重型肝炎病人中乙型肝炎病毒C基因变异研究

通过对１１例重型肝炎病人中扩增的ＨＢＶＤＮＡ直了列分析,研究重型肝炎病人中ＨＢＶ Ｃ基因的变异及其特点,每个病例的ＨＢＶＣ基因均有数量不等的变异,产生１－１２个氨基酸替代。慢性重型肝炎病人的ＨＢＶ Ｃ基因 明显多于亚急性重型肝炎病人。     

HBsAg阴性应招飞行学员血清HBV-DNA检测研究

目的为控制ＨＢＶ慢性携带者进入航校提供对策，对应招飞行学员中ＨＢｓＡｇ阴性者的ＨＢＶ感染情况及对ＨＢＶ的免疫状态作一探讨。方法用ＥＬＩＳＡ法检测ＨＢｓＡｇ、抗－ＨＢｓ、抗－ＨＢｃ、ＨＢｅＡｇ、抗－ＨＢｅ，用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测ＨＢＶ－ＤＮＡ。结果ＨＢｓＡｇ阴性应招飞行学员中抗－ＨＢｓ阳性２０６／９６２例（２７．６％），抗ＨＢｃ阳性２２９／９６２例（２２．８％），ＨＢｅＡｇ阳性０／４５０例，抗ＨＢｅ阳性３／４５０例（０．６７％），ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性１５／２２８例（６．６％）。ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性主要集中在单一抗ＨＢｃ阳性者中１４／７５例（１８．７％）。获得ＨＢＶ免疫者为３４．０％。结论在应招飞行学员中对单一抗ＨＢｃ阳性者应做ＨＢＶ－ＤＮＡ检测，未获ＨＢＶ免疫者应接种乙肝疫苗     

用PCR及Southern杂交方法对HBsAg阴性献血员HBV感染的检测

用ＰＣＲ与Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交（ＳＢＨ）方法对７８例ＨＢｓＡｇ阴性献血员进行ＨＢＶ感染检测，结果２份标本经ＰＣＲ后直接在２５４ｎｍ紫外灯下观察就可见到特异扩增带，另有１２份标本经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转膜杂交后可观察到特异扩增带，总阳性率较原来ＨＢｓＡｇ检测提高１７．９％，说明ＰＣＲ－ＳＢＨ可以区分ＨＢｓＡｇ阴性但仍然存在ＨＢＶ潜伏感染的献血员，使用ＰＣＲ－ＳＢＨ方法检测的ＨＢＶ可以提高输血的安全性。     

受体导向药物L－HSA－AraAMP体外抗病毒效应的实验研究

以乙肝病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ转染的细胞株２．２．１５细胞培养上清液中ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ滴度及细胞内ＨＢＶＤＮＡ中间体的变化作为药物评价指标，应用四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）比色分析法测定细胞毒性。结果表明：乳糖化人血清白蛋白单磷酸阿糖腺苷（Ｌ－ＨＳＡ－ＡｒａＡＭＰ简称交联物）与ＡｒａＡＭＰ具有相似的抗病毒效应。二者对ＨＢｓＡｇ最高抑制率分别为５０％，６３％，对ＨＢｅＡｓ最高抑制率分别为６２．６％，６７．２％，５００μｇ／ｍｌ交联物与１００μｇ／ｍＩＡｒａＡＭＰ对ＨＢＶＤＮＡ有相似的抑制作用。交联物无明显细胞毒性（ＣＤ５０＞２０００μｇ／ｍｌ），ＡｒａＡＭＰ有明显细胞毒性（ＣＤ为６５８．５±１８０μｇ／ｍｌ），对ＨＢｅＡｇ抑制的选择指数分别为＞４．８，１．７。展示了受体导向抗病毒药物的良好前景。     

受体导向药物L—HSA—AraAMP体外抗病毒效应的实验研究

以乙肝毒ＤＮＡ转染的细胞株２．２．１５细胞培养上清液中ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ滴度及细胞内ＨＢＶＤＮＡ中间体的变化作为药物评价指标，应用四甲基偶氮唑盐比色分析法测定细胞毒。     

慢性乙型肝炎表面抗原携带者前S1基因的高度异质性

应用半巢式聚合酶链式反应（ＰＣＲ）从一例慢性ＨＢｓＡｇ携带者血清中扩增出ＨＢＶ前Ｓ１基因，将其克隆于噬菌体Ｍ１３ｍｐ１９中进行序列分析。结果发现：与同源性最好的ＨＢＶａｄｒ野生林相比，所测的１０个克隆均有替代和插入突变，９个克隆有缺失突变，１０个克隆的核苷酸变异率为５．０％－１７．０％，氨基酸的变异率为１３．０－６０．０％；１０个克隆之间的核苷酸变异率为２．３％－２４．３％，氨基酸的变异率为１４．     

西安地区不同背景人群输血传播病毒感染状态初步调查

１９９７年１０月Ｎｉｓｈｉｚａｗａ等〔１〕首次报道分离出新型肝炎相关病毒,暂命名为输血传播病毒（ＴＴＶ）。本研究报道了西安地区不同人群ＴＴＶ基因的检测结果。检测对象为西安地区来我院的职业献血员,共２０８例,男６４例,女１４４例,年龄４０～８３岁,经查体后３１例ＡＬＴ升高（４０Ｕ／Ｌ以上）,７例抗－ＨＢｃ阳性,１例抗－ＨＢｅ阳性,１例ＨＢｅＡｇ阳性,５例抗－ＨＣＶ阳性,其余ＨＢＶＭ５项、抗－ＨＣＶ、抗－ＨＩＶ均为阴性。血液透析患者３０例,男１７例,女１３例,年龄２３～７７岁,ＡＬＴ异常升高８例,抗…     

反义核酸抑制荷瘤裸鼠乙肝病毒基因表达

应用２．２．１５细胞转种裸鼠，建立荷瘤裸鼠ＨＢＶ动物模型。受种裸鼠皮下可迅速长出移植瘤并分泌ＨＢＶ多项标志物至外周血液中。应用互补于ＨＢＶｍＲＮＡ ＳＰⅡ增强子区的１５聚反义硫代寡核苷酸以２０ｕｇ／ｇ鼠体重剂量连续治疗１０ｄ，结果治疗组荷瘤裸鼠血清中ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及ＨＢＶ－ＤＮＡ均受到明显抑制。证明该反义核酸在动物体内同样具有良好的抗病毒效应，为从基因水平研制新一代抗乙肝病毒药物奠定了基础     

HAV,HBV重叠感染34例分析

本文回顾了３４例ＨＡＶ和ＨＢＶ重叠感染者的临床经过和ＨＢＶ血清标志物改变。发现其甲肝的整个临床过程基本与一般甲肝一致；与ＨＡＶ感染前比较，ＨＡＶ感染恢复后１～２个月时ＨＢＶ血清标志物的阳性率（除ＨＢｓＡｇ和拉ＨＢｓ外）发生了明显改变：ＨＢｅＡｇ由７５％减至３５．３％，拉ＨＢｃ由８５．７％减至４１．２％，三项阳性者由６４．３％减至３５．３％，拉ＨＢｅ由３９．３％增至７６．５％，拉ＨＢｃ－ＩｇＭ由５４．３％减至２６．５％（均为Ｐ＜０．０１）。     

乙型肝炎病毒S基因插入和点突变株感染及其血清学特征

为探讨乙型肝炎病毒感染血清学不典型表现的分子病毒学基础,用聚合酶链反应产物直接序列分析测定中国人感染的ＨＢＶ Ｓ基因核苷酸序列。结果发现：１５例ＨＢｓＡｇ阴性ＨＢＶ感染者中,１例第５５２位碱基胸腺嘧啶被胞嘧啶,导致ＨＢｓＡｇ第１３３位蛋氨酸被氨酸替代;３例第５４６位碱基Ｃ被Ｔ替换,导致ＨＢｓＡｇ第１３１位苏氨酸被异亮氨酸替代。     

家庭内乙型肝炎病毒变异株感染的分子病毒学调查

为分析乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）家庭内聚集感染病例的ＨＢＶ变异特点，我们对１０个家庭２５例ＨＢＶ感染者进行了分子病毒学研究，均用单链构型多态性分析（ＳＳＣＰ）ＨＢＶ外膜基因“ａ”决定簇片段的变异，ＰＣＲ－限制性片断长度多态性分析，分析ＨＢＶ前Ｃ区终码变异。结果与用聚合酶链反应（ＰＣＲ）产物直接序列分析测定的４个家庭有、无ＨＢＶ变异株感染的外膜基因序列和前Ｃ基因序列比较，从分子水平鉴定ＨＢＶ家庭内传播，同时建立了ＳＳＣＰ检测ＨＢＶ免疫逃避变异株的方法。     

乙型肝炎病毒前C/C区及其调控基因变异的研究

目的研究慢性乙型肝炎病人中HBVpreC/C基因及其调控序列的变异和特点。方法对42例慢性乙型肝炎病人中扩增的HBVDNA各3个克隆进行序列分析。结果42例病人,HBVC基因调控序列发生T1762A1764双突变者20例,其中HBeAg阳性者7例,HBeAg阴性者13例(P<005);22例发生T1673G1799双突变。前C变异中,18例发生A1896变异,其中HBeAg阳性者6例,HBeAg阴性者12例(P<0.05)。C区变异中,AA5、AA38、AA60、AA87、AA97、AA130、AA135都是变异的热点。前C/C区还存在有插入、缺失等不同变异。结论慢性乙型肝炎病人的HBVC基因及其调控序列变异具有多样性及复杂性,与体内的免疫清除与病毒逃避免疫攻击相关,从而容易导致疾病的慢性化。     

HBV信号肽区热点变异真核表达载体的构建及对HBeAg表达的影响

采用分子生物学方法,设计引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增HBV的Pre－C／C片段（1814－2452）,经酶切后连于EBO真核表达载体,利用定点突变技术分别对连接载体进行了T1862,A1896,A189,A1896＋A1899点的定点诱变。经错配PCR－RFLP和测序, 克隆。将突变前后的质粒以脂质体转染法转染HepG2细胞,检测不同点突变后HBeAg表达的改变,突变前后质粒转染HepG2细胞经稳定表达,结果未突变的EBO－PreC/C重组质粒HBeAg表达为强阳性,A1899突变的重组质粒HBeAg表达比未突变的重组质粒稍弱,而转染EBO空载体和T1862,A1896,A1986＋A1899重组质粒突变体的细胞培养上清HBeAg均为阴性,上述体的构建将为体外研究前C信号肽区热点变异对HBeAg在细胞中表达及对肝炎病毒基因组复制的影响奠定基础。     

慢性乙型肝炎血清学标志、HBV DNA定量分析及HBV前C/C变异的临床研究

目的 :探讨慢性乙型肝炎患者血清学标志、HBVDNA载量及HBV前C/C变异与临床病变的关系。方法 :随机选取慢性乙型肝炎患者 2 4 6例 ,其中轻度 10 2例、中度 88例、重度 5 6例 ,分别应用ELISA、实时PCR法检测其血清中的HBV免疫学标志及HBVDNA含量。同时对HBeAg阴性而HBVDNA含量高拷贝的 3例轻度、6例中度及 8例重度患者血清 ,应用巢式PCR方法分离前C/C区全长基因 ,纯化后克隆入T载体 ,鉴定后进行序列测定。结果 :10 2例轻度、88例中度及 5 6例重度患者中血清学标志HBsAg ,HBeAg,抗 -HBc阳性模式分别为 5 3例 (5 1.9% )、4 6例(5 2 .3% )、33例 (5 8.9% ) ;HBsAg ,抗 -HBe,抗 -HBc阳性模式分别为 37例 (36 .3% )、32例 (37.5 % )、2 1例 (37.5 % ) ;单独HBsAg阳性为 8例 (7.8% )、5例 (5 .6 % )、1例 (1.7% ) ;其他模式分别为 4例、5例、1例。HBVDNA含量平均值分别为 10E 5 .5 3拷贝 /ml、10E 6 .0 3拷贝 /ml、10E 6 .5 8拷贝 /ml。HBeAg阴性而HBVDNA含量 >10E 6拷贝 /ml的病例数分别为 3例、6例、8例。统计分析表明 ,轻、中、重慢性乙肝患者间血清学标志及HBVDNA含量差异均不具统计学意义 ,而HBeAg阴性HBVDNA含量高拷贝的患者出现频率差异具有统计学意义。序列测定结果显示 17例患者血清的HBV分离株的前C/C     

乙型肝炎患者血清HBV前C区A1896变异的检测分析

目的了解HBsAg(+)/HBcAb(+)/HBeAb(+)的慢性乙肝病人血清乙肝病毒(HBV)DNA前C区A1896的变异情况及其与临床关系。方法对所有试验对象检测肝功能指标,根据检测结果分为丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高组和ALT正常组。用聚合酶链反应杂交(PCR-ELISA)定量检测HBV-DNA并进一步检测HBV前C区A1896位点的变异情况。结果 38例患者中有18例HBV-DNA阳性,其中15例发生A1896位点变异,变异率为83.3%(15/18)。ALT升高组的18例中,血清HBV-DNA阳性13例,阳性率72.2%,平均浓度为9.62×106(1.10×103～1.09×108)拷贝/ml,A1896变异13例,变异率为100%(13/13)。ALT正常组的20例中,HBV-DNA阳性5例,阳性率25.00%,平均浓度2.55×104(3.28×103～4.61×104)拷贝/ml。A1896变异2例,变异率为40%(2/5)。两组比较无论在HBV-DNA阳性率,还是A1896位变异率都具有统计学差异(P<0.05)。结论 HBsAg(+)/HBcAb(+)/HBeAb(+)的慢性乙肝患者存在较高的A1896变异率,ALT升高组HBV-DNA阳性率和变异率均高于ALT正常组(P<0.05),提示HBV A1896位点变异与肝脏病变活动加重和ALT升高有关。     

DNA序列测定法与实时荧光PCR法检测YMDD突变结果的比较

目的比较DNA序列测定法与实时荧光法检测YMDD突变的结果,并对除YMDD突变之外的耐药相关基因突变及其意义进行讨论。方法收集89例慢性乙肝患者的92份血清样本,均用实时荧光PCR法做YMDD突变检测。采用巢式PCR法扩增HBV反转录酶(RT)基因,对PCR产物进行DNA双向测序,采用NTI软件比对结果,并对RT基因上其他11个已知耐药相关突变位点进行分析。结果在37份YMDD突变阴性的样本中,DNA测序法检测结果为33份M204M(未突变)、1份M204I、3份M204V;4份YMDD突变阳性样本均为突变/未突变序列共存;另检出7份样本存在ADV耐药相关突变,占18.9%(7/37)。在55份YMDD突变阳性样本中,DNA测序法检测到52份,阳性结果符合率为94.5%(52/55);另检出5例存在ADV或ETV耐药相关突变,占9.1%(5/55)。结论DNA序列测定法检测HBVRT基因耐药相关突变敏感性高,重复性好,与实时荧光PCR方法的检测结果有较高的符合率,可同时检出YMDD突变以外的各种耐药相关突变,有助于临床全面了解患者对核苷(酸)类似物的耐药情况,合理地制订抗HBV治疗方案。     

血清HBsAg阴性和HBsAg阳性慢性活动性肝炎患者肝内HBV DNA的研究

用原位杂交法和ABG法对慢性活动性肝炎患者(以下称CAH)血清HBsAg阴性34例和阳性30例对比进行了肝内HBV DNA、HBcAg和HBsAg的检测。上述检出率在34例HBsAg阴性CAH者中分别为23.5％,23.5％和32.4％,30例HBsAg阳性者中分别为63.3％、56.7％和83.3％。结果表明,在我国,血清HBsAg阴性、HBV相关抗体阳性或阴性的CAH中,仍有少部分人肝内存在HBV DNA和HBV抗原表达,并与肝病发病机理有关。血清HBsAg阳性的CAH者中,无论血清HBeAg阳性,或抗HBe阳性、或HBeAg阴性,均有较高比例的肝内HBV DNA和HBV抗原检出。肝内HBcAg与肝内HBV DNA关系密切,可作为反映HBV活跃复制指标;肝内HBsAg则不然。     

乙型肝炎病毒序列准种个体化特征的研究

以乙型肝炎病毒（HBV）多聚酶（P）逆转录酶（RT）区及表面抗原（HBsAg)主蛋白、e抗原（HBeAg)氨基酸序列异质性来探讨HBV准种群在感染个体中的变异特点。应用多聚酶链反应（PCR）方法自8例慢性HBV患者血清中扩增靶基因，克隆入T载体，随机挑选27株克隆测序，将获得基因的推断氨基酸序列进行比较后发现：病毒结构／非结构蛋白氨基酸序列存在广泛的变异现象，替换突变表现出一定的个体特异性，其结果是导致HBV在特定的患者体内可能存在特征性的变异。本研究提示HBV在患者体内的蛋白序列多样性是乙型肝炎慢性化的一个重要原因。