显微镜观察细胞形态。结果SRB法检测,MCF-7/Taxol细胞的紫杉醇半数抑制浓度(IC50)是亲代MCF-7细胞的525倍,撤药3mon后细胞的耐药指数保持在150倍以上,并对羟喜树碱、表柔比星、多柔比星、米托蒽醌、硫酸长春新碱、博来霉素和丝裂霉素等多种化疗药物产生交叉耐药性。MCF-7/Taxol细胞分化程度低于同步传代的MCF-7细胞,倍增时间明显高于亲本细胞,S期细胞明显增加,G1期细胞减少;随撤药时间的延长,细胞的增殖速度加快。MCF-7/Taxol细胞P-gp、LRP和GSTπ的表达水平较亲本细胞有明显增加,ER、PR阳性表达丢失;光镜下MCF-7/Taxol细胞明显变大并且形态不规则;电镜下其表面纤绒毛成小球状隆起和絮状突起;在稳定生长的耐药细胞和撤药培养的细胞中都有Taxol蓄积。结论该MCF-7/Taxol模型具有多药耐药细胞的基本生物学特性,可用于肿瘤多药耐药机制药的研究,推测耐药细胞株中含有天然MCF-7肿瘤干细胞。     

RNA干扰对乳腺癌细胞株MCF-7/Adr多药耐药性的逆转

目的研究小分子干扰RNA对乳腺癌耐药细胞株MCF7/Adr多药耐药性的逆转作用。方法设计针对mdrl基因的SiRNA,转染进MCF-7/Adr细胞;用荧光定量PCR检测mdrlmRNA的表达,流式细胞仪分析Pgp表达,MTT法检测阿霉素对MCF-7/Adr细胞的半数抑制浓度(IC50)。结果该SiRNA能使耐药细胞株MCF-7/Adr的mdrlmRNA和Pgp表达水平分别显著下调(P<0.01),并使阿霉素对MCF7/Adr的IC50显著降低(P<0.01)。结论RNA干扰可逆转乳腺癌MCF7/Adr细胞株的多药耐药性。     

人乳腺癌耐药细胞株中GCS表达及其与P-gp的关系

目的 探讨葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)在人乳腺癌细胞多药耐药中的作用及其与p-糖蛋白(P-gp)的关系.方法 采用MTT法检测阿霉素对人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adr和敏感株MCF-7的抑制率和半数抑制浓度(IC50);用浓度为5、10和20μmol/L的GCS抑制剂(PDMP)预处理MCF-7/ADR 24 h和48 h后检测IC50;用流式细胞检测术检测MCF-7及PDMP预处理MCF-7/ADR 前后GCS蛋白、P-gp的表达和细胞中ADM的荧光强度,结果MCF-7/Adr对MCF-7的耐药倍数为22.69倍,PDMP作用后阿霉素对MCF-7/Adr的抑制率升高.IC50下降(P<0.05);MCF-7/Adr 中 GCS和P-gp的表达均高于MCF-7;PDMP使MCF-7/Adr中GCS表达下降(P<0.05),对P-gp表达无明显影响(P>0.05).PDMP可使阿霉崇在MCF-7内潴留增多,结论GICS可能参与肿瘤耐约的发生过程,并在MCF-7/Adr多药耐药中起重要作用;PDMP能影响P-gp功能,GCS与 P-gp有一定关系.     

功劳木中异汉防己碱对P-糖蛋白介导的人乳腺癌细胞多药耐药性的逆转作用

本文探讨了异汉防己碱对P-糖蛋白(P-gp)介导的人乳腺癌细胞多药耐药性的逆转作用。首先以RT-PCR和免疫组化方法分别从RNA和蛋白水平检测MCF-7/DOX细胞P-gp表达情况，以明确MCF-7/DOX细胞的耐药特征；然后采用MTT法检测异汉防己碱的内在细胞毒性及其对阿霉素(DOX)的增敏作用，并以RF(reversal fold)值评价其逆转效果；同时应用流式细胞仪(FCM)对细胞内DOX的蓄积量进行了分析；再以免疫组化方法检测异汉防己碱对MCF-7/DOX细胞P-gp表达水平的影响；最后采用罗丹明蓄积和外排试验检测了异汉防己碱对P-gp功能的影响。整个试验以维拉帕米作为阳性对照。实验结果表明：MCF-7/DOX细胞是具有多药耐药表型且P-gp表达阳性的细胞株；无毒剂量异汉防己碱可明显增强DOX对MCF-7/DOX细胞的细胞毒性(RF=3.89)，明显高于维拉帕米(RF=2.54)的逆转活性(P<0.05)，但其几乎不影响DOX对MCF-7细胞的抑制作用；异汉防己碱对MCF-7/DOX细胞P-gp表达水平无明显影响，但其可有效抑制P-gp的药物外排功能。因此，异汉防己碱可有效逆转P-gp介导的人乳腺癌细胞的多药耐药性，它可能成为有效多药耐药逆转剂的候选药物。     

环氧化酶-2选择性抑制剂逆转MCF-7/ADR细胞多药耐药的实验研究

目的 研究环氧化酶-2(COX-2)选择性抑制剂Celecoxib对人乳腺癌细胞系MCF-7/ADR的多药耐药(MDR)逆转作用.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定Celecoxib对MCF-7/ADR细胞的无毒剂量,并检测在此剂量下的耐药细胞逆转倍数;荧光分光光度法测定Celecoxib对细胞内阿霉素(ADM)荧光强度的影响.结果 无毒剂量的Celecoxib(1×10-3 μmol/L)可显著降低ADM对MCF-7/ADR的半数抑制浓度(IC50),逆转耐药倍数为1.91倍.Celecoxib能够提高MDR细胞内ADM荧光强度.结论 Celecoxib具有逆转人乳腺癌MCF-7/ADR多药耐药性的作用,可能与增加MDR细胞内化疗药物聚集量有关.     

蛇床子素对耐阿霉素人乳腺癌细胞耐药的逆转作用

目的:研究蛇床子素(Ost)对人乳腺癌细胞阿霉素耐药株多药耐药(MDR)的逆转作用及其机制。方法:采用MTT比色法测定药物的细胞毒性,高效液相-紫外检测法检测细胞内ADR浓度。结果:Ost对MCF-7及MCF-7/ADR细胞均有增殖抑制作用,IC50值分别为(58.1±2.3)μmol.L-1和(59±5)μmol.L-1;在5~15μmol.L-1范围内,Ost可以不同程度地增强ADR对MCF-7细胞杀伤作用,与ADR联合用药降低ADR对MCF-7/ADR的IC50值,显著增加MCF-7/ADR细胞内ADR的积累。结论:Ost对人乳腺癌细胞株MCF-7及其阿霉素耐药株MCF-7/ADR细胞均有增殖抑制作用,而且Ost通过明显增加MCF-7/ADR细胞内ADR的浓度,逆转其阿霉素耐药性。     

乳腺癌干细胞亚群比例的改变与芳香化酶抑制剂耐药的相关性

目的分析乳腺癌干细胞(BCSCs)亚群比例的改变与芳香化酶抑制剂(AIs)耐药之间的相关性。方法采用流式细胞术检测对AIs耐药的人源性乳腺癌细胞株MCF-7(MCF-7/AI)及野生型人源性乳腺癌细胞株MCF-7中CD44+CD24-细胞的数量,比较MCF-7/AI和MCF-7中CD44+CD24-细胞的比例。结果 MCF-7/AI和MCF-7中CD44+CD24-细胞的平均比例分别为(13.15±5.50)%和(0.39±0.22)%(P<0.05)。结论 MCF-7/AI中BCSCs亚群的比例显著高于MCF-7,提示AIs耐药和BCSCs之间可能存在着一定的相关性,BCSCs亚群比例的改变可能是AIs耐药的重要标志之一。     

三氧化二砷逆转乳腺癌细胞株MCF-7/ADM多药耐药的研究

目的探讨三氧化二砷(As2O3)体外逆转人乳腺癌细胞多药耐药性的作用及机制。方法采用MTT法检测As2O3的细胞毒作用和处理前后耐药细胞对化疗药物的敏感性,用流式细胞仪检测细胞内阿霉素浓度,通过RT-RCR检测MDR1基因的表达。结果 As2O3在0.25mg/L以下剂量时对MCF-7和MCF-7/ADM耐药细胞株的抑制率均小于15%,半数抑制率(IC50)分别为1.01m/L和1.28mg/L,无细胞毒剂量0.2mg/L的As2O3能部分逆转MCF-7/ADM细胞对阿霉素的耐药性。同时无细胞毒剂量0.2mg/L的As2O3能使MCF-7/ADM细胞内阿霉素浓度明显增加,MDR1表达下降。结论 As2O3具有体外部分逆转人乳腺癌细胞多药耐药性的作用,可能与增加细胞内药物积累、下调MDR1表达有关。     

钙调素拮抗剂O-(4-乙氧基)-丁基-小檗胺增强阿霉素杀伤MCF-7/ADR细胞的机制研究

目的研究钙调素拮抗剂0-4-乙氧基-丁基-小檗胺(EBB)增强阿霉素诱导乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/ADR细胞的杀伤作用及其相关机制。方法用MTT法测定阿霉素、EBB单独及联合用药对阿霉素杀伤乳腺癌多药耐药细胞系(MCF-7/ADR)及其亲代细胞系(MCF-7)的作用的IC50值,用不同浓度EBB处理MCF-7/ADR细胞后用FACS法分析EBB对阿霉素诱导细胞凋亡及对mdr1mRNA和P-gp蛋白水平表达的影响,通过激光共聚焦显微镜观察EBB处理前后及用EBB预处理24和48h后MCF-7/ADR和MCF-7细胞内阿霉素浓度的改变。结果MTT结果显示EBB对MCF-7和MCF-7/ADR都具有抗肿瘤活性;EBB还能协同提高阿霉素的细胞毒作用,MCF-7组两药相互作用指数(CDI)值为0.73,MCF-7/ADR组CDI值为0.49,其对耐药细胞的协同作用更为明显。随EBB剂量增加,低剂量阿霉素诱导MCF-7/ADR细胞凋亡增加而且P-gp蛋白表达水平逐渐下降,细胞内阿霉素浓度逐渐提高,而且用EBB预处理MCF-7/ADR细胞24和48h后细胞内阿霉素和罗丹明浓度也逐渐提高。结论EBB是有效的肿瘤细胞化疗药物,它不但能直接抑制P-gp功能还具有下调P-gp蛋白表达的作用,从而有效逆转MCF-7/ADR细胞的耐药现象,协同增强化疗药物对耐药细胞的杀伤作用。     

Correlation of the changes of proportion of breast cancer stem cells subgroup and the resistance of aromatases inhibitors

目的 分析乳腺癌干细胞(BCSCs)亚群比例的改变与芳香化酶抑制剂(AIs)耐药之间的相关性.方法 采用流式细胞术检测对AIs耐药的人源性乳腺癌细胞株MCF-7(MCF-7/AI)及野生型人源性乳腺癌细胞株MCF-7中CD44+ CD24-细胞的数量,比较MCF-7/AI和MCF-7中CD44+CD24-细胞的比例.结果 MCF-7/AI和MCF-7中CD44+ CD24-细胞的平均比例分别为( 13.15±5.50)％和(0.39±0.22)％(P＜0.05).结论 MCF-7/AI中BCSCs亚群的比例显著高于MCF-7,提示AIs耐药和BCSCs之间可能存在着一定的相关性,BCSCs亚群比例的改变可能是AIs耐药的重要标志之一.     

MTT方法测定培养细胞抗药水平的评价

用ＭＴＴ方法测定了多药抗药细胞ＭＣＦ－７Ａｄｒ及其敏感细胞ＭＣＦ－７ＷＴ对阿霉素、长春新碱、秋水仙碱的化学敏感性。ＭＣＦ－７Ａｄｒ与ＭＣＦ－７ＷＴ相比，对三种药物有明显的抗药性。维拉帕米可逆转ＭＣＦ－７Ａｄｒ对阿霉素的抗药性。随选择药物撤除时间的延长，ＭＣＦ－７Ａｄｒ的抗药水平逐渐下降。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交显示ＭＣＦ－７Ａｄｒ细胞有典型的ＭＤＲ１基因扩增现象。用ＭＴＴ方法测定Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３细胞对阿霉素、长春新碱、秋水仙碱的化学敏感性，同时测定时各亚克隆株间差异较小，而分批测定时，不同批次相差很大。结果说明，ＭＴＴ方法能有效地检测出抗药细胞株的相对抗性；并提示，应在同时用完全相同的条件进行杀伤试验与ＭＴＴ测试，以避免批次间差异。     

A microarray based expression profiling of paclitaxel and vincristine resistant MCF-7 cells

Resistance to the broad spectrum of chemotherapeutic agents in cancer cell lines and tumors has been called multiple drug resistance (MDR). In this study, the molecular mechanisms of resistance to two anticancer agents (paclitaxel and vincristine) in mammary carcinoma cell line MCF-7 were investigated. Drug resistant sublines to paclitaxel (MCF-7/Pac) and vincristine (MCF-7/Vinc) that were developed from sensitive MCF-7 cells (MCF-7/S) were used. cDNA microarray analysis was performed for the RNA samples of sensitive and resistant cells in duplicate experiments. GeneSpring GX 7.3.1 Software was used in data analysis. The results indicated that the upregulation of MDR1 gene is the dominating mechanism of the paclitaxel and vincristine drug resistance. Additionally the upregulation of the genes encoding the detoxifying enzymes (i.e. GSTP1) was observed. Significant downregulation of apoptotic genes (i.e. PDCD2/4/6/8) and upregulation of some cell cycle regulatory genes (CDKN2A, CCNA2 etc.) was seen which may be in close relation to MDR in breast cancer. Drug resistant cancer cells exhibit different gene expression patterns depending on drug treatment, and each drug resistance phenotype is probably genetically different. Further functional studies are needed to demonstrate the complete set of genes contributing to the drug resistance phenotype in breast cancer cells.     

Snail增强乳腺癌细胞MCF-7中P-gp介导的多药耐药

目的探讨乳腺癌细胞中Snail过表达与P-gp之间的关系,揭示EMT对乳腺癌细胞多药耐药的影响。方法构建Snail真核表达载体pCDNA3.1-Snail,将载体转染人乳腺癌细胞MCF-7后用阿霉素对细胞进行诱导。利用细胞毒性实验(MTT)、阿霉素外排实验对耐药细胞系的耐药状况进行评价;通过流式细胞术和Real-time PCR分别测量耐药细胞系中P-gp和MDR1 mRNA,Snail mRNA的表达。结果由细胞毒性实验和阿霉素外排实验的结果显示,MCF-7/Snail细胞经阿霉素诱导后相对耐药指数升高至109.2,细胞内荧光强度降至7.1(P<0.05);Real-time PCR显示相对于MCF-7,MCF-7/Snail细胞中的MDR1 mRNA,Snail mRNA的表达明显升高与流式细胞术显示的P-gp升高相一致。结论转染Snail真核表达载体后,MCF-7/Snail细胞的耐药性较MCF-7细胞明显升高。     

培美曲塞-磷脂偶联物修饰的靶向性舒尼替尼与长春瑞滨脂质体的研制及其在体外对耐药性乳腺癌的抑制效应

乳腺癌是女性最易罹患的疾病,而肿瘤多药耐药性通常是化疗失败的主要原因。本研究以培美曲塞（PMT）和DSPE-PEG2000-NH2为原料合成了新的靶向性偶联物DSPE—PEG2000．PMT,并将其修饰到脂质体表面,制备了同时包封有舒尼替尼与长春瑞滨的靶向性脂质体,以增强化疗药物对多药耐药性乳腺癌的治疗效果。经过质谱分析证实,合成的靶向性载体材料DSPE．PEG2000-PMT与目标产物相符。建立了可同时检测舒尼替尼和长春瑞滨含量的高效液相色谱分析方法,检测波长为215nm,柱温30℃,流动相为乙腈-0．05MKH2P04（pH3．5）-三乙胺（35：65：0．3,v／v／v）。舒尼替尼和长春瑞滨的最低检测浓度分别为25ng／mL和5ng／mL,最低定量浓度均为0．25μg／mL。两药在0．5-25．0μg／mL范围内线性良好。各脂质体包封率均大于90％,粒径均-（～90nm）,Zeta电位略显负电性。在体外耐药乳腺癌MCF-7／Adr细胞中评价了靶向性舒尼替尼与长春瑞滨脂质体的抗增殖效应。结果显示,同对照组相比,靶向性舒尼替尼与长春瑞滨脂质体对MCF-7／Adr细胞具有最强的抑制增殖效应。以靶向性香豆素脂质体为荧光探针,考察了靶向性脂质体在耐药乳腺癌MCF-7／Adr细胞中的靶向性,同非靶向性制剂相比,靶向脂质体在耐药性癌细胞中摄取最多。因此,制备的靶向性舒尼替尼与长春瑞滨脂质体是-种新的靶向制剂,能够被耐药乳腺癌细胞靶向性摄取,可在体外显著抑制耐药性乳腺癌生长,从而为耐药乳腺癌的化学治疗提供了-种新的策略。     

Induction of thymidylate synthase associated with multidrug resistance in human breast and colon cancer cell lines.

A series of Adriamycin-resistant human breast MCF-7 and human colon DLD-1 cancer cell lines were established by stepwise selection. The concentration of Adriamycin required to inhibit cell proliferation by 50% (IC50) in the parent breast line (MCF-7), Adriamycin-resistant lines (MCF-Ad5 and MCF-Ad10), and a 5-fluorouracil (5-FU)-revertant line (MCF-R) was 0.005, 3.3, 6, and 4.9 microM, respectively. The Adriamycin IC50 value for the resistant colon line (DLD-Ad) was 8.2 microM, 68-fold higher than that for its parent line (DLD-1) (IC50 = 0.12 microM). The MCF-Ad5 and MCF-Ad10 cells were cross-resistant to 5-FU, with respective 5-FU IC50 values of 11.7 and 22.5 microM, or 7.3- and 14-fold less sensitive than their parent MCF-7 (IC50 = 1.6 microM) line. The MCF-R line completely reverted in sensitivity to 5-FU, with an IC50 of 1.7 microM. The resistant DLD-Ad line was 3.5-fold more resistant to 5-FU than was the parent DLD-1 line. Using both the 5-fluoro-2'-deoxyuridine-5'-monophosphate binding and catalytic assays for measurement of thymidylate synthase (TS) activity, there was significantly increased TS activity in the resistant MCF-Ad5 (2.4- and 2.5-fold), MCF-Ad10 (11.5- and 6.8-fold), and DLD-Ad (4.8- and 10.7-fold) lines, for binding and catalytic assays, respectively, compared with their parent MCF-7 and DLD-1 lines. The level of TS in cytosolic extracts, as determined by Western immunoblot analysis, was markedly increased for the resistant MCF-Ad5 (31-fold), MCF-Ad10 (46-fold), and DLD-Ad (52-fold) cells. Measurement of TS mRNA levels by Northern analysis revealed elevation of TS mRNA in the resistant MCF-AD5 (16.7-fold), MCF-Ad10 (31-fold), and DLD-Ad (55-fold) cells. Southern analysis showed that this increase in TS mRNA was not accompanied by any major rearrangements or amplification of the TS gene. Incorporation of 5-FU into the RNA and DNA of the resistant MCF-Ad10 cells was not significantly different, compared with that for parent MCF-7 cells. These studies suggest that exposure of human breast and human colon cancer cells to Adriamycin leads to overexpression of TS, with concomitant development of resistance to 5-FU.     

甲基莲心碱对耐阿霉素人乳腺癌细胞内阿霉素积累的影响

目的　研究甲基莲心碱 (Nef)对耐阿霉素人乳腺癌细胞MCF 7/Adr内阿霉素 (ADM )积累的影响。方法　MTT法检测Nef对多药耐药性 (MDR)的逆转作用 ,高效液相色谱 (HPLC)法检测细胞内阿霉素浓度。结果　Nef能降低阿霉素对MCF 7/Adr细胞IC50 值 ,能提高MCF 7/Adr细胞内ADM的浓度。结论　Nef逆转MCF 7/Adr细胞多药耐药的机制与其增加多药耐药细胞内抗癌药物积累有关。     

双苄基异喹啉类生物碱粉防己碱与小檗胺逆转多药抗药性的比较研究

比较了2种结构相近的双苄基异喹啉(BBI)生物碱粉防己碱(TTD)、小檗胺(BBM)与维拉帕米(VRP)逆转多药抗药性的作用。结果,TTD,BBM和VRP在多药抗药的MCF-7/Adr和KBv₂₀₀细胞对ADR和VCR均有明显增敏作用,且作用呈剂量依赖性。其中10μmol·L^-1TTD能完全逆转MCF-7/Adr细胞对ADR的抗药性。TTD,BBM和VRP均有增加MCF-7/Adr细胞内阿霉素积累的作用。TTD和BBM在结构上仅有微小差别,但TTD的逆转MDR作用优于VRP10倍,而BBM的作用与VRP相仿。TTD在裸鼠体内MCF-7/Adr实体瘤模型上也证实有明显逆转ADR抗药性的作用。     

三种双苄基异喹啉生物碱调节多药耐药性的作用及与维拉帕米的比较

目的：比较轮环藤碱（Ｃｙｃ）、海岛轮环藤碱（Ｉｎｓｒ）和海岛轮环藤酚碱（Ｉｎｓｎ）与维拉帕米（Ｖｅｒ）体外调节多药耐药性（ＭＤＲ）的作用。方法：细胞毒试验采用ＭＴＴ法，细胞内阿霉素（Ｄｏｘ）积累采用荧光分光光度法测定。结果：Ｃｙｃ，Ｉｎｓｒ，Ｉｎｓｎ和Ｖｅｒ在分光光度法测定。结果：Ｃｙｃ，Ｉｎｓｒ，Ｉｎｓｎ和Ｖｅｒ在ＭＤＲ细胞系ＭＣＦ－７／Ａｄｒ和ＫＢｖ２００能显著调节Ｄｏｘ和长春新碱的耐药性具有     

N-糖基取代的邻苯二甲酰亚胺新衍生物的合成与肿瘤多药耐药逆转作用研究

沙利度胺（α-N-phthalimido-glutarimide，TLD）是一种具有抗血管生成和抗炎作用的药物，对多种实体瘤有效。本文研究了N-糖基取代的沙利度胺新衍生物（STA-35）对阿霉素（doxorubicin，ADR）引起的多药耐药（multidurg resistance，MDR）的调节作用。采用SRB法检测化合物对癌细胞的增殖抑制作用，应用流式细胞术测定P-糖蛋白（P-glycoprotein，P—gp）的功能，以免疫印迹方法考察P—gP的蛋白表达。实验结果表明，STA-35能够抑制人乳腺癌细胞MCF-7及其ADR耐药细胞MCF-7／ADR生长，耐药指数仅为1．19；并能增强MCF-7／ADR细胞对ADR的敏感性。此外，STA-35可以增加MCF-7／ADR细胞内罗丹明123（rhodamine 123，RH123）的聚积，减弱P—gP的功能，抑制P-gp的蛋白表达。该化合物具有多药耐药逆转作用，其分子机制可能与抑制P—gp的功能和蛋白表达相关。